Her presenterer vi for å oppdage forbindelser aktiv ved GABAA reseptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi.
Dette manuskriptet presenterer en trinnvis protokoll for screening forbindelser på gamma-aminobutyric acid skriver en (GABAA) reseptorer og bruk mot identifikasjon av romanen molekyler i preklinisk analyser fra en i vitro rekombinant reseptor å deres farmakologiske effekter på innfødt reseptorer i gnager hjernen skiver. For forbindelser bindende på benzodiazepiner stedet reseptoren, er det første trinnet å sette opp en primære skjerm som består av å utvikle radioligand binding analyser på cellemembraner uttrykke store GABAA subtyper. Deretter benytte seg av heterologous uttrykk for gnager og menneskelig GABAA reseptorer i Xenopus oocytes eller HEK 293 celler, er det mulig å utforske, i elektrofysiologiske analyser, fysiologiske egenskapene til ulike reseptoren subtyper og Farmakologiske egenskaper av de identifiserte forbindelsene. Xenopus oocyte systemet vil bli presentert her starter med isolering av oocytes og deres microinjection med forskjellige mRNAs, til farmakologisk karakterisering ved hjelp av to elektrode spenning klemmer. Til slutt, opptak i gnager hjernen skiver beskrives som brukes som en sekundær fysiologiske test for å vurdere aktiviteten til molekyler på deres opprinnelige reseptorer i en veldefinert neuronal krets. Ekstracellulære innspillinger med befolkningen svar flere neurons er vist med narkotika-program.
Her presenterer vi protokoller for oppdagelsen av forbindelser aktive på GABAA reseptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi. I søk for romanen molekyler gjelder GABAA reseptorer, er det avgjørende å definere, så nøyaktig som mulig, undertypen av interesse og vurdering av spesifisitet av nylig identifisert forbindelser (f.eksfor gjennomgang, se Rudolph og Knoflach1eller Sieghart2). En typisk bane i stoffet funnet og trinnene som må oppnås er illustrert i figur 1.
Bindende analyser har vært og er fortsatt i stor grad brukes som første trinn i stoffet funnet. Ved GABAA reseptorer, er de optimalisert for å identifisere forbindelser som binder til benzodiazepiner binding området av reseptoren der terapeutisk nyttig og pengeskap narkotika binde. Andre teknikker, bruk fluorometric tenkelig plate leseren (FLIPR) membran potensielle røde fargebasert analyser3, oppdage forbindelser som barbiturater som binder seg til andre områder som er mindre ønskelig på grunn av deres uønsket side-effekt-profil. I tillegg kan de utnyttet fargestoffer direkte aktivere GABAA -reseptorer problematiserer dermed nytten av disse analyser for drug discovery4. Bindende analyser kan bare gi bevis for at en gitt sammensatt kan binde til en bestemt klasse. In vitro analyser med cellemembraner brukes til å identifisere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 reseptor ligander. Transiently transfekterte HEK293 celler uttrykke den menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 reseptorer brukes til å forberede membraner disse analyser. Effekten av ligander oppdages ved å måle scintillation av [3H] flumazenil bundet til membran reseptorer (en hemming av [3H] flumazenil binding). Den største fordelen med denne teknikken er at en rask og effektiv fastsettelse av den sammensatte-forpliktende tilhørighet på reseptoren rundt tilbys på reseptoren av interesse.
Funksjonell studier er viktig å vurdere den funksjonelle aktiviteten av forbindelser og å foreslå en fysiologiske og farmakologiske forklaring av mekanismer forårsaket av binding av forbindelsene til receptors. I dag er det anerkjente at funksjonelle GABAA reseptorer resultere fra monteringen av fem underenheter rundt en akse av pseudosymmetry dannet av ionisk pore og resultat fra samlingen av fem identiske underenheter. De fleste av GABAA reseptorer består av to eller flere forskjellige underenheter. Stor hjerne GABAA reseptoren, for eksempel består av α1, β2 og γ2 underenheter i en støkiometri av 2, 2 og 1 henholdsvis5,6. En rekonstituering i et vertssystem som Xenopus oocytes eller HEK293 celler tilbyr muligheten til raskt å utforske de farmakologiske egenskapene av reseptorer.
Farmakologiske egenskaper av forbindelser er deretter undersøkt med ekstracellulære innspillinger i hjernen skiver7. Denne metoden tillater en utforskning av effekten av forbindelser på neurotransmission og gir en effektiv måte å bekrefte funksjonelle virkningene av forbindelser i heterologous uttrykk systemer på nivået av innfødte reseptorer i samlet neuronal miljø. GABAergic neurotransmission kan også vurderes på molekylært nivå ved å måle effekten av forbindelser på hemmende postsynaptic strøm (IPSCs)8. Men protokollen brukes her og basert på hele celle oppdateringen klemme opptak i hjernen skiver er mer forseggjort og gir en lavere gjennomstrømning.
Til slutt, styrker og svakheter for vitro screening gjennomgripende brukes for identifikasjon av α5β3γ2-selektiv ligander diskuteres i perspektiv av ulike teknikker og deres iboende begrensninger. Dette arbeidet bør gi eksperter og ikke-eksperter innen GABAA reseptorer en nyttig gjennomgang av kombinasjonen av ulike i vitro tilnærminger brukt å takle oppdagelsen av nye modulatorer disse ligand-gated ion kanaler.
Utviklingen av romanen forbindelser aktive på en ligand-gated ion kanal som GABAA receptors krever bruk av flere metoder. Vanligvis er første skritt ofte utført med bindende analyser; men er slike målinger utilstrekkelige for å karakterisere fysiologiske aktiviteten til sammensatt eller sin presise farmakologi. Spesielt en forbindelse som binder seg til en reseptor kan forbedre eller hemme funksjonen eller selv produsere ingen funksjonell effekt (være stille) (dvs., binder seg til reseptoren uten å endre dens funksjon). Dermed kreves en funksjonell test for full sammensatte karakteristikk.
Bindende analyser:
Den største fordelen med bindende analysen er at det kan bli effektivt gjennomført på en rekke prøver opp til flere tusen, og at det gir bindende slektskap for den aktive molekyler. Som beskrevet her, består det første trinnet for å etablere en metode for vurdering av ønsket reseptor subtyper. Nemlig, mens binding kan gjennomføres på innfødt reseptorer brøker eller hele hjernen, slik metode vil hindre fastsettelse av slektskap på bestemte reseptor undertyper. Det er derfor nødvendig å bruke rekombinant systemer til skjermen molekyler på ønsket målet. I dag, tilbyr en forbigående eller stabil transfection av ønsket reseptor delenhet cDNAs i cellelinjer en effektiv og pålitelig metode for å uttrykke reseptor subtyper av interesse (f.eks, GABAA α5β3γ2). Tradisjonelle bindende analyser gjør bruk av radioligands, men i dag teknikker er tilgjengelig som unngå ulempen ved håndtering av radioaktivitet (f.eks, kvantitativ fluorescens-baserte ligand-bindende).
Funksjonelle uttrykk i et vertssystem:
For å uttrykke genene i et vertssystem, må koding sekvensen rundt settes inn i en plasmider som inneholder de tilstrekkelig promoterere. Vanligvis for i vitro mRNA syntese brukes bakteriell T7 eller T6 promoterere. For en cDNA uttrykk, må transkripsjon av genet av interesse være regulert av en eukaryoter utbyggeren som CMV (cytomegalovirus) eller tilsvarende. I dag, er flere plasmider, inkludert de to promoterere (dvs., pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA) tilgjengelig slik at enten en i vitro syntese av mRNA eller et cDNA uttrykk som vist i Figur 15. Et uttrykk av GABAA reseptorer kan fås trofast i cellelinjer eller i Xenopus oocytes. De viktigste fordelene med sistnevnte er mangelen på en endogen reseptor uttrykk, enkelheten av manipulasjoner og tilgjengeligheten av et automatisert system for mikro-injeksjoner og opptak. Fremgangsmåtene i denne protokollen illustrerer effektiviteten av automatiserte system som kan injeksjon av 96 oocytes i ca 7 minutter og krever ingen micromanipulation ferdigheter. Husker at en enkelt eggstokk fra en Xenopus inneholder mellom 10000-30000 oocytes, er det klart at mange celle målinger kan gjennomføres på en enkelt forberedelse. Videre, som et uttrykk kan gjennomføres bruke cDNA injeksjoner, samme plasmider inneholder gener av interesse som er utviklet for bindingen eksperimenter kan brukes for funksjonell karakteristikk uten behov for ytterligere molekylærbiologi manipulasjoner.
Gitt sin store størrelse og høy overflate uttrykk, gir en enkelt oocyte en rekke reseptorer som omtrent tilsvarer confluent cellene i 35 mm Petriskål. Men representerer en oocytes forberedelse og injeksjon en brøkdel av kostnaden for en celle linje, som eksperimenter ikke krever en bestemt kultur medium og sterile manipulasjoner. Aktivering av én GABAA kanal gir noen picoamperes (10-12) og strømmer alt i titalls microampere (10-6) er lett registreres i en enkelt oocyte, som bekrefter samtidig aktiviteten til flere millioner av reseptorer i et enkelt svar.
Et første skritt i karakterisering av ligand-gated ionekanaler er ofte fastsettelse av tilsynelatende affinitet av reseptorer. Eksperimenter som må gjennomføres består av å bruke en rekke kort Agonistiske test pulser og plotte amplituden til den vakte gjeldende eller, i enkelte tilfeller området under kurven (AUC) som en funksjon av logaritmen av Agonistiske konsentrasjonen. Som det er lett mulig å microinject ulike plasmider konsentrasjoner og forhold i den samme gruppen av oocytes, er denne uttrykket spesielt egnet for slike karakteristikk. Videre avslørte en parti til parti sammenligning en høy grad av stabilitet for ulike EF50s. Påvirkning av delenhet sammensetningen på reseptorens tilsynelatende affinitet er lett visualisert bruker en edderkopp tomten, som eksemplifisert i Figur 10.
Resultatene av to elektrode spenning klemmen innhentet i Xenopus oocytes er ofte sammenlignet med opptak gjort med oppdateringen klemme elektroder. Mens det ville gå utenfor omfanget av dette arbeidet å gå inn i en detaljert sammenligning mellom disse to systemene, kan noen punkter undersøkes. Mens en patch klemme i celler tilbyr fordeler for Biofysiske karakteristikk med en rask medikament programmet, er dens krav mer komplekse enn to elektrode opptak i Xenopus oocytes. Et første og ikke-ubetydelig problemer er uttrykk for en gitt protein med nødvendigheten av en cellekultur, en forbigående eller stabil transfection og identifikasjon av celler som uttrykker den ønskede konstruere. I tillegg er det uunnværlig å undersøke mulige bidrag av endogene uttrykket i regnes cellen. Videre krever en patch klemme innspilling en dyktig person til å utføre micromanipulation under en høy forstørrelse mikroskop, mens vedkommende må også utføre en tilstrekkelig analyse under å vurdere, for eksempel kvaliteten på selen, tilgang motstanden etc. derimot en to-elektrode spenning klemme opptak, spesielt en ved hjelp av et automatisk elektrofysiologiske system, krever ikke noen spesielle ferdigheter og kan bli utført av laboratorium teknikere.
Da anskaffe en elektrofysiologiske oppsett, er pris vurdering sikkert en viktig faktor som må analyseres nøye. For eksempel, mens kostnaden for et automatisert system er relativt høy, avslører en nærmere sammenligning at installasjon av en fullstendig elektrofysiologiske rigg inkluderer kjøpe utstyr som god micromanipulators, en kikkert linse, en forsterker, en system, og en anti-vibrasjon tabell samtidig henter og utfører en analyse. En pris sammenligning mellom en to elektrode spenning klemme satt opp mot en patch klemme oppsett avslører ytterligere avvik. Videre er det automatiserte systemet tilbyr fordelen av fullt automatisert utstyr og kjører uovervåket dag og natt.
Farmakologiske egenskaper av et sammensatt bestemmes av modus for action på reseptoren. For eksempel er konkurrerende hemmere molekyler som kan angi samme binding lomme eller orthosteric området, som agonist selv forårsaker en konkurranse. Ikke-konkurrerende hemmere er forbindelser som hemmer receptors ved å kommunisere på et annet område og, i tilfellet en ligand-gated ion kanal, kan angi og blokkere ioniske pore, for eksempel. Det ville gå utenfor omfanget av dette arbeidet å undersøke ulike mekanismer for samhandling, men ytterligere informasjon kan fås fra en farmakologisk lærebok og/eller fra annet arbeid som Bertrand og Bertrand’s22.
Ved allosteric modulatorer endrer de sammensatte binder på et område som er forskjellig fra orthosteric området, men tilstedeværelsen av molekylet energien barrieren mellom aktive og andre statene. Positiv allosteric modulatorer (PAMs) er forbindelser som reduserer energien barrieren fra hvile til aktiv tilstand, og derfor forsterke effekten av Agonistiske. Betegner mulig PAM effekter, er det derfor nødvendig for å fastslå om en eksponering til sammensatt forbedrer svaret Agonistiske og hvis så, på hvilke konsentrasjon. Eksperimenter i Figur 11 og figur 14 illustrerer protokoller som kan brukes med hell for karakterisering av PAMs på GABAA receptors.
I noen tilfeller kan eksponering til PAM alene være nok å aktivere receptors. Slik aktivitet kan bestemmes av en liten endring av eksperimentelle protokollen presenteres her. Nemlig, i stedet for en co-anvendelse av modulator under eksponeringen av GABA, protokollen kan endres for anvendelse av første sammensatte alene og i nærvær av GABA. Karakteristikk av direkte Agonistiske aktiviteten vil bli gjort ved fastsettelse av amplituden til svaret fremkalt av sammensatt selv og i forhold til gjeldende GABA-fremkalt.
Eksperimenter utført i hjernen skiver, som illustrert i figur 7brukes til å bekrefte sammensatte aktiviteten på innfødt reseptorer i en bestemt hemmende krets før du går videre i dyremodeller og langs veien mot kliniske studier. Relativt enkle data innspillingen og analyse protokollen tillater at rangeringen av flere forbindelser ved å evaluere deres differensial modulatory effekt på PS amplitude. Non-spesifikke effekter av forbindelser som ikke er relatert til GABA systemet kan også være oppdaget (f.eksnår endringer i PS figuren er observert). Direkte, GABAergic neurotransmission kan vurderes i disse tilfellene ved å måle effekten av forbindelser på hemmende postsynaptic strøm (IPSCs) bruker hele-celle oppdateringen klemme teknikk8.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, og Marie Claire Pflimlin fra Roche og Tifany Schaer og Deborah Paolucci fra HiQScreen for deres utmerket kundestøtte.
General equipment | |||
96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
Smart Pull | UniPix | – | Electrode Puller |
RoboInject | MultiChannel Systems | – | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
HiClamp | MultiChannel Systems | – | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
DataMining | MultiChannel Systems | – | Data Analysis Software |
DataMerger | MultiChannel Systems | – | Data Processing Software |
Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
Plasticware | |||
Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
Shipping tubes 180ml | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
Pony vial Polyethylene 6ml | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | – | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
RNA preparation | |||
Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
Chemicals | |||
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. | Used for binding assay | ||
Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. | Used for binding assay | ||
Stock solution of test compounds 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Diazepam 4mM in DMSO | Used for binding assay | ||
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C | Used for binding assay | ||
Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
Membranes | |||
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |