Här presenterar vi protokoll för att upptäcka föreningar aktiva på GABAA -receptorer, från bindningen till fysiologi och farmakologi.
Detta manuskript presenterar ett stegvisa protokoll för screening föreningar på gamma-aminobutyric syra typ en (GABAA) receptorer och dess användning mot identifiering av nya molekyler verksamma i prekliniska analyser från en in vitro- rekombinant Remote-receptorn till deras farmakologiska effekter på infödda receptorer i gnagare hjärnan skivor. För föreningar bindande på webbplatsens bensodiazepin i receptorn, är det första steget att inrätta en primär skärm som består av framkallning radioligand bindande analyser på cellmembran som uttrycker de stora GABAA -undertyperna. Sedan, dra nytta av ett heterologt uttryck för gnagare och mänskliga GABAA -receptorer i Xenopus oocyter eller HEK 293 celler, är det möjligt att utforska, elektrofysiologiska analyser, fysiologiska egenskaper av olika receptorn subtyper och de farmakologiska egenskaperna hos de identifiera föreningarna. I Xenopus äggcellen systemet kommer att presenteras här, börjar med isolering av oocyterna och deras Mikroskop med olika mRNA, upp till farmakologiska karakterisering med två-elektrod spänning klämmor. Slutligen, inspelningar genomfördes i gnagare hjärnan skivor kommer att beskrivas som används som ett sekundärt fysiologiska test för att bedöma aktiviteten av molekyler på deras infödda receptorer i en väldefinierad neuronala krets. Extracellulära inspelningar med befolkningen Svaren av flera nervceller demonstreras tillsammans med ansökan om drogen.
Här presenterar vi protokoll för upptäckten av föreningar som är aktiva på GABAA -receptorer, från bindningen till fysiologi och farmakologi. I sökandet efter nya molekyler specifika för GABAA -receptorer, är det avgörande att definiera, så exakt som möjligt, subtyp av intresse och bedömningen av den särskilda karaktären hos de nyligen identifierade föreningarna (t.ex., för en genomgång, se Rudolph och Knoflach1eller Sieghart2). En typisk sökväg i läkemedelsutveckling och de steg som behöver uppnås illustreras i figur 1.
Bindande analyser har varit och är fortfarande till stor del används som ett första steg i läkemedelsutveckling. När det gäller GABAA -receptorer, är de optimerade för att identifiera substanser som binder till bindningsstället bensodiazepin av receptorn där terapeutiskt användbar och säkra läkemedel binder. Andra tekniker, använda fluorometric imaging plate reader (FLIPR) membran potentiella röda färgämnet-baserade analyser3, identifiera föreningar som barbiturater som binder till ytterligare platser som är mindre önskvärt på grund av deras oönskade bieffekt profil. De utnyttja färgämnena kan dessutom direkt aktivera GABAA -receptorer, således ifrågasätta nyttan av dessa analyser för drug discovery4. Bindande analyser kan endast ge bevis för att en viss förening kan binda till en specifik receptor klass. In vitro- analyser med cellmembran används för att identifiera selektiv mänsklig GABAA α5β3γ2-receptorligander. Övergående transfekterade HEK293 celler som uttrycker de mänskliga GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 och α3β3γ2 receptorer används för att förbereda membran för dessa analyser. Effekten av liganderna identifieras genom att mäta scintillation av [3H] flumazenil bunden till membranreceptorer (en hämning av [3H] flumazenil bindande). Den största fördelen med denna teknik är att en snabb och effektiv bestämning av det förening-affinitet på receptorn av intresse tillhandahålls på receptorn av intresse.
Funktionella studier är viktigt att utvärdera den funktionella aktiviteten av föreningar och föreslå en fysiologiska och farmakologiska förklaring av de mekanismer som orsakas av bindningen av föreningarna till receptorerna. Idag är det välkänt att funktionell GABAA -receptorer leder från montering av fem subenheter runt en axel av pseudosymmetry bildas av Joniska pore och resultatet från montering av fem identiska subenheter. De flesta av GABAA receptorerna består av två eller flera olika subenheter. Den stora hjärnan GABAA -receptorn, exempelvis består av α1, β2 och γ2 subunitsna i en stökiometri av 2, 2 och 1 respektive5,6. En beredning i ett värdsystem som Xenopus oocyter eller HEK293 celler erbjuder möjligheten att snabbt utforska de farmakologiska egenskaperna hos receptorerna.
De farmakologiska egenskaperna hos föreningarna utforskas sedan med extracellulära inspelningar i hjärnan skivor7. Denna metod tillåter en utforskning av effekten av föreningar på neurotransmission och ger ett effektivt sätt att bekräfta de funktionella effekterna av de föreningar som bestäms i heterologa uttryck system på nivå av infödda receptorer i totalt neuronala miljö. GABAergic neurotransmission kan också bedömas på molekylär nivå genom att mäta effekterna av föreningarna på hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs)8. Men protokollet används här och baserat på hela-cell patch clamp inspelningar i hjärnan skivor är mer genomarbetade och ger en lägre genomströmning.
Slutligen diskuteras styrkor och svagheter i vitro screening cascade används för identifiering av α5β3γ2-selektiv ligander i perspektivet av de olika teknikerna och deras inneboende begränsningar. Detta arbete bör ge och icke-experter på fältet av GABAA -receptorer som en trevlig recension av kombinationen av olika in vitro- metoder används för att ta itu med upptäckten av nya modulatorer av dessa ligandreglerade jonkanaler.
Utvecklingen av nya föreningar aktiva på en ligandreglerade jonkanal såsom GABAA receptorerna kräver användning av flera metoder. Vanligtvis utförs det första steget ofta med bindande analyser; sådana mätningar är dock otillräckliga för att karakterisera den fysiologiska aktiviteten av föreningen eller dess exakta farmakologi. I synnerhet en förening som binder till en receptor kan förbättra eller hämma dess funktion eller ens ge ingen funktionell effekt (tiga) (dvsbinda till receptorn utan att ändra dess funktion). Således krävs ett funktionellt test för en fullständig förening karakterisering.
Bindande analyser:
Den största fördelen med bindande analysen är att det kan genomföras effektivt på ett stort antal prover som sträcker sig upp till flera tusen och att det ger bindande tillhörigheter för de aktiva molekylerna. Som beskrivs häri, består det första steget av att fastställa en metod för bedömning av önskad receptor undertyper. Nämligen, medan bindning kan utföras på infödda receptorer från bråk eller hela hjärnor, sådan metod kommer att hindra fastställandet av tillhörighet på specifik receptor undertyper. Det är därför nödvändigt att använda rekombinant system till skärmen molekyler på det önskade målet. Nuförtiden, erbjuder en övergående eller stabil transfection av den önskade receptor subenhet cDNAs i cellinjer en effektiv och tillförlitlig metod för att uttrycka de receptor undertyperna av intresse (t.ex., GABAA α5β3γ2). Traditionella bindande analyser göra använda av radioligands, men nuförtiden tekniker är tillgängliga att undvika olägenhet för hantering av radioaktivitet (t.ex., kvantitativa fluorescens-baserade ligand-bindning).
Funktionella uttryck i ett värdsystem:
För att uttrycka gener i ett värdsystem, måste kodande sekvens av intresse införas i en plasmid som innehåller de adekvat promotorer. För in vitro- mRNA-syntesen används vanligtvis, de bakteriella T7 eller T6 promotorer. För ett cDNA uttryck måste transkriptionen av genen av intresse regleras av en Eukaryoter promotor såsom CMV (cytomegalovirus) eller motsvarande. Numera är flera plasmider, inklusive de två promotorer (dvs, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), tillgänglig så att antingen en in vitro- syntes av mRNA eller ett cDNA-uttryck som visas i figur 15. Ett uttryck för GABAA receptorerna kan erhållas troget i cellinjer eller i Xenopus oocyter. De främsta fördelarna med det senare är avsaknaden av endogena receptoruttryck, enkelheten i manipulationer och tillgängligheten av ett automatiserat system för mikro-injektioner och inspelningar. Procedurerna som beskrivs i detta protokoll illustrera effektiviteten i den automatiserade system som tillåter injektion av 96 oocyter i ca 7 min och kräver ingen mikromanipulation färdigheter. Att komma ihåg att en enda äggstock från en Xenopus innehåller mellan 10 000 – 30 000 oocyter, är det uppenbart att ett stort antal cell mätningar kan utföras på ett enda preparat. Dessutom som ett uttryck kan utföras med cDNA injektioner, kan de samma plasmider som innehåller generna av intresse som är utvecklade för de bindande experiment användas för en funktionell karakterisering utan behov av ytterligare molekylärbiologi manipulationer.
En enda äggcell med tanke på dess storlek och hög yta uttryck, och ger ett antal receptorer som motsvarar ungefär konfluenta cellerna i en 35 mm petriskål. Dock representerar en oocyter beredning och injektion en bråkdel av kostnaden för en cell fodrar, som experiment inte kräver en särskild odlingssubstrat och sterila manipulationer. Aktivering av en enda GABAA -kanal ger några picoamperes (10-12) och strömmar som sträcker sig upp till tiotals microampere (10-6) registreras enkelt i en enda äggcell, som bekräftar samtidig aktiviteten av flera miljoner receptorer under ett enda svar.
Ett första steg i karakterisering av ligandreglerade jonkanaler är ofta bestämning av uppenbara affinitet receptorer. De experiment som behöver genomföras består av tillämpa en rad korta agonist test pulser och plottning amplituden av den evoked nuvarande eller, i vissa fall arean under kurvan (AUC) som en funktion av logaritmen av agonist koncentrationen. Som det är lätt genomförbart att microinject olika plasmid koncentrationer och baserat i samma parti av oocyter, är detta system av uttryck särskilt lämpliga för sådan en karakterisering. Dessutom visade en sats till sats jämförelsen en hög grad av stabilitet för olika EC50s. Påverkan av subenhet sammansättningen på den receptorn uppenbar affinitet är lätt visualiseras med en spindel tomt, som exemplifieras i figur 10.
Resultaten av två-elektrod spänningen klämman erhållits i Xenopus oocyter jämförs ofta med inspelningar gjorda med patch clamp elektroder. Medan det skulle gå utanför ramen för detta arbete att gå in i en detaljerad jämförelse mellan dessa två system, kan ett par punkter undersökas. Medan en patch clamp i celler erbjuder fördelar för en biofysiska karakterisering med en snabb drog programmet, är dess krav mer komplexa än de av den två-elektrod inspelningar i Xenopus oocyter. En första och icke försumbar svårighet är ett uttryck för ett visst protein med nödvändigheten av en cellkultur, en övergående eller stabil transfection och identifiering av de celler som uttrycker den önskvärda bygga. Det är dessutom nödvändigt att undersöka det möjliga bidraget av endogena uttrycket i betraktas cellen. Dessutom kräver en patch clamp inspelning en kunnig person att genomföra mikromanipulation i hög förstoring Mikroskop, medan personen behöver också utföra en adekvat analys under experimentet att bedöma, exempelvis kvaliteten av tätningen, tillgång motstånd etc. i kontrast, en två-elektrod spänning klämma inspelning, speciellt en med hjälp av ett automatiserat elektrofysiologiska system, kräver inte någon särskild kompetens och kan bedrivas av laboratorietekniker.
När förvärva en Elektrofysiologisk set-up, är kostnad faktor säkerligen en viktig faktor som behöver analyseras noggrant. Till exempel, medan kostnaden för ett automatiserat system är relativt hög, visar en närmare jämförelse att installation av en komplett elektrofysiologiska rigg ingår att köpa utrustning såsom bra micromanipulators, en binocular lins, en förstärkare, en perfusion systemet, och en vibrationsdämpande tabell, samtidigt förvärva data och utföra en analys. En kostnadsjämförelse mellan en två-elektrod spänningen klämman set-up kontra en patch clamp set-up avslöjar ytterligare avvikelser. Dessutom det automatiska systemet erbjuder fördelen av fullt automatiserad utrustning och körs obevakad dag och natt.
De farmakologiska egenskaperna hos en förening bestäms av dess verkningssätt på receptorn. Till exempel är konkurrenskraftiga hämmare molekyler som kan ange samma bindande ficka eller orthosteric plats, eftersom agonist själv orsakar en tävling. Icke-kompetitiva hämmare är föreningar som hämmar receptorer genom att interagera på en annan plats och i fråga om en ligandreglerade jonkanal, som kan ange och blockera Joniska pore, till exempel. Det skulle gå utanför ramen för detta arbete att undersöka olika mekanismer för interaktion, men ytterligare information kan erhållas från en farmakologisk lärobok eller från annat arbete såsom Bertrand och Bertrands22.
När det gäller Allosteriska modulatorer ändrar de sammansatta binder på en plats som är skild från webbplatsen för orthosteric, men förekomsten av molekylen energibarriären mellan de aktiva och andra staterna. Positiv Allosteriska modulatorer (PAMs) är föreningar som minskar energibarriären från vila till det aktiva tillståndet och, därför, förstärka effekten av agonist. För att karaktärisera möjligt PAM, är det därför nödvändigt att fastställa om en exponering mot föreningen förbättrar att bemöta agonist och, i så fall vid vilken koncentration. De experiment som presenteras i figur 11 och figur 14 illustrera protokoll som kan användas framgångsrikt för karakterisering av PAMs på GABAA receptorerna.
I vissa fall kan exponering för PAM ensam räcka att aktivera receptorerna. Sådan verksamhet kan bestämmas genom en smärre ändring av protokollet experimentella presenteras här. Nämligen, i stället för en samtidig tillämpning av modulatorn under exponering för GABA, protokollet kan ändras för tillämpningen av första förening ensam och sedan i närvaro av GABA. En karakterisering av den direkta agonistaktivitet kommer att göras av bestämning av amplituden av svaret frammanade av föreningen själv och jämfört den GABA-framkallat nuvarande.
Experiment som utförs i hjärnan skivor, som illustreras i figur 7, används för att bekräfta aktiviteten sammansatta på infödda receptorer i en bestämd hämmande krets innan du går vidare i djurmodeller och längs vägen mot kliniska studier. Relativt enkla data inspelning och analys protokollet tillåter rangordningen av flera föreningar genom att utvärdera deras differentiell immunmodulerande effekt på PS amplitud. Icke-specifika effekter av föreningar som inte är relaterade till GABA-systemet kan också vara upptäckta (t.ex., när förändringar i formen PS observeras). Direkt, GABAergic neurotransmission kan bedömas i dessa fall genom att mäta effekterna av föreningarna på hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs) använder den hela-cell patch clamp teknik8.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, och Marie Claire Pflimlin från Roche och Tifany Schaer och Deborah Paolucci från HiQScreen för deras utmärkta tekniskt bistånd.
General equipment | |||
96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
Smart Pull | UniPix | – | Electrode Puller |
RoboInject | MultiChannel Systems | – | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
HiClamp | MultiChannel Systems | – | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
DataMining | MultiChannel Systems | – | Data Analysis Software |
DataMerger | MultiChannel Systems | – | Data Processing Software |
Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
Plasticware | |||
Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
Shipping tubes 180ml | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
Pony vial Polyethylene 6ml | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | – | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
RNA preparation | |||
Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
Chemicals | |||
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. | Used for binding assay | ||
Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. | Used for binding assay | ||
Stock solution of test compounds 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Diazepam 4mM in DMSO | Used for binding assay | ||
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C | Used for binding assay | ||
Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
Membranes | |||
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |