Summary
Este protocolo describe cómo preparar larvas de Drosophila para análisis metabolómicos basadas en GC-MS.
Abstract
Los avances recientes en el campo de la metabolómica han establecido la mosca de la fruta Drosophila melanogaster como modelo genético poderoso para el estudio de metabolismo de los animales. Combinando la amplia gama de herramientas genéticas Drosophila con la capacidad para examinar grandes áreas del metabolismo intermediario, una aproximación metabolómica puede revelar las interacciones complejas entre dieta, genotipo, eventos de la historia de vida y señales ambientales. Además, estudios de metabolómica pueden descubrir nuevos mecanismos enzimáticos y descubrir conexiones previamente desconocidas entre vías metabólicas aparentemente dispares. Para facilitar el uso más generalizado de esta tecnología entre la comunidad de Drosophila , aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe cómo preparar muestras de larvas de Drosophila para cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)- basado en análisis metabolómicos. Nuestro protocolo incluye descripciones de muestras larvarias, extracción del metabolito, derivatización química y análisis por GC-MS. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a los usuarios medir la abundancia relativa de pequeños metabolitos polares, como aminoácidos, azúcares y ácidos orgánicos participan en la glucólisis y el ciclo TCA.
Introduction
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema ideal para estudiar el mecanismo molecular que regula el metabolismo intermediario. No se conservan más rutas metabólicas entre Drosophila y los seres humanos sólo sensores de nutrientes claves y reguladores del crecimiento, tales como insulina, Tor y myc, que también son activos en la mosca1,2. Como resultado, Drosophila puede utilizarse para explorar la base metabólica de enfermedades humanas que van desde la diabetes y la obesidad a cáncer y la neurodegeneración. En este sentido, el desarrollo larvario de Drosophila proporciona el marco ideal estudiar un programa metabólico conocido como glucólisis aeróbica, o el efecto de Warburg. Como muchos tumores utilizan glucólisis aeróbica para generar biomasa de hidratos de carbono, así que para hacer Drosophila larvas activan glucólisis aeróbica para promover el crecimiento del desarrollo3,4,5. Estas similitudes entre larvas y tumor metabolismo establecer Drosophila como un modelo clave para entender cómo aeróbico glucólisis es regulada en vivo.
A pesar de que la mosca se ha convertido en un modelo popular para el estudio de metabolismo, mayoría de Drosophila los estudios dependen de los métodos que están diseñados para medir los metabolitos3, como la trehalosa, triglicéridos o ATP. Puesto que se requiere un protocolo específico para medir cada metabolito, estudios basados en análisis son mano de obra intensiva, caros y sesgada hacia los compuestos que se pueden medir utilizando kits comerciales. Una solución a estas limitaciones ha surgido desde el campo de la metabolómica, que proporciona un medio más eficaz e imparcial estudio de metabolismo de Drosophila . A diferencia de un estudio basado en el análisis, un análisis metabolómicos solo puede medir cientos de metabolitos de molécula pequeña y simultáneamente proporcionar una comprensión global de estado metabólico6,7 de un organismo. Esta técnica ha ampliado considerablemente el alcance de los estudios metabólicos de Drosophila y representa el futuro de este emergente campo8.
Estudios metabolómicos se realizan principalmente utilizando tres tecnologías: (i) resonancia magnética nuclear (RMN), (ii) líquida cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS) y (iii) cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)9. Cada enfoque ofrece ventajas y desventajas, y todas estas tecnologías se han utilizado para estudiar con éxito metabolismo de Drosophila . Puesto que las investigaciones realizadas en nuestro laboratorio se centra en metabolitos polares, pequeñas, principalmente empleamos un método GC-MS-basado. GC-MS proporciona al usuario con un número de ventajas, como alta reproducibilidad, máxima resolución, sensibilidad, y la disponibilidad de una biblioteca de espectros de impacto (EI) de electrón estándar, permite la identificación rápida de descubrieron el metabólico características10,11. La preparación de muestras para GC-MS, sin embargo, es algo compleja y requiere una atención cuidadosa al detalle. Muestras y deben realizarse, lavadas, pesadas, congeladas en una manera que sacia rápidamente reacciones metabólicas. Además, el cadáver de mosca es resistente a los protocolos estándar de la homogeneización y requiere un molino de grano para extracción del metabolito óptima. Por último, las muestras analizadas por GC-MS deben someterse a derivatización química antes de detección12. Mientras que métodos previamente publicados describen todos estos pasos3,13,14, todavía es necesario un protocolo visual que permita al usuario principiante reproducible generar datos de alta calidad. Aquí demostramos cómo preparar muestras de larvas de Drosophila para análisis metabolómica basada en GC-MS. Este protocolo permite al usuario medir reproducible muchos de los pequeños metabolitos polares que componen el metabolismo central de carbono.
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Protocol
1. huevo de colección
- Recoger los machos adultos y hembras vírgenes de los genotipos deseados. Individualmente la edad estos animales en un frasco de comida con medios estándar de Bloomington durante 3 – 5 días.
- Configurar los apareamientos adecuados mediante la transferencia de 25 machos y 50 hembras vírgenes a un nuevo frasco de alimento.
Nota: Un mínimo de seis acoplamientos independientes se debe establecer para cada genotipo. Se recogerán sólo una muestra de cada apareamiento (es decir, seis muestras de seis acoplamientos independientes). -
Preparar tapas de melaza puesta de huevos.
- 115 mL de melaza y 29 g de agar con 700 mL de H2O en un matraz de 2 L de la mezcla.
- Hervir la melaza mezcla de agar en una placa caliente.
- Enfriar a 70 ° C.
- Añadir 25 mL de mezcla ácida (20 mL de ácido fosfórico 85% y el ácido propiónico 209 mL en 1 L de H2O; Almacene en una botella marrón) y 10 mL de éster del ácido p-hidroxi-benzoico metil 10% en etanol al 95%.
- Verter el agar melaza en parte de la tapa y el fondo de un plato de cultivo de tejidos de 35 x 10 mm2 .
Nota: Antes de verter la melaza placas de agar, asegúrese de que las tapas y/o de la base de la placa de 35 x 10 mm2 ajustarse perfectamente en la boca de una botella de stock de Drosophila (descrita en paso 1.6). Dependiendo de la marca de placas usadas, la base podría no ser utilizable.
- Activar la levadura fresca pasta añadiendo agua destilada a la levadura seca (5 g levadura/7 mL de agua) hasta que la mezcla se convierte en una pasta que se puede propagar fácilmente sobre una superficie sólida (es decir, la consistencia de la mantequilla de maní).
- Se separó aproximadamente 1,5 g de levadura de pasta en la superficie de una tapa de melaza puesta de huevos.
- Meter cuatro agujeros de aire en lados opuestos de un plástico 6 onzas Drosophila stock botella utilizando una aguja de 22 G.
- Transferir las moscas recién fecundadas del frasco de comida en frascos de cultivo.
Nota: Moscas pueden ser transferidas ya sea por uso de CO2 como un anestésico temporal o sujetando la parte superior del frasco en la boca de la botella y golpeando fuertemente el fondo de la botella contra un banco. - Rápidamente Coloque un casquillo de puesta de huevos de melaza con pasta de levadura en la superficie en la boca de una botella de stock de Drosophila . Utilice cinta de laboratorio para asegurar la tapa puesta de huevos en el lugar.
Nota: Si moscas fueron anestesiados antes de la transferencia, la botella debe colocarse horizontalmente en el Banco hasta que se han recuperado todas moscas. Una vez que las moscas son totalmente móviles, coloque la botella en una incubadora con la tapa puesta de huevos de melaza en la parte inferior de la cultura. - Vuelva a colocar el tapón de puesta de huevos de melaza por lo menos una vez al día durante los primeros dos días invirtiendo la botella de stock, golpeando el fondo de la botella contra la mesa, quitar la tapa de huevo viejo e inmediatamente colocar una nueva tapa de huevo en la boca de la botella. Deseche la vieja gorra de puesta de huevos.
Nota: Este paso garantiza que las hembras no tienen sus huevos y permite la colección de poblaciones sincronizadas. - Coloque una tapa nueva puesta de huevos dentro de la botella de stock después de día 3, reemplazar después de 2 h y deseche. Quite y vuelva a colocar la segunda tapa de puesta de huevos después de cuatro horas. Etiqueta de la parte inferior de este tapón de puesta de huevos con la fecha, la hora y el genotipo.
Nota: Los huevos recogidos durante esta ventana de 4 h se utilizará para el análisis. Este paso de sincronización es crítica para el análisis de etapas de desarrollo específicas. Huevos pueden recogerse de este modo durante varios días. - Inserte los tapones de puesta de huevos en una placa de Petri 60 x 15 mm2 y coloque en una incubadora a la temperatura y la humedad.
- Inspeccione las tapas de puesta de huevos cada día por problemas de hambre, densidad de población o contaminación.
Nota: Las larvas deben tener acceso a una alimentación adecuada para garantizar su desarrollo continuo. Si es necesario, pasta de levadura fresca se puede transmitir en todas las tapas de puesta de huevos que se utilizarán en el experimento. Además, si la densidad de población de larvas es muy alta, las larvas comenzará a pasear fuera de la placa de cultivo. Estas muestras no deben utilizarse para análisis metabolómicos debido a la alta densidad de población y peleas intermedias de hambre experimentado mientras vaga resultará en datos incoherentes. Una densidad de ~ 80 – 100 medio segundo instar larvas (L2) por placa o 40 – 50 medio larvas de tercer estadio (L3) por placa es recomendable. Deben descartarse las muestras que están visiblemente contaminadas con bacterias u hongos.
2. larvas de muestrario
- Larvas de edad hasta la etapa deseada. Si recoger larvas L3, volver a sincronizar las muestras en la muda de L2 – L3. Resincronización comúnmente se logra utilizando el método anteriormente descrito que utiliza los espiráculos anteriores como un hito del desarrollo15. Como alternativa, mid L3 larvas pueden sincronizarse usando un sgs3 reportero gene16.
Nota: en este sentido, nos encontramos con larvas de mediados-L2 (~ 60 h después de la puesta de huevos) son ideales para la mayoría de los análisis porque en este momento es todavía relativamente sincrónico desarrollo larvario, las muestras cuidadosamente recogidas tienen una alimentación adecuada para desarrollar este punto y la número de animales por ejemplo es manejable (véase abajo). Un paso de sincronización adicional es necesario para las larvas L3 debido a los numerosos pulsos de ecdisona que ocurren durante el desarrollo de L3 tienen efectos dramáticos sobre el metabolismo y la generación de artefactos en poblaciones fuera de sincronización. - Utilice una aguja de disección para levantar suavemente la pasta de levadura de la agar. Coloque la levadura en una tapa nueva de agar melaza.
Nota: La mayoría de las larvas se comen en la interfase entre el agar melaza y la pasta de levadura. - Utilice un pequeño pincel para recolectar larvas de la superficie recién expuesta del agar melaza. Coloque las larvas en un tubo de centrífuga de 1.5 mL en hielo.
Nota: Tamaños de muestra adecuados para cada etapa del desarrollo son los siguientes: 50 primer instar las larvas (L1); 25 larvas de mediados-L2; larvas L3 tempranas 20; 15 mid L3 o larvas L3 finales. - Lavar y congelar las muestras (pasos de 2.3 a 2.8) en lotes pequeños (4 a 6 muestras) mientras que recoge un conjunto de muestras grandes. Las muestras deben congelarse a 20 min de colocar las larvas en tubos.
Nota: Recomendamos usar tubos Eppendorf 1,5 mL Flex porque otros tubos pueden interferir con la transferencia de la muestra en el paso 3. Las muestras deben recogerse en tubos de microcentrífuga. No recoja muestras en los tubos de cuentas descritos en el paso 3.1. Granos de cerámica conservan la solución de lavado NaCl, que resulta en mediciones inexactas de masa e introduce contaminantes en la muestra. - Añadir 1 mL de helado 0.9% NaCl en el tubo, cierre la tapa y voltear verticalmente el tubo a bien para lavar las larvas.
- Coloque el tubo en hielo por 30 ~ s. Durante este tiempo, las larvas se hundirán hasta el fondo del tubo, pero levadura permanecerá en suspensión. Una vez que todas las larvas han formado un pellets sueltos, retirar la solución de NaCl con una pipeta de 1 mL.
- Repita el paso 2.4 y 2.5 de paso dos veces, o hasta que la solución de lavado final es claro.
Nota: Los pasos de lavado adicional pueden ser necesarios si la muestra recogida contiene una cantidad excesiva de levadura. - Centrifugar las muestras a 2.000 × g durante 1 min a 4 ° C.
- Retire todo resto de solución con una pipeta de 200 μl.
- Congelar inmediatamente la muestra en nitrógeno líquido.
Nota: El protocolo se puede detener en este paso. Las muestras pueden almacenarse hasta por 3 meses a-80 ° C.
3. transferencia de muestras a tubos de grano
- Cada muestra de larvas debe ser transferido desde el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a un tubos de ciegas de 2 mL que contiene granos de cerámica 1,4 mm. En preparación para esta etapa de transferencia, utilice un marcador a prueba de etanol para etiquetar al lado de un tubo de 2 mL ciegas grano (marcas en la tapa se destruirán durante el paso 4.4).
- Tara la masa del tubo etiquetado grano utilizando una balanza analítica capaz de medir con precisión de 0.01 mg.
- Si muestras larvarias fueron almacenadas a-80 ° C, colocar tubos en antes de nitrógeno líquido para transferir.
- Utilice pinzas largas para quitar el tubo de muestra de 1,5 mL de nitrógeno líquido dewar.
- Usando guantes de nitrilo, agarrar el congelado tubo, invertir y libra fuertemente la tapa del tubo contra la mesa para desalojar a los pellets congelados. Inmediatamente Vierta el sedimento en un tubo de bolas ciegas 2 mL previamente tarado. Si el precipitado no desalojar, regresar el tubo al nitrógeno líquido y repita.
Nota: Perdigones larvas no se expulse de todos los tubos de microcentrífuga. Si mediante un tubo que no sea el recomendado, determinar si retirar larvas pellets antes de recoger muestras para análisis. - Medir rápidamente la masa combinada del tubo larval de pellet y grano. Coloque inmediatamente el tubo de la muestra en nitrógeno líquido. La pelotilla larvas masa servirá para normalizar los datos metabolómicos.
Nota: El protocolo se puede detener en este paso. Las muestras pueden almacenarse hasta por 3 meses a-80 ° C.
4. extracción de la muestra
- Colocar los tubos de muestra en un trabajo de-20 ° C más frío.
- Agregar 0,8 mL de prechilled (-20 ° C) 90% metanol que contiene ácido succínico-d4 de 2 μg/mL en cada tubo. Retomar la muestra el trabajo de-20 ° C más frío.
Nota: El ácido succínico-d4 sirve como estándar interno. Utilice sólo HPLC grado H2O y metanol. Metanol y otros disolventes orgánicos son volátiles y difíciles de medir con precisión utilizando pipetas de desplazamiento de aire, se recomienda utilizar pipetas de desplazamiento positivo para este paso y todos los pasos siguientes. - Establecer un control negativo por agregar 0,8 mL de prechilled (-20 ° C) 90% metanol que contiene ácido succínico-d4 de 2 μg/mL en un tubo de vacío del grano.
- Homogeneizar las muestras durante 30 segundos a 6.45 m/s utilizando un homogeneizador de molino de grano en una sala de control de temperatura de 4 ° C.
Nota: Falta rápidamente y completamente homogeneizar el sedimento larval es una fuente común de variabilidad en el análisis de la metabolómica. Sólo utilizar homogeneizadores que son capaces de destruir congelado el tejido larval dentro de los 30 s. - Retomar los tubos de las muestras homogeneizadas del benchtop de-20 ° C más frío e incubar en un congelador de-20 ° C durante al menos 1 h.
- Centrifugar los tubos a 20.000 × g o máxima velocidad durante 5 minutos a 4 ° C para eliminar el precipitado resultante.
- Transferir 600 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL. No molestar el precipitado. Si el sedimento precipitado se desaloja al pipetear el sobrenadante, volver todos sobrenadante en el tubo y repita el paso 4.6.
- Colocar los tubos de muestra en una centrífuga de vacío. Asegúrese de que todos los tubos están abiertos antes de sellar la centrifugadora. Secar las muestras a temperatura ambiente hasta que se quite todo solvente (este paso suele ~ 16 h para completar).
Nota: Si es necesario, el protocolo puede hacer una pausa en este paso. Muestra seca puede almacenarse a-80 ° C.
5. química derivatización
- Si las muestras secas fueron almacenadas a-80 ° C, coloque tubos sin abrir en una centrífuga de vacío y secar durante 30 minutos. Este paso debe realizarse antes de abrir el tubo de muestra.
Nota: Este paso elimina la condensación que se acumula en el exterior del tubo de microcentrífuga Cuando retira del congelador. Esta parte del protocolo es extremadamente sensible a H2O y precaución adicional se debe mantener los reactivos tan secas como sea posible. -
Preparar una solución de clorhidrato de methoxylamine de 40 mg/mL (MOX) en piridina anhidra. Sólo utilizar piridina anhidra. Guarde los MOX y piridina en un desecador y preparar diariamente la solución MOX.
PRECAUCIÓN: MOX y piridina son tóxicos. Preparar esta solución en la campana.- Use una pistola de calor para secar una jeringa de vidrio de 1 mL.
- Inserte la aguja de la jeringa en el frasco de la piridina anhidra. Retirar 1 mL de piridina y añadir a un tubo de microcentrífuga que contiene 40 mg de MOX.
- Enjuagar la botella de la piridina anhidra con argón. Sello de la botella y volver en el desecador.
- Disolver el MOX en la piridina por incubando el tubo en un mezclador termal a 35 ° C durante 10 minutos a 600 rpm.
- Agregar 40 μl de MOX de 40 mg/mL en solución de piridina anhidra a la muestra seca.
- Vortex de 10 s y brevemente centrífuga (10.000 x g durante 20 s).
- Incubar a 30 ° C por 1 h a 600 rpm en un mezclador térmico.
- Centrifugue a 20.000 x g o velocidad máxima durante 5 minutos eliminar las partículas.
- Transferencia 25 μl del sobrenadante en un frasco muestreador automático con un inserto de microvolume de vidrio de 250 μl desactivado.
- Agregar 40 μl de N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) que contiene 1% TMCS.
PRECAUCIÓN: MSTFA es tóxico. Realizar este paso en la campana.
Nota: Si está disponible, este paso puede ser completado por un automuestreador de Gerstel. - Coloque una tapa en el frasco muestreador y sellar usando una herramienta de prensado.
- Incubar la muestra a 37 ° C durante 1 hora con agitación (250 rpm).
- Preparar un ácido graso metil ester (famas) solución como anteriormente desceribed3. Agregar 3 μl de famas para el frasco muestreador automático utilizando un muestreador automático robótica inmediatamente antes de la inyección.
Nota: Famas se utilizan para calibrar el cambio de tiempo de retención y compruebe el funcionamiento del instrumento. Si no se dispone de ningún muestreador automático robótico, FAMAS pueden agregarse durante paso 5.8.
6. detección de GC-MS de
Nota: En la mayoría de los casos, el usuario llevará a cabo este paso con la ayuda de una instalación de base de espectrometría de masas. Este protocolo está diseñado para ser utilizado con una columna de GC con una precolumna de 5 m de 30 m.
- Aleatorizar el orden de la muestra.
-
Preparar el GC-MS.
- Conjunto la tasa de flujo de gas de helio portador a 1 mL/min.
- Ajustar la temperatura de entrada a 250 ° C.
- Programa de la GC para ejecutar el siguiente gradiente de temperatura:
- Temperatura inicial a 95 ° C con una espera de 1 minuto.
- Aumentar la temperatura a 110 ° C a una velocidad de 40 ° C/min con una espera de 2 minutos.
- Aumentar a 250 ° C 5° C/min rampa.
- Aumentar a 330 ° C a una velocidad de 25 ° C/min con una mano final de 4 minutos.
- Programe un retraso de solvente a 3,5 min.
Nota: Puede cambiar la hora según el sistema de GC-MS. El propósito de este paso es evitar MSTFA y MOX dañe el detector.
- Inyectar 1 μl de la muestra derivatizada en GC-MS (split proporción 10:1).
Nota: Inyecte 2 μl de la muestra si la intensidad de los picos es demasiado baja. El orden de inyección de muestras debe ser al azar. - Operar el espectrómetro de masas en el modo de exploración completa en un rango de masas de 50 a 500 m/z.
7. Análisis de datos
- Analizar datos metabolómicos utilizando ya sea un enfoque objetivo o no focalizado. Análisis objetivo se centra en medir la abundancia de un conjunto definido de metabolitos, como las mediciones de lactato que describimos a continuación. En contraste, el análisis no focalizado utiliza un enfoque imparcial para identificar cualquier característica metabólica que es cambiado de forma significativa entre dos conjuntos de la muestra.
Nota: Nuestro laboratorio utiliza principalmente los programas gratis MetAlign17 y18,de MetaboAnalyst19 para análisis de datos. Puesto que una descripción adecuada de la control de calidad, normalización y pasos de procesamiento de datos fuera del alcance de este manuscrito, nos referimos al usuario a protocolos más detallados que se dedican al procesamiento de datos20,21, 22. Además, un diagrama de flujo que describe los pasos necesarios para este análisis se puede encontrar en otra parte8.
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Representative Results
Lactato deshidrogenasa (dLDH) mutantes, que carecen de dLDH actividad4y controles emparejados genéticamente fueron recogidos como larvas de mediados-L2 y procesadas según protocolo descrito anteriormente. Comparación con controles, larvas mutantes exhiben cambios significativos en el lactato, piruvato y L-2-hydroxyglutarate4. Los espectros fueron adquiridos con un sistema Agilent GC6890-5973i MS. Un ejemplo de los espectros de GC-MS generar con nuestro protocolo se muestra en la figura 1. Son muchos los rasgos visibles y un notable pico de trehalosa, que normalmente representa el pico más grande de una muestra de larvas y suele ser sobresaturado (figura 1AB). El espectro individual de muestra control negativo se muestra en la figura 1. Aunque todavía hay varios picos visibles en la muestra control negativo, la intensidad y el número de picos se reducen en comparación con las muestras experimentales que se muestra en la figura 1A, B. Estos picos principalmente resultan de sangrado de la columna, el estándar interno (ácido succínico-d4), famas y contaminantes ácidos grasos. Preparación de la muestra va a generar un espectro similar al que se muestra en la figura 1.
Los espectros fueron preprocesados usando MetAlign17 y los datos se normalizaron con el estándar interno y pellets de masa. Posteriormente, los datos fueron sometidos a MetaboAnalyst18,19 para el análisis estadístico. Análisis de componentes de principio (PCA) muestran claramente que los dos grupos se separan unos de otros y que no hay aislados en ninguno de los grupos (figura 2A). Análisis muestra importantes cambios en los metabolitos conocidos afectados por pérdida de dLDH (figura 2B)4.
Figura 1 : Espectros de representante GC-MS de Drosophila Extracto larval. (A-B) Extractos de espectros típicos de mediados-L2 larvas de tipo salvaje (WT) y dLDH mutantes (KO). (C) un representante de GC-MS espectro generado a partir de una muestra control negativa (NC). La mayoría de las cimas de este espectro son de estándar interno, famas y ácidos grasos. (D-F) En comparación con las muestras de peso, la exposición de muestras de KO niveles elevados de piruvato (D) y disminución de los niveles de lactato (E) y (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : El análisis estadístico muestra los diferentes perfiles metabólicos entre el tipo salvaje (WT) y dLDH larvas de nocaut (KO). (A) parcela de partituras PCA. Metabolitos (B) que muestran cambios significativos en dLDH mutantes. Todos los puntos de datos se trazan en relación con la media del control de peso, que se ajustó a un valor arbitrario de 100. Antes del análisis, datos se normalizaron al ácido succínico-d4 interno estándar y larval de la pelotilla de masa. Datos mostrados como media ± una desviación estándar. p < 0.01 para todos metabolitos con una cola de dos t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Metabolómica proporciona una oportunidad sin precedentes para estudiar las reacciones metabólicas que componen el metabolismo intermediario. La sensibilidad de esta tecnología, sin embargo, procesa datos susceptibles a fondo genético, claves del desarrollo y una variedad de tensiones ambientales, como temperatura, humedad, densidad de población y la disponibilidad de nutrientes. Por lo tanto, una alta calidad y reproducible metabolómica análisis requiere que las muestras se recogerán bajo condiciones altamente controladas. Mientras que varios estudios enfatizan este punto3,8,23, aquí le ofrecemos un método paso a paso para la recogida de larvas que está diseñado para garantizar la reproducibilidad.
La fuente más común de variabilidad en un análisis metabolómica proviene de una falla para apagar o detener, reacciones metabólicas después de la muestra se recoge. En este sentido, metabolismo dejará a congelación en nitrógeno líquido y las enzimas metabólicas se destruirá cuando la muestra se homogeneiza en-20 ° C metanol. Suponiendo que el usuario presta especial atención a mantener una muestra congelada antes de la extracción de metanol, nuestro protocolo está diseñado para asegurar que los datos de metabolómica generados por este procedimiento representan una instantánea precisa de metabolismo larval. El usuario experimenta niveles inaceptables de la variabilidad de los datos, el usuario debe volver a examinar el protocolo de extracción de colección y metabolito con especial atención a asegurar (1) que el metabolismo es rápidamente apagados (pasos 2.9 – 4.2) y (2) que la muestra se homogeneiza eficientemente en 90% metanol (paso 4.4). En este sentido, muchos molinos de perlas proporcionan suficiente fuerza para homogenizar las muestras dentro del tiempo especificado e incitan al usuario a utilizar un instrumento que se ha utilizado en estudios anteriores8.
Nuestro protocolo también destaca pasos clave que debe observar el usuario novato para reproducible derivatize muestras. Esto es esencial para GC-MS porque muchos metabolitos han limitado la volatilidad o la estabilidad termal pobre. Derivatización aumenta la volatilidad y estabilidad térmica de muchos metabolitos, aumentando así el número de compuestos que se pueden medir de manera reproducible. Como resultado, las muestras que han sido sometidos a derivatización incompleta exhibirá formas, alturas y áreas de pico no reproducibles. Destacamos aquí, una fuente común de error derivatización es la exposición de la muestra al agua, que disminuye la eficacia de la derivatización química. Por lo tanto, todos los reactivos, incluyendo MSTFA, MOX y piridina, deben mantenerse en condiciones libres de humedad. La necesidad de mantener condiciones de sequía se extiende también a la preparación de las muestras almacenadas a-80 ° C, que debe ser colocado en una centrifugadora de vacío 30 minutos antes de abrir para asegurarse de que la condensación no entra la muestra. También nos gustaría hacer hincapié en que GC-MS es una tecnología sensible, y como resultado muestras más grandes no necesariamente generará mejores datos. Nuestro protocolo proporciona tamaños de muestra experimentalmente probado y reproducible medirá más metabolitos en el metabolismo central de carbono. Algunos de estos metabolitos son muy abundantes y tamaño de muestra mayor dará lugar a la saturación en el espectro de la señal. De hecho, la señal de trehalosa ya está saturado en nuestro análisis y un cociente de la división de 100: 1 por GC-MS inyección debe ser utilizada para exactamente medir este compuesto. Por último, el usuario debe tener en cuenta que porque usamos una solución de extracción polar, nuestro protocolo no es apropiado para la extracción de lípidos. Nuestro protocolo también no da cuenta de los contaminantes ácidos grasos que podrían estar presentes en los tubos de plástico y puntas, razón por la cual algunas señales de ácidos grasos aparecen en la muestra de control negativo (figura 1B).
Por último, los métodos detallados aquí proporciona una poderosa herramienta para el estudio de metabolismo de Drosophila . Este protocolo, sin embargo, no es específico de Drosophila y puede utilizarse para llevar a cabo estudios metabólicos en cualquier invertebrado pequeño con pocas modificaciones. Independientemente de la especie, este sencillo método permite la cuantificación relativa de casi todos los aminoácidos, intermediarios en la glucólisis y el ciclo TCA, así como un número de otras pequeñas moléculas polares. Combinado con el inigualable herramientas genéticas disponibles a la comunidad de Drosophila , este tipo de análisis metabolómico pone la marcha a la vanguardia de la investigación metabólica en el futuro previsible.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Gracias a los miembros de la Indiana Universidad masa espectroscopia y la Universidad de Utah metabolómica base para ayuda en la optimización de este protocolo. J.M.T. es apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
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