Summary
Denne protokol beskriver hvordan man forbereder Drosophila larver for GC-MS-baseret metabolomic analyse.
Abstract
De seneste fremskridt inden for metabolomics har etableret bananfluen Drosophila melanogaster som en kraftfuld genetiske model til at studere dyrenes stofskifte. Ved at kombinere det enorme opbud af Drosophila genetiske værktøjer med evnen til at undersøge store skår af formidlende stofskifte, kan en metabolomics tilgang afsløre komplekse interaktioner mellem kost, genotype, livshistorie begivenheder og miljømæssige stikord. Derudover kan metabolomics undersøgelser opdage roman enzymatisk mekanismer og afdække hidtil ukendte forbindelser mellem tilsyneladende forskellige stofskifteveje. For at lette mere udbredt brug af denne teknologi blandt Fællesskabets Drosophila , her vi leverer en detaljeret protokol, der beskriver, hvordan du forbereder Drosophila larve prøver til gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS)- baseret metabolomic analyse. Vores protokol indeholder beskrivelser af larve prøvetagning, metabolit udvinding, kemiske forædling og GC-MS analyse. Vellykket gennemførelse af denne protokol vil tillade brugere at måle den relative forekomst af små polar metabolitter, herunder aminosyrer, sukker og organiske syrer involveret i glycolysen og TCA cyklus.
Introduction
Bananfluen Drosophila melanogaster fremstod som et ideelt system til at studere den molekylære mekanisme, der regulerer formidlende stofskifte. Ikke kun bevares de fleste stofskifteveje mellem Drosophila og mennesker, men nøglen næringsstof sensorer og vækstregulerende som insulin, Tor og myc, er også aktiv i at flyve1,2. Som et resultat, kan Drosophila bruges til at udforske det metaboliske grundlaget for menneskelige sygdomme lige fra diabetes og fedme til neurodegeneration og kræft. I denne henseende giver Drosophila larve udvikling den ideelle ramme at studere en metabolisk program kendt som aerob glykolyse eller Warburg-effekten. Ligesom mange tumorer bruge aerob glykolyse til at generere biomasse fra kulhydrater, så aktivere for at gøre Drosophila larver aerob glykolyse for at fremme udviklingsmæssige vækst3,4,5. Disse ligheder mellem larve og tumor stofskifte etablere Drosophila som en vigtig model for forståelse hvordan aerob glykolyse er reguleret i vivo.
Trods det faktum, at fluen er opstået som en populær model til at studere metabolisme, stole de fleste Drosophila undersøgelser på metoder, der er designet til at måle individuelle metabolitter3, såsom trehalose, triglycerider, eller ATP. Da en bestemt protokol er forpligtet til at måle hver metabolit, er assay-baserede undersøgelser arbejdskrævende, dyrt og forudindtaget over for disse forbindelser, der kan måles ved hjælp af kommercielle kits. En løsning på disse begrænsninger er opstået fra feltet af metabolomics, som giver en mere effektiv og fordomsfri middel til at studere Drosophila stofskifte. I modsætning til en assay-baseret undersøgelse, kan en enkelt metabolomic analyse samtidig måle hundredvis af små molekyle metabolitter og giver en omfattende forståelse af en organisme metaboliske status6,7. Denne teknik er betydeligt udvidet anvendelsesområdet for Drosophila metaboliske undersøgelser og repræsenterer fremtiden for dette nye felt8.
Metabolomic undersøgelser er primært gennemført ved hjælp af tre teknologier: a Kernemagnetisk resonans (NMR), (ii) liquid chromatography-massespektrometri (LC-MS) og (iii) gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS)9. Hver metode giver forskellige fordele og ulemper, og alle disse teknologier har været vant til med held studere Drosophila stofskifte. Da den forskning, som udføres i vores lab er fokuseret på små, polar metabolitter, beskæftiger vi primært en GC-MS-baseret metode. GC-MS giver brugeren en række fordele, herunder høj reproducerbarhed, peak opløsning, følsomhed, og tilgængeligheden af en standard elektron indvirkning (EI) spektrale bibliotek, som giver mulighed for hurtig identifikation af opdagede metaboliske funktioner10,11. Forberedelse af prøver for GC-MS, men er noget kompliceret og kræver en omhyggelig opmærksomhed for detaljer. Prøverne skal indsamles, vasket, vejes, og frosset i en måde, der hurtigt slukker metaboliske reaktioner. Desuden flyve slagtekroppen er resistente over for standard homogenisering protokoller og kræver en perle mølle til at sikre optimal metabolit udvinding. Endelig skal prøver analyseres ved GC-MS gennemgå kemiske forædling inden registrering af12. Mens tidligere udgivne metoder beskrive alle disse trin3,13,14, er en visuel protokol, der ville tillade begynderbrugerens reproducerbar generere data af høj kvalitet stadig nødvendig. Her viser vi hvordan du forbereder Drosophila larve prøver for GC-MS-baseret metabolomics analyse. Denne protokol tillader brugeren at reproducerbar måling af mange af de små polar metabolitter, at komponerer central carbon stofskifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ægudtagning
- Indsamle voksne hanner og jomfruelige hunner af de ønskede genotyper. Individuelt alder disse dyr i en mad hætteglas med standard Bloomington medier for 3-5 dage.
- Oprettet den passende parringer ved at overføre 50 jomfruelige hunner og 25 mænd til en ny mad hætteglas.
Bemærk: Et minimum af seks uafhængige parringer bør sættes op for hver genotype. Kun én prøve vil blive indsamlet fra hver parring (dvs. seks prøver indsamlet fra seks uafhængige parringer). -
Forberede melasse æglægning caps.
- Bland 115 mL af melasse og 29 g agar med 700 mL af H2O i en 2 L kolbe.
- Kog melasse agar blandingen på en varm tallerken.
- Afkøles til 70 ° C.
- Der tilsættes 25 mL syre blanding (20 mL 85% phosphorsyre og 209 mL propionsyre i 1 L H2O; Opbevares i en brun flaske) og 10 mL 10% p-hydroxy-benzoesyre syre methylester i 95% ethanol.
- Hæld melasse agar i både låget og bunden del af en 35 x 10 mm2 vævskultur parabol.
Bemærk: Før hælde melasse agar plader, være sikker på, at låg og/eller base af 35 x 10 mm2 plade passer godt ind i mundingen af en Drosophila stock flaske (beskrevet i trin 1,6). Afhængigt af mærke af plader anvendes basen muligvis ikke anvendelige.
- Gøre frisk gær Indsæt ved tilføjelse destilleret vand til aktiv tørgær (5 g gær/7 mL vand) indtil blandingen bliver en pasta, som let kan fordeles på en fast overflade (dvs., konsekvens af jordnøddesmør).
- Sprede ca 1,5 g gær pasta på overfladen af en melasse æglægning cap.
- Stikke fire luft huller til modsatte sider af en plastik 6 oz. Drosophila stock flaske ved hjælp af en 22 G nål.
- Overfør de nyligt skytterne fluer fra mad hætteglasset i kultur flasker.
Bemærk: Fluer kan overføres af enten ved hjælp af CO2 , som en midlertidig narkose eller ved at holde toppen af hætteglasset i mundingen af flasken og skarpt trykke på bunden af flasken mod en benchtop. - Hurtigt placere en melasse æglægning cap med gær pasta på overfladen ind i munden på en Drosophila stock flaske. Brug laboratorium tape til at sikre den æglægning cap på plads.
Bemærk: Hvis fluer blev bedøvede forudgående at overføre, flasken skal placeres vandret på benchtop indtil alle fluer har tilbagebetalt. Når fluer er helt mobil, skal du placere flasken i en inkubator med melasse æglægning cap i bunden af kulturen. - Erstatte melasse æglægning cap mindst en gang om dagen for de første to dage af invertere stock flasken, trykke på bunden af flasken mod benchtop, at fjerne den gamle æg cap og straks placerer en ny fælles landbrugspolitik æg i mundingen af flasken. Kassér den gamle æglægning cap.
Bemærk: Dette trin sikrer, at kvinder ikke holder deres æg og giver mulighed for samling af synkroniserede populationer. - Læg en ny æglægning cap i stock flasken efter dag 3, Erstat efter 2 h, og kassér. Fjerne og erstatte den anden æglægning cap efter fire timer. Label i bunden af denne æglægning cap med dato, tidspunkt og genotype.
Bemærk: Æg indsamlet under 4 h vinduet vil blive brugt til analyse. Trinnet synkronisering er kritisk til at analysere specifikke udviklingsmæssige stadier. Æg kan være indsamlet på denne måde i flere dage. - Indsæt de æglægning caps i en 60 x 15 mm2 Petri plade og sted i en inkubator ved den ønskede temperatur og luftfugtighed.
- Inspicere de æglægning caps hver dag for problemer med sult, befolkningstæthed eller forurening.
Bemærk: Larver skal have adgang til tilstrækkelig føde at sikre løbende udvikling. Hvis det er nødvendigt, kan frisk gær pasta spredes på alle æglæggende caps, der vil blive anvendt i forsøget. Desuden, hvis larve befolkningstætheden er for høj, vil larver begynde at vandre ud af kultur plade. Disse prøver skal ikke bruges til metabolomic analyse, da den høje befolkningstæthed og mellemliggende anfald af sult oplevet mens vandre vil resultere i inkonsistente data. En tæthed af ~ 80 – 100 Mellemøsten anden instar larver (L2) pr. plade eller 40 – 50 midterste tredje instar larver (L3) pr. plade anbefales. Prøver, der er synligt forurenede med bakterier eller svampe skal kasseres.
2. larve prøvetagning
- Alder larver indtil den ønskede scene. Hvis indsamling L3 larver, gensynkronisere prøver på L2-L3 molt. Gensynkronisering er almindeligt opnås ved hjælp af en tidligere beskrevne metode, der bruger de forreste Spirakler som en udviklingsmæssige milepæl15. Alternativt, midten af L3 larver kan synkroniseres ved hjælp af en sgs3 reporter gen16.
Bemærk: I denne henseende, vi finder midten af L2 larver (~ 60 h efter æglægning) er velegnet til de fleste analyser, fordi larve udvikling er stadig relativt synkron på dette stadium, omhyggeligt indsamlet prøver har tilstrækkelig mad at udvikle til dette tidspunkt, og den antallet af dyr pr. sample er håndterbare (se nedenfor). En yderligere synkronisering skridt er nødvendige for L3 larver fordi de talrige ecdysone pulser, der opstår under L3 udvikling har dramatiske effekter på stofskiftet og vil generere artefakter i ikke-synkroniserede populationer. - Brug en dissekere nål til at forsigtigt løfte gær pastaen ud på agar. Sted gær på en ny melasse agar cap.
Bemærk: De fleste larverne vil spise på grænsefladen mellem melasse agar og gær pasta. - Brug en lille pensel til at indsamle larver fra den nyligt eksponerede overflade af melasse agar. Placere larverne i et 1,5 mL centrifugeglas på is.
Bemærk: Passende stikprøvestørrelserne for hver udviklingsstadiet er som følger: 50 første instar larver (L1); 25 midten af L2 larver; 20 tidlige L3 larver; 15 midt-L3 eller sene L3 larver. - Vask og fryse prøver (trin 2.3 gennem 2.8) i små partier (fire til seks prøver) samtidig med at indsamle en stor stikprøve sæt. Prøverne skal fryses inden for 20 min af markedsføring larver i rør.
Bemærk: Vi anbefaler at bruge Eppendorf 1,5 mL Flex rør, fordi andre rør kan forstyrre prøve overførsel på trin 3. Prøverne skal opsamles i mikrofuge rør. Ikke indsamler prøver i perle rør beskrevet taktfast 3.1. Keramik perler bevarer NaCl vaskeopløsning, hvilket resulterer i unøjagtige masse målinger og indfører forurenende stoffer i prøven. - Der tilsættes 1 mL iskold 0,9% NaCl ind i røret, luk låget og lodret Spejlvend tube til grundigt for at vaske larverne.
- Placer røret tilbage på isen for ~ 30 s. I løbet af denne tid, larver vil synke til bunden af røret, men gær vil forblive i suspension. Når alle larverne har dannet en løs pellet, fjerne NaCl løsning ved hjælp af 1 mL pipette.
- Gentag trin 2.4 og trin 2.5 to gange, eller indtil den endelige Vaskeopløsningen er klart.
Bemærk: Yderligere wash skridt kan være nødvendig, hvis de indsamlede prøven indeholder en stor mængde af gær. - Centrifugeres prøver på 2.000 × g i 1 min. ved 4 ° C.
- Fjerne alle resterende løsning ved hjælp af en 200 µL pipette.
- Straks fryse prøven i flydende kvælstof.
Bemærk: Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette trin. Prøver kan opbevares i op til 3 måneder ved-80 ° C.
3. overførsel af prøver til perle rør
- Hver larve prøve skal overføres fra 1,5 mL mikrofuge tube til en 2 mL screwcap rør indeholdende 1,4 mm keramik perler. Forberedelse til denne overførsel trin, skal du bruge en ethanol-bevis markør til at mærke siden af en 2 mL screwcap perle tube (markeringer på låget vil være ødelagt under trin 4.4).
- Tara massen af mærket perle røret ved hjælp af en Analysevægt, der kan præcist måle 0,01 mg.
- Hvis larve prøver blev opbevaret ved-80 ° C, skal du placere prøveglassene i flydende nitrogen forud at overføre.
- Brug lang pincet til at fjerne 1,5 mL prøveglas fra den flydende kvælstof dewar.
- Iført nitrilhandsker, fange den frosne rør, invertere og skarpt pund tube låget mod benchtop at løsne frosne pellet. Hæld straks pellet i en pre tareret 2 mL screwcap perle tube. Hvis pelleten undlader at løsne, retur røret til flydende kvælstof og Gentag.
Bemærk: Larve pellets vil ikke løsne fra alle mikrofuge rør. Hvis bruger en tube end den anbefalede, bestemme, hvis larve pellets kan forrykke sig før indsamling af prøver til analyse. - Hurtigt måle kombineret massen af larve pellet og perle røret. Umiddelbart Placer prøveglas i flydende kvælstof. De larver pellet masse vil blive brugt til at normalisere metabolomic dataene.
Bemærk: Protokollen kan afbrydes midlertidigt på dette trin. Prøver kan opbevares i op til 3 måneder ved-80 ° C.
4. prøven udvinding
- Placer prøveglassene i en-20 ° C benchtop køligere.
- Tilføje 0,8 mL af prechilled (-20 ° C) 90% methanol indeholdende 2 µg/mL ravsyre-d4 syre i hvert rør. Returnere prøven til-20 ° C benchtop køligere.
Bemærk: Ravsyre-d4 syre fungerer som en intern standard. Kun bruge HPLC grade H2O og methanol. Da methanol og andre organiske opløsningsmidler er flygtige og svære at præcist at måle ved hjælp af luft forskydning pipetter, anbefaler vi at bruge positiv-forskydning pipetter til dette trin og alle følgende trin. - Oprette en negativ kontrol ved at tilføje 0,8 mL af prechilled (-20 ° C) 90% methanol indeholdende 2 µg/mL ravsyre-d4 syre ind i en tom perle rør.
- Homogeniseres prøver for 30 sekund på 6,45 m/s ved hjælp af en perle mill homogeniseringsapparat beliggende i en 4 ° C temperatur kontrol værelse.
Bemærk: Manglende hurtigt og helt homogeniseres larve pellet er en fælles kilde til variation i metabolomics analyse. Brug kun homogenizers, der er i stand til at ødelægge frosne larver væv inden for 30 s. - Returnere den homogeniserede prøver rør til-20 ° C benchtop køligere og inkuberes dem i en-20 ° C fryser i mindst 1 time.
- Der centrifugeres rør på 20.000 × g eller maksimum hastighed i 5 min. ved 4 ° C for at fjerne den resulterende bundfald.
- Overføre 600 µL af supernatanten ind i en ny 1,5 mL microcentrifuge rør. Forstyr ikke bundfaldet. Hvis den forhastede pellet bliver fortrængt mens pipettering supernatanten, returnere alle supernatanten til røret og Gentag trin 4.6.
- Placer prøveglassene i et vakuum centrifuge. Sørg for at alle rør er åben før forsegling centrifugen. Tørre prøver ved stuetemperatur indtil alle opløsningsmidlet er fjernet (dette trin tager normalt ~ 16 h at fuldføre).
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, protokollen kan være midlertidigt på dette trin. Tørrede prøven kan opbevares ved-80 ° C.
5. kemisk forædling
- Hvis de tørrede prøver blev opbevaret ved-80 ° C, placere uåbnede prøveglassene i et vakuum centrifuge og tørre i 30 min. Dette trin skal udføres før du åbner prøveglas.
Bemærk: Dette trin fjerner den kondens, der indsamler på ydersiden af det mikrofuge rør når fjernet fra fryseren. Denne del af protokollen er yderst følsom over for H2O og skal træffes ekstra forholdsregler for at holde alle reagenser så tørre som muligt. -
Der fremstilles en opløsning af 40 mg/mL methoxylamine hydrochlorid (MOX) i vandfri pyridin. Kun bruge vandfri pyridin. Gemme MOX og pyridin i en ekssikkator og forberede MOX løsning dagligt.
Forsigtig: MOX og pyridin er giftige. Forberede denne løsning i stinkskab.- Brug en varmepistol til at tørre en 1 mL glas sprøjte.
- Indsætte nålen af sprøjten i vandfri pyridin flaske. Fjerne 1 mL af pyridin og tilføje til et mikrofuge rør indeholdende 40 mg af MOX.
- Skyl flasken af vandfri pyridin med argon. Forsegle flasken og vende tilbage til ekssikkatoren.
- Opløse MOX i pyridin af inkubere røret i en termisk mixer ved 35 ° C i 10 min på 600 rpm.
- Tilføje 40 µL af 40 mg/mL MOX i vandfri pyridin løsning til tørrede prøven.
- Vortex for 10 s og kortvarigt centrifuge (10.000 x g til 20 s).
- Der inkuberes ved 30 ° C i 1 time på 600 rpm i en termisk mixer.
- Der centrifugeres ved 20.000 × g eller maksimale hastighed i 5 min at fjerne partikel sagen.
- Overføre 25 µL af supernatanten til en autosampler hætteglas med en 250 µL deaktiveret glas microvolume indsætte.
- Tilføje 40 µL af N- methyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) indeholdende 1% TMCS.
Forsigtig: MSTFA er giftigt. Udføre dette trin i stinkskab.
Bemærk: Hvis den er tilgængelig, dette trin kan udføres af en Gerstel autosampler. - Placer en cap på autosampler hætteglasset og forsegle ved hjælp af en crimper værktøj.
- Inkuber prøve ved 37 ° C i 1 time med rysten (250 rpm).
- Forberede en fedtsyre methyl ester standard (FAMES) løsning som tidligere desceribed3. Tilføje 3 µL af FAMES til autosampler hætteglasset ved hjælp af en robot autosampler umiddelbart før injektion.
Bemærk: FAMEs bruges til at kalibrere tidsskiftet fastholdelse og tjekke instrument performance. Hvis ingen robot autosampler er tilgængelig, kan FAMEs tilføjes under trin 5.8.
6. GC-MS påvisning
Bemærk: I de fleste tilfælde, vil brugeren foretage dette skridt med bistand fra en masse spektroskopi core facilitet. Denne protokol er designet til at bruges med en 30 m, GC-kolonne med en 5 m forkolonne.
- Randomisere prøve rækkefølge.
-
Forberede GC-MS.
- Sæt helium transportør af gasstrømmen til 1 mL/min.
- Sæt på indsugningsluften til 250 ° C.
- Programmere GC hen til effektuere den følgende temperaturgradient:
- Indledende temperatur til 95 ° C med fat i 1 min.
- Hæve temperaturen til 110 ° C med en sats på 40 ° C/min. med fat i 2 min.
- Øges til 250 ° C ved 5° C/min. rampe.
- Øger til 330 ° C med en hastighed på 25 ° C/min. med en endelig fat i 4 min.
- Indstille opløsningsmiddel forsinkelse til 3,5 min.
Bemærk: Tid kan ændres efter GC-MS system. Formålet med dette trin er at forhindre, at MSTFA og MOX skadelige detektoren.
- Injicér 1 µL af derivatized prøven i GC-MS (split forholdet 10:1).
Bemærk: Injicér 2 µL af prøven hvis intensiteten af toppene er for lavt. Injektion rækkefølgen af prøver skal blive randomiseret. - Betjene massespektrometer i fuld scanning mode over en massiv vifte af 50 – 500 m/z.
7. dataanalyse
- Analysere metabolomic data ved hjælp af enten en målrettet eller ikke-målrettede tilgang. Målrettet analyse er fokuseret på måling overfloden af et defineret sæt af metabolitter, såsom laktat målingerne, som vi beskriver nedenfor. Derimod bruger ikke-målrettede analyse en fordomsfri tilgang til at identificere enhver metabolisk funktion, der er væsentligt ændrede mellem to prøve sæt.
Bemærk: Vores lab primært bruger gratis programmer MetAlign17 og MetaboAnalyst18,19 til dataanalyse. Da en fyldestgoerende beskrivelse af både kvalitetskontrol, normalisering og databehandling trin uden for rammerne af dette manuskript, kalder vi brugeren mere detaljerede protokoller, der er afsat til databehandling20,21, 22. Derudover kan et rutediagram, der beskriver de trin, der kræves for denne analyse findes andetsteds8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laktat dehydrogenase (dLDH) mutanter, som mangler dLDH aktivitet4og genetisk-matchede kontrol blev indsamlet som midten af L2 larver og forarbejdet i henhold til protokollen beskrevet ovenfor. Sammenlignet med kontrol, udviser mutant larver betydelige ændringer i laktat, pyruvat, og L-2-hydroxyglutarate4. Spectra er anskaffet med en Agilent GC6890-5973i MS system. Et eksempel på GC-MS-spektre generere med vores protokol er vist i figur 1. Der er mange synlige funktioner og en bemærkelsesværdig peak for trehalose, som normalt udgør den største højdepunkt i en larve prøve, og er normalt oversaturated (figur 1AB). Den enkelte spektrum af negativ kontrolprøve er vist i figur 1 c. Selv om der er stadig flere synlige toppe i en negativ kontrolprøve, reduceres intensiteten og antallet af toppe, sammenlignet med de eksperimentelle prøver vist i figur 1A, B. Disse toppe skyldes primært kolonne bløder, intern standard (ravsyre-d4 syre), FAMEs og kontaminerende fedtsyrer. Mislykkede prøveforberedelse vil generere et spektrum svarende til den, vist i figur 1 c.
Alle spektre var preprocessed bruger MetAlign17 og data var normaliseret med intern standard og pellet masse. Data blev efterfølgende forelagt MetaboAnalyst18,19 for statistisk analyse. Princippet komponent analyse (PCA) viser klart, at de to grupper adskilt fra hinanden, og at der er ingen outlier i hver gruppe (figur 2A). Yderligere analyse viser betydelige ændringer i de metabolitter, der er kendt for at være påvirket af tab af dLDH (figur 2B)4.
Figur 1 : Repræsentant GC-MS spektre af Drosophila larve ekstrakt. (A-B) Typiske spektre af midten af L2 larve uddrag af vildtype (WT) og dLDH mutanter (KO). (C) en repræsentativ GC-MS spektrum genereret fra en negativ kontrolprøve (NC). De fleste af toppene i dette spektrum er fra intern standard, FAMEs og fedtsyrer. (D-F) Sammenlignet med WT prøver, KO prøver udstille forhøjede niveauer af (D) pyruvat og faldt niveauer af (E) laktat og (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Statistisk analyse viser de forskellige metaboliske profiler mellem vildtype (WT) og dLDH knockout (KO) larver. (A) PCA score plot. (B) metabolitter, der udviser betydelige ændringer i dLDH mutanter. Alle datapunkter er afbildet af gennemsnittet af kontrolelementet WT, som blev justeret til en vilkårlig værdi på 100. Inden analyse, data var normaliseret til ravsyre-d4 syre intern standard og larver pellet masse. Data vist som gennemsnit ± én standardafvigelse. p < 0,01 for alle metabolitter ved hjælp af en to-sidede t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabolomics giver en enestående mulighed for at undersøge den metaboliske reaktioner, at komponerer formidlende stofskifte. Følsomheden af denne teknologi, men gør data modtagelige for genetiske baggrund, udviklingsmæssige stikord og en række forskellige miljøbelastninger, herunder temperatur, luftfugtighed, befolkningstæthed og næringsstoftilgængelighed. Derfor, en høj kvalitet og reproducerbare metabolomics analyse kræver, at prøver indsamles under stærkt kontrollerede forhold. Mens flere anmeldelser fremhæve dette punkt3,8,23, leverer her vi en trinvis metode til indsamling af larver, der er designet til at sikre reproducerbarheden.
Den mest almindelige kilde til variation i en metabolomics analyse stammer fra en fiasko at slukke, eller stoppe, metaboliske reaktioner efter prøven er indsamlet. I denne henseende metabolisme vil stoppe ved frysning i flydende nitrogen og metaboliske enzymer vil blive ødelagt, når prøven er homogeniseret i-20 ° C methanol. Antages det, at brugeren betaler særlig vægt på at holde en prøve frosset før methanol udvinding, er vores protokol designet til at sikre, at metabolomics data genereret af denne procedure udgør en nøjagtig øjebliksbillede af larve stofskifte. Skal brugeren opleve uacceptable niveauer af data variabilitet, brugeren bør revurderer samling og metabolitten udvinding protokollen med særlig opmærksomhed at sikre (1) at stofskiftet er hurtigt slukket (trin 2,9-4,2) og (2) at den prøven er effektivt homogeniseret i 90% methanol (trin 4.4). I denne henseende mange perle mills giver ikke tilstrækkelig kraft til at homogenisere prøver inden for den angivne tid og vi opfordrer brugeren til at anvende et instrument, der har været anvendt i tidligere undersøgelser8.
Vores protokol fremhæver også vigtige skridt, som begynderbrugerens må konstatere at reproducerbar derivatize prøver. Dette er afgørende for GC-MS, fordi mange metabolitter har begrænset volatilitet eller dårlig termisk stabilitet. Forædling øger både volatilitet og termisk stabilitet af mange metabolitter, hvilket øger antallet af forbindelser, der kan måles reproducerbar. Som et resultat, udstiller prøver, der har gennemgået en ufuldstændig forædling ikke-reproducerbare toparealer, højder og figurer. Som vi fremhæve her, er en fælles kilde til mislykkede forædling eksponering af prøven til vand, hvilket mindsker den kemiske forædling effektivitet. Derfor skal alle reagenser, herunder MSTFA, MOX og pyridin, holdes under fugt-fri betingelser. Behovet for at opretholde tørre forhold også strækker sig til prøver, der er gemt på-80 ° C, som skal placeres i en vakuum centrifugeres i 30 min før åbning for at sikre, at kondens ikke angiver prøven. Vi vil også gerne understrege, at GC-MS er en følsom teknologi, og som et resultat større prøver ikke nødvendigvis skaber bedre data. Vores protokol giver eksperimentelt testet stikprøvestørrelser og måler reproducerbar de fleste metabolitter i central carbon stofskifte. Nogle af disse metabolitter er meget rigelige og øget stikprøvestørrelse vil føre til at signalere mætning i spektret. Faktisk signal for trehalose allerede er mættet i vores analyse og en delingsforholdet af 100: 1 for GC-MS injektion skal bruges til at nøjagtigt måle dette stof. Endelig bør brugeren Bemærk, at fordi vi bruger en polar ekstraktionsopløsning, vores protokol ikke er passende for lipid udvinding. Vores protokollen tager også ikke højde for fedtsyrer forureninger, der kunne være til stede på plasticrør og tips, hvilket er grunden til nogle fedtsyre signaler vises i en negativ kontrolprøve (figur 1B).
Endelig indeholder metoderne detaljeret her et kraftfuldt værktøj til at studere Drosophila stofskifte. Denne protokol, men er ikke specifikke for Drosophila og kan bruges med få ændringer til metaboliske undersøgelser i alle små hvirvelløse. Uanset art, denne simple metode giver mulighed for relativ kvantificering af næsten alle aminosyrer, mellemprodukter i glycolysen og TCA cyklus, samt en række andre små polære molekyler. Når det kombineres med de enestående genetiske værktøjer til rådighed for Fællesskabets Drosophila , placerer denne type metabolomic analyse flue på forkant med metaboliske forskning for en overskuelig fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Tak til medlemmerne af Indiana University masse spektroskopi facilitet og University of Utah Metabolomics Core facilitet for hjælp til optimering af denne protokol. J.M.T. er støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award nummer R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
