Summary
Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.
Abstract
I recenti progressi nel campo della metabolomica hanno stabilito il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come un potente modello genetico per studiare il metabolismo degli animali. Combinando la vasta gamma di strumenti genetici della drosofila con la capacità di indagine vaste aree del metabolismo intermedio, un approccio di metabolomica può rivelare interazioni complesse tra dieta, genotipo, eventi di vita-storia e stimoli ambientali. Inoltre, studi di metabolomica possono scoprire nuovi meccanismi enzimatici e scoprire connessioni precedentemente sconosciute tra vie metaboliche apparentemente disparate. Al fine di facilitare l'uso più diffuso di questa tecnologia tra la comunità di Drosophila , qui forniamo un protocollo dettagliato che descrive come preparare campioni larvali della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS)- Basato su analisi metabolomica. Il nostro protocollo include descrizioni di campionario larvale, metabolita estrazione, derivatizzazione chimica e analisi GC-MS. Completamento del presente protocollo consentirà agli utenti di misurare l'abbondanza relativa di piccoli metaboliti polari, tra cui amminoacidi, zuccheri e acidi organici coinvolti nella glicolisi e i cicli TCA.
Introduction
Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è emerso come un sistema ideale per studiare i meccanismi molecolari che regolano il metabolismo intermedio. Non solo sono la maggior parte delle vie metaboliche conservate tra Drosophila e gli esseri umani, ma nutrienti chiave sensori e regolatori di crescita, come l'insulina, Tor e myc, sono anche attivi in volare1,2. Di conseguenza, Drosophila consente di esplorare la base metabolica delle malattie umane che vanno dal diabete e obesità a neurodegenerazione e cancro. A questo proposito, lo sviluppo larvale della drosofila fornisce il quadro ideale in cui studiare un programma metabolico conosciuto come glicolisi aerobica, o l'effetto di Warburg. Proprio come molti tumori utilizzano la glicolisi aerobica per generare biomassa da carboidrati, così per fare della drosofila larve attivano glicolisi aerobica per promuovere la crescita dello sviluppo3,4,5. Queste somiglianze tra larvale e metabolismo del tumore stabilire Drosophila come modello chiave per la comprensione come aerobico glicolisi è regolamentato in vivo.
Nonostante il fatto che la Mosca è emerso come un modello popolare per studiare il metabolismo, la maggior parte degli studi di Drosophila si basano su metodi che sono progettati per misurare diversi metaboliti3, quali trealosio, trigliceridi o ATP. Poiché un protocollo specifico è necessaria per misurare ogni metabolita, studi basati su analisi sono laboriosi, costoso e prevenuto verso quei composti che possono essere misurati usando i kit commerciali. Una soluzione a queste limitazioni è emerso dal campo della metabolomica, che fornisce un mezzo più efficiente ed imparziale di studiare il metabolismo di Drosophila . A differenza di uno studio basato su analisi, un'analisi metabolomica singolo può simultaneamente misurare centinaia di piccole molecole metaboliti e fornire una comprensione globale di stato metabolico6,7 di un organismo. Questa tecnica ha notevolmente ampliato il campo di studi metabolici di Drosophila e rappresenta il futuro di questo settore emergente8.
Metabolomica studi vengono condotti principalmente utilizzando tre tecnologie: (i) risonanza magnetica nucleare (NMR), (ii) liquida spettrometria della cromatografia-massa (LC-MS) e (iii) gas cromatografia-spettrometria (GC-MS)9. Ogni approccio offre vantaggi e svantaggi, e tutte queste tecnologie sono state usate per studiare con successo metabolismo di Drosophila . Poiché le ricerche condotte nel nostro laboratorio sono focalizzata sui metaboliti polari, piccoli, principalmente ci avvaliamo di un metodo basato su GC-MS. GC-MS fornisce all'utente una serie di vantaggi, tra cui alta riproducibilità, risoluzione dei picchi, sensibilità, e la disponibilità di una libreria spettrale di impatto (EI) standard dell'elettrone, che permette la rapida identificazione di scoperto metabolica caratteristiche10,11. La preparazione dei campioni per GC-MS, tuttavia, è piuttosto complessa e richiede una grande attenzione al dettaglio. Campioni devono essere raccolto, lavati, pesati e congelati in un modo che disseta rapidamente reazioni metaboliche. Inoltre, la carcassa Vola è resistente ai protocolli standard omogeneizzazione e richiede un mulino di tallone per assicurare l'estrazione ottimale del metabolita. Infine, i campioni analizzati mediante GC-MS devono subire derivatizzazione chimica prima del rilevamento12. Mentre precedentemente pubblicati metodi descrivono tutti questi passaggi3,13,14, è ancora necessario un protocollo visual che consentirebbe l'utente inesperto di riproducibile generare dati di alta qualità. Qui dimostriamo come preparare Drosophila larvali campioni per l'analisi metabolomica basati su GC-MS. Questo protocollo permette all'utente di misurare riproducibile molti dei piccoli metaboliti polari che compongono il metabolismo del carbonio centrale.
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Protocol
1. uovo collezione
- Raccogliere adulti maschi e femmine vergini dei genotipi desiderati. Individualmente l'età questi animali in un flaconcino di cibo con supporti standard di Bloomington per 3 – 5 giorni.
- Impostare gli accoppiamenti appropriati trasferendo 50 femmine vergini e 25 maschi ad un nuovo flacone di cibo.
Nota: Un minimo di sei accoppiamenti indipendenti dovrebbe essere impostato per ciascun genotipo. Un solo campione sarà raccolti da ogni accoppiamento (cioè, sei campioni raccolti da sei accoppiamenti indipendenti). -
Preparare i tappi di deposizione delle uova di melassa.
- Mescolare 115 mL di melassa e 29 g di agar con 700 mL di H2O in un pallone da 2 L.
- Far bollire la melassa agar composto su un piatto caldo.
- Raffreddare fino a 70 ° C.
- Aggiungere 25 mL di miscela acida (20 mL di acido fosforico 85% e acido propionico 209 mL in 1 L di H2O; Conservare in una bottiglia scura) e 10 mL di estere metilico dell'acido p-idrossi-benzoico di 10% in etanolo al 95%.
- Versare l'agar di melassa in parte il coperchio ed il fondo di un piatto di coltura del tessuto2 35 x 10 mm.
Nota: Prima di versare la melassa piastre di agar, assicurarsi che i coperchi e/o la base della piastra2 35 x 10 mm misura snuggly nella bocca di una bottiglia di stock di Drosophila (descritta nel punto 1.6). A seconda della marca di lastre utilizzate, la base potrebbe non essere utilizzabile.
- Fare il lievito fresco pasta aggiungendo acqua distillata ad attivo lievito secco (5 g lievito/7 mL di acqua) fino a quando la miscela diventa una pasta che possa essere facilmente distribuita su una superficie solida (cioè, la consistenza del burro di arachide).
- Sviluppa circa 1,5 g di pasta di lievito sulla superficie di un tappo di deposizione delle uova di melassa.
- Colpire i quattro fori di aria in lati opposti di una plastica 6 once bottiglia stock Drosophila , usando un ago 22 G.
- Trasferire le mosche appena accoppiate dal flaconcino di cibo in flaconi per coltura.
Nota: Le mosche possono essere trasferiti mediante l'utilizzo di CO2 come un anestetico temporaneo o mantenendo la parte superiore della fiala in bocca della bottiglia e acutamente toccando il fondo della bottiglia contro un benchtop. - Inserire rapidamente un tappo di deposizione delle uova di melassa con pasta di lievito sulla superficie nella bocca di una bottiglia di stock di Drosophila . Utilizzare nastro di laboratorio per fissare il tappo di deposizione delle uova nel luogo.
Nota: Se mosche erano anestetizzato prima del trasferimento, la bottiglia dovrebbe essere posizionata orizzontalmente sul banco fino a quando tutte le mosche hanno recuperato. Una volta che le mosche sono completamente mobile, posizionare la bottiglia in un incubatore con il tappo di deposizione delle uova di melassa nella parte inferiore della cultura. - Sostituire il tappo di deposizione delle uova di melassa almeno una volta al giorno per i primi due giorni invertendo la bottiglia stock, toccando il fondo della bottiglia contro il benchtop, rimuovendo il vecchio tappo di uovo e mettendo subito una nuova PAC di uovo nella bocca della bottiglia. Scartare il vecchio tappo di deposizione delle uova.
Nota: Questo passaggio garantisce che le femmine non tengono le loro uova e permette per la raccolta delle popolazioni sincronizzati. - Mettere un nuovo tappo di deposizione delle uova la bottiglia stock dopo giorno 3, sostituire dopo 2 h e scartare. Rimuovere e sostituire il secondo tappo di deposizione delle uova dopo quattro ore. Etichettare il fondo di questo cappellino di deposizione delle uova con la data, il tempo e il genotipo.
Nota: Le uova raccolte durante questa finestra 4h saranno utilizzate per analisi. Questo passaggio di sincronizzazione è fondamentale per l'analisi di specifici stadi di sviluppo. Le uova possono essere raccolti in questo modo per diversi giorni. - Inserire i tappi di deposizione delle uova in una piastra di Petri 60x15 mm2 e posto in un incubatore alla temperatura desiderata e umidità.
- Ispezionare i tappi di deposizione delle uova ogni giorno per problemi con la fame, la densità della popolazione o la contaminazione.
Nota: Larve devono avere accesso ad un'alimentazione adeguata per garantire lo sviluppo continuo. Se necessario, pasta di lievito fresco può essere spalmato su tutti i tappi di deposizione delle uova che verranno utilizzati nell'esperimento. Inoltre, se la densità di popolazione larvale è troppo alto, larve inizierà a vagare fuori la piastra di coltura. Questi campioni non devono essere utilizzati per analisi metabolomica perché l'alta densità di popolazione e periodi intermedi di inedia sperimentato girovagando si tradurrà in dati incoerenti. Una densità di ~ 80 – 100 medio secondo instar larve (L2) per piastra o 40 – 50 intermedio terzo instar larve (L3) per ciascuna piastra è consigliato. I campioni che sono visibilmente contaminati con batteri o funghi dovrebbero essere scartati.
2. larvale campionario
- Larve di età fino alla fase desiderata. Se raccogliendo larve L3, risincronizzare i campioni presso i molt L2 – L3. Risincronizzazione è comunemente ottenuto utilizzando un metodo descritto in precedenza che utilizza gli spiracoli anteriori come una pietra miliare dello sviluppo15. In alternativa, metà-L3 larve possono essere sincronizzate utilizzando un sgs3 reporter gene16.
Nota: A questo proposito, abbiamo trovato larve di metà-L2 (~ 60 h dopo la deposizione delle uova) sono ideali per la maggior parte delle analisi perché lo sviluppo larvale è ancora relativamente sincrono in questa fase, accuratamente raccolti campioni hanno un'alimentazione adeguata per sviluppare per questo timepoint e la numero di animali per esempio è gestibili (Vedi sotto). Un passo ulteriore sincronizzazione è necessario per le larve L3 perché gli impulsi di ecdisone numerose che si verificano durante lo sviluppo L3 hanno effetti drammatici sul metabolismo e genereranno gli artefatti in popolazioni non sincronizzati. - Utilizzare un ago per dissezione per sollevare delicatamente la pasta di lievito fuori l'agar. Mettere il lievito su una nuova PAC di agar di melassa.
Nota: La maggior parte delle larve mangiano all'interfaccia fra l'agar di melassa e la pasta di lievito. - Utilizzare un piccolo pennello per raccogliere larve dalla superficie recentemente esposta dell'agar melassa. Posizionare le larve in una provetta da centrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.
Nota: Dimensioni del campione appropriato per ogni stadio di sviluppo sono come segue: 50 primo instar larve (L1); 25 larve di metà-L2; 20 prime larve di L3; 15 metà-L3 o tardo L3 larve. - Lavare e congelare i campioni (passaggi 2.3 attraverso 2.8) in piccoli lotti (quattro a sei campioni) durante la raccolta di un insieme di grande campione. I campioni devono essere congelati entro 20 min di immissione larve nei tubi.
Nota: Si consiglia di utilizzare Eppendorf 1,5 mL Flex tubi perché altri tubi possono interferire con il trasferimento del campione al passaggio 3. I campioni devono essere raccolti in provette microfuge. Non raccogliere campioni nei tubi perlina descritti al punto 3.1. Perle in ceramica conservano la soluzione di lavaggio di NaCl, che si traduce in misure di massa imprecise e introduce contaminanti nel campione. - Aggiungere 1 mL di gelida 0,9% NaCl nel tubo, chiudere il coperchio e capovolgere verticalmente il tubo a accuratamente lavare le larve.
- Riposizionare il tubo sul ghiaccio per ~ 30 s. Durante questo tempo, larve affonderanno alla parte inferiore del tubo, ma lievito rimarrà in sospensione. Una volta tutte le larve hanno formato un pellet sciolto, rimuovere la soluzione di NaCl utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5 due volte, o fino a quando la soluzione di lavaggio finale è chiaro.
Nota: Fasi di lavaggio supplementare potrebbero essere necessari se il campione prelevato contiene una quantità eccessiva di lievito. - Centrifugare i campioni a 2.000 × g per 1 min a 4 ° C.
- Rimuovere tutti i residui della soluzione utilizzando una pipetta 200 µ l.
- Congelare immediatamente il campione in azoto liquido.
Nota: Il protocollo può essere sospeso in questa fase. I campioni possono essere conservati fino a 3 mesi a-80 ° C.
3. trasferire i campioni ai tubi della perla
- Ogni campione larvale dovrà essere trasferiti dal tubo microfuge 1,5 mL per un tubi di coperchio a vite di 2 mL contenente microsfere di ceramica di 1,4 mm. In preparazione per questo passaggio di trasferimento, è possibile utilizzare un marcatore di etanolo-prova per etichettare il lato di una provetta da 2 mL per raccordi perlina (marcature sul coperchio saranno distrutti durante passaggio 4.4).
- Tare la massa del tubo della perla con etichetta utilizzando una bilancia analitica, in grado di misurare con precisione 0,01 mg.
- Se larvali campioni sono stati conservati a-80 ° C, inserire le provette campione in prima dell'azoto liquido per trasferire.
- Utilizzare pinze lunghe per rimuovere la provetta da 1,5 mL dall'azoto liquido dewar.
- Indossando guanti di nitrile, afferrare il congelato tubo, invertire e acutamente pestare il coperchio del tubo contro il benchtop per sloggiare il pellet congelato. Versare immediatamente il pellet in una provetta di perlina di coperchio a vite pre-tarato 2 mL. Se la pallina non riesce a sloggiare, tornare il tubo a azoto liquido e ripetere.
Nota: Pellet larvale non sloggiare da tutti i tubi del microfuge. Se si utilizza un tubo diverso da quello consigliato, è necessario determinare se pellet larvale può essere sloggiato prima del prelievo dei campioni per l'analisi. - Misurare rapidamente la massa combinata del tubo pellet e perlina larvale. Posizionare immediatamente la provetta in azoto liquido. Il pellet larvale massa verrà utilizzato per normalizzare i dati metabolomica.
Nota: Il protocollo può essere sospeso in questa fase. I campioni possono essere conservati fino a 3 mesi a-80 ° C.
4. campione estrazione
- Disporre le provette campione in un benchtop di-20 ° C più fresco.
- Aggiungere 0,8 mL di metanolo al 90% prechilled (-20 ° C) contenente 2 µ g/mL di acido succinico-d4 in ogni provetta. Riportare il campione del benchtop di-20 ° C più fresco.
Nota: L'acido succinico-d4 serve come standard interno. Utilizzare solo HPLC grade H2O e metanolo. Poiché sono metanolo e altri solventi organici volatili e difficili da misurare con precisione utilizzando pipette a spostamento aria, si consiglia di utilizzare pipette a spostamento positivo per questo passaggio e tutti i passaggi seguenti. - Impostare un controllo negativo aggiungendo 0,8 mL di metanolo al 90% prechilled (-20 ° C) contenente 2 µ g/mL di acido succinico-d4 in una provetta vuota della perla.
- Omogeneizzare campioni per 30 secondi a 6,45 m/s usando un omogeneizzatore del mulino della perla si trova in una sala di controllo di temperatura di 4 ° C.
Nota: Il mancato rapidamente e completamente omogeneizzare il pellet larvale è una comune fonte di variabilità nell'analisi metabolomica. Utilizzare solo omogeneizzatori che sono in grado di distruggere congelati tessuti larvali entro 30 s. - Ritornare le provette di campioni omogeneizzati del benchtop di-20 ° C più fresco e li Incubare in un congelatore a-20 ° C per almeno 1 h.
- Centrifugare le provette a 20.000 × g o massima velocità per 5 min a 4 ° C per rimuovere il precipitato risultante.
- Trasferire 600 µ l del surnatante in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Non disturbare il precipitato. Se il sedimento precipitato diventa sloggiato durante il pipettaggio il supernatante, restituire tutti i surnatante al tubo e ripetere il passaggio 4.6.
- Posizionare i tubi di campione in una centrifuga vuoto. Assicurarsi che tutti i tubi siano aperti prima di sigillare la centrifuga. Asciugare i campioni a temperatura ambiente finché non viene rimosso tutto solvente (questo passaggio solitamente richiede ~ 16 h per completare).
Nota: Se necessario, il protocollo può essere sospeso in questa fase. Secchi campione può essere conservato a-80 ° C.
5. chimica derivatizzazione
- Se i campioni essiccati sono stati conservati a-80 ° C, posizionare le provette non aperti in una centrifuga vuoto e asciugare per 30 min. Questo passaggio deve essere eseguito prima di aprire la provetta del campione.
Nota: Questo passaggio consente di rimuovere la condensa che si raccoglie sulla parte esterna del tubo microfuge quando rimosso dal freezer. Questa porzione del protocollo è estremamente sensibile alle H2O e precauzione supplementare deve essere presa per mantenere tutti i reagenti più asciutto possibile. -
Preparare una soluzione di cloridrato di methoxylamine 40 mg/mL (MOX) in piridina anidra. Utilizzare solo piridina anidra. Conservare MOX e piridina in un essiccatore e preparare la soluzione MOX ogni giorno.
Attenzione: MOX e piridina sono tossici. Preparare questa soluzione nella cappa fumi.- Utilizzare una pistola di calore per asciugare una siringa di vetro da 1 mL.
- Inserire l'ago della siringa nel flacone di piridina anidra. Prelevare 1 mL della piridina e aggiungerla in una provetta di microfuge contenenti 40 mg di MOX.
- Svuotare la bottiglia di piridina anidra con argon. Tappare la bottiglia e tornare nell'essiccatore.
- Sciogliere il MOX nella piridina incubando il tubo in un miscelatore termico a 35 ° C per 10 min a 600 giri/min.
- Aggiungere 40 µ l di 40 mg/mL MOX in soluzione di piridina anidra al campione essiccato.
- Vortexare per 10 s e brevemente centrifuga (10.000 x g per 20 s).
- Incubare a 30 ° C per 1 h a 600 giri/min in un miscelatore termico.
- Centrifugare a 20.000 × g o velocità massima per 5 min rimuovere la materia di particelle.
- Trasferire 25 μl del surnatante in una fiala di autocampionatore con inserto in vetro microvolume 250 µ l disattivato.
- Aggiungere 40 µ l di N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (Sandro) contenente l'1% TMC.
Attenzione: Massimiliano è tossico. Eseguire questo passaggio nella cappa.
Nota: Se disponibile, questo passaggio può essere completato da un autocampionatore Gerstel. - Mettere un tappo sul flacone autocampionatore e sigillare utilizzando un tool crimper.
- Incubare il campione a 37 ° C per 1 ora con agitazione (250 giri/min).
- Preparare una soluzione (FAMES) standard di acido grasso metil estere come precedentemente desceribed3. Aggiungere 3 µ l di FAMES al flaconcino campionatrice automatica utilizzando un autocampionatore robotico immediatamente prima dell'iniezione.
Nota: FAMEs vengono utilizzati per calibrare lo spostamento del tempo di ritenzione e verificare le prestazioni dello strumento. Se nessun autocampionatore robotico è disponibile, è possibile aggiungere FAMEs durante passaggio 5.8.
6. GC-MS rilevamento
Nota: Nella maggior parte dei casi, l'utente effettuerà questo passaggio con l'assistenza di una struttura di nucleo di spettroscopia di massa. Questo protocollo è progettato per essere utilizzato con un 30 m, colonna GC con una colonna di guardia di 5 m.
- Randomizzare l'ordine del campione.
-
Preparare la GC-MS.
- Insieme la portata del gas vettore elio a 1 mL/min.
- Impostare la temperatura a 250 ° C.
- Programmare il GC per eseguire il seguente gradiente di temperatura:
- Temperatura iniziale a 95 ° C con una sospensione di 1 min.
- Aumentare la temperatura a 110 ° C alla velocità di 40 ° C/min con una tenuta di 2 min.
- Aumentare a 250 ° C 5° C/min rampa.
- Aumentare a 330 ° C alla velocità di 25 ° C/min con una stretta finale di 4 min.
- Ritardo impostato solvente a 3,5 min.
Nota: Il tempo può essere modificato secondo il sistema GC-MS. Lo scopo di questo passaggio è quello di evitare che Massimiliano e MOX danneggino il rivelatore.
- Iniettare 1 µ l di campione derivatizzato in GC-MS (split rapporto 10:1).
Nota: Iniettare 2 µ l di campione se l'intensità dei picchi è troppo basso. L'ordine di iniezione dei campioni deve essere randomizzato. - Azionare lo spettrometro di massa in modalità di scansione completa in un intervallo di massa di 50 – 500 m/z.
7. analisi dei dati
- Analizzare i dati di metabolomica utilizzando sia un approccio mirato o non mirato. Analisi mirata è focalizzata su misura l'abbondanza di un insieme definito di metaboliti, quali le misurazioni di lattato che descriviamo qui di seguito. Al contrario, non mirati analisi utilizza un approccio imparziale per identificare qualsiasi funzionalità metabolica che è cambiato significativamente tra due insiemi di esempio.
Nota: Il nostro laboratorio utilizza principalmente i programmi gratuiti MetAlign17 e MetaboAnalyst18,19 per l'analisi dei dati. Poiché un'adeguata descrizione sia il controllo della qualità, della normalizzazione e passaggi di elaborazione dei dati sono oltre la portata di questo manoscritto, ci riferiamo all'utente a protocolli più dettagliati che sono dedicati all'elaborazione dei dati20,21, 22. Inoltre, un diagramma di flusso che descrive i passaggi necessari per questa analisi può essere trovato altrove8.
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Representative Results
Lattato deidrogenasi (dLDH) mutanti, che mancano di dLDH attività4e geneticamente-hanno abbinato i comandi sono stati raccolti come larve di metà-L2 e trattati secondo il protocollo descritto in precedenza. Rispetto ai controlli, larve mutanti mostrano cambiamenti significativi in lattato, piruvato e L-2-idrossiglutarato4. Gli spettri sono stati acquisiti con un sistema di Agilent GC6890-5973i MS. Generare un esempio degli spettri GC-MS con nostro protocollo è illustrato nella Figura 1. Ci sono molte caratteristiche visibili e un picco notevole per il trealosio, che normalmente rappresenta il picco più grande in un campione larvale ed è solitamente troppo saturi (Figura 1AB). Lo spettro individuo del campione di controllo negativo è illustrato nella Figura 1. Anche se ci sono ancora diverse cime visibili del campione di controllo negativo, l'intensità e il numero di picchi sono ridotto se confrontato con i campioni sperimentali, mostrati in Figura 1A, B. Questi picchi derivano principalmente da sanguinare colonna, la standard interno (acido succinico-d4), FAMEs e contaminanti acidi grassi. Preparazione del campione fallito genererà uno spettro simile a quello illustrato nella Figura 1.
Tutti gli spettri sono stati pre-elaborati utilizzando MetAlign17 e dati sono stati normalizzati con il standard interno e pellet massa. Successivamente, i dati sono stati presentati a MetaboAnalyst18,19 per l'analisi statistica. Analisi delle componenti principio (PCA) mostra chiaramente che i due gruppi separano gli uni dagli altri e che non esiste nessun valore erratico in entrambi i gruppi (Figura 2A). Ulteriore analisi mostra cambiamenti significativi in metaboliti conosciuti per essere colpiti da perdita di dLDH (Figura 2B)4.
Figura 1 : Spettri di rappresentante GC-MS di Drosophila Estratto di larvale. (A-B) Spettri tipici di metà-L2 larvale estratti da wild type (WT) e mutanti di dLDH (KO). (C) un rappresentanza spettro GC-MS generato da un campione di controllo negativo (NC). La maggior parte delle cime in questo spettro sono da standard interno, FAMEs ed acidi grassi. (D-F) Quando rispetto ai campioni di WT, l'esposizione di campioni di KO elevati livelli del piruvato (D) e diminuzione dei livelli di lattato (E) e (F) 2-idrossiglutarato (2-HG). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi statistica mostra i differenti profili metabolici tra wild type (WT) e dLDH larve di knockout (KO). (A) trama di punteggi PCA. Metaboliti (B) che presentano cambiamenti significativi nei mutanti di dLDH . Tutti i punti dati vengono tracciati rispetto alla media del controllo WT, che è stato registrato su un valore arbitrario di 100. Prima dell'analisi, i dati è stati normalizzati per l'acido succinico-d4 interna standard e larvale a pellet massa. Dati riportati come media ± una deviazione standard. p < 0.01 per tutti i metaboliti utilizzando un due code t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Metabolomica fornisce un'opportunità senza precedenti per sorvegliare le reazioni metaboliche che compongono il metabolismo intermedio. La sensibilità di questa tecnologia, tuttavia, rende i dati suscettibili di background genetico, stecche inerente allo sviluppo e una varietà di stress ambientali, tra cui temperatura, umidità, densità della popolazione e disponibilità di nutrienti. Di conseguenza, un'alta qualità e riproducibili metabolomica analisi richiedono che i campioni raccolti in condizioni altamente controllate. Mentre diverse recensioni sottolineano questo punto3,8,23, qui forniamo un metodo passo passo per la raccolta di larve che è stato progettato per garantire la riproducibilità.
La fonte più comune di variabilità in un'analisi metabolomica deriva da un errore per placare o interrompere, reazioni metaboliche dopo che il campione è raccolto. A questo proposito, metabolismo si ferma al congelamento in azoto liquido e degli enzimi metabolici verranno eliminati quando il campione è omogeneizzato in metanolo-20 ° C. Supponendo che l'utente presta particolare attenzione a mantenere un campione congelato prima dell'estrazione di metanolo, il nostro protocollo è progettato per garantire che i dati di metabolomica generati da questa procedura rappresentano un'istantanea precisa del metabolismo larvale. Se l'utente riscontrano livelli inaccettabili di variabilità dei dati, l'utente dovrebbe riesaminare il protocollo di estrazione di collezione e metabolita con particolare attenzione a garantire (1) che il metabolismo è rapidamente estiguuti (passaggi 2.9 – 4.2) e (2) che il campione in modo efficiente è omogeneizzato in metanolo al 90% (punto 4.4). A questo proposito, molti mulini del branello forniscono forza insufficiente per omogeneizzare campioni entro il tempo specificato e incoraggiamo l'utente a utilizzare uno strumento che è stato utilizzato in precedenti studi8.
Il nostro protocollo evidenzia anche passaggi chiave che l'utente inesperto deve notare al fine di derivatizzare riproducibile campioni. Ciò è essenziale per GC-MS perché molti metaboliti limitata volatilità o scarsa stabilità termica. Derivatizzazione aumenta la volatilità e la stabilità termica di molti metaboliti, aumentando così il numero di composti che possono essere misurati in modo riproducibile. Di conseguenza, i campioni che hanno subito la derivatizzazione incompleta esporrà forme, altezze e aree dei picchi non riproducibili. Come Sottolineiamo qui, una fonte comune di derivatizzazione fallito è l'esposizione del campione di acqua, che diminuisce l'efficienza di derivatizzazione chimica. Di conseguenza, tutti i reagenti, tra cui Sandro, MOX e piridina, devono essere mantenuti in condizioni privo di umidità. La necessità di mantenere condizioni asciutte si estende anche alla preparazione dei campioni sono conservati a-80 ° C, che dovrebbe essere collocato in una centrifuga vuoto per 30 min prima dell'apertura per assicurare che la condensa non entri il campione. Vorremmo anche sottolineare che GC-MS è una tecnologia sensibile, e di conseguenza, i più grandi campioni non genererà necessariamente dati migliori. Il nostro protocollo fornisce le dimensioni campione sperimentalmente testato e riproducibile misurerà la maggior parte dei metaboliti nel metabolismo del carbonio centrale. Alcuni di questi metaboliti sono molto abbondanti e dimensione del campione maggiorato porterà a saturazione nello spettro del segnale. Infatti, il segnale per il trealosio è già saturo nella nostra analisi e un rapporto di divisione di 100: 1 per iniezione di GC-MS deve essere utilizzato con precisione per misurare questo composto. Infine, l'utente dovrebbe notare che perché utilizziamo una soluzione di estrazione polare, il nostro protocollo non è appropriato per l'estrazione dei lipidi. Il nostro protocollo inoltre non tiene conto per acidi grassi contaminanti che potrebbero essere presenti su tubi di plastica e consigli, motivo per cui alcuni segnali di acido grasso appaiono nel campione di controllo negativo (Figura 1B).
Infine, i metodi dettagliati qui fornisce un potente strumento per studiare il metabolismo di Drosophila . Questo protocollo, tuttavia, non è specifico di Drosophila e può essere utilizzato con poche modifiche per lo svolgimento di studi metabolici in qualsiasi piccolo invertebrato. Indipendentemente dalla specie, questo semplice metodo consente una quantificazione relativa di quasi tutti gli aminoacidi, i mediatori nella glicolisi e ciclo del TCA, come pure un numero di altre piccole molecole polari. Quando combinato con l'impareggiabili strumenti genetici disponibili per la comunità di Drosophila , questo tipo di analisi metabolomica pone al volo all'avanguardia della ricerca metabolica per il prossimo futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Grazie ai membri dell'impianto di spettroscopia massa di Indiana University e la University of Utah metabolomica Core Facility per assistenza nell'ottimizzazione di questo protocollo. J.M.T. è supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numero R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
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