Summary
Det här protokollet beskriver hur du förbereder Drosophila larver för GC-MS-baserade metabolomiska analys.
Abstract
Senaste framstegen inom metabolomik har etablerat bananflugan Drosophila melanogaster som en kraftfull genetisk modell för att studera djurens ämnesomsättning. Genom att kombinera det stora utbud av Drosophila genetiska verktyg med förmåga att kartlägga stora strängar av intermediär ämnesomsättning, kan en metabolomik strategi avslöja komplexa interaktioner mellan kost, genotyp, livshistoria händelser och miljömässiga ledtrådar. Dessutom kan metabolomik studier upptäcka nya enzymatiska mekanismer och avslöja tidigare okända anslutningar mellan till synes disparata metaboliska vägar. För att underlätta mer utbredda användningen av denna teknik bland gemenskapens Drosophila , här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som beskriver hur du förbereder Drosophila larval prover för gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)- baserat metabolomiska analys. Våra protokoll innehåller beskrivningar av larval provsamling, metabolit utvinning, kemiska derivatisering och GC-MS analys. Framgångsrika slutförandet av detta protokoll kommer att tillåta användare att mäta det relativa överflödet av små polära metaboliter, inklusive aminosyror, sockerarter och organiska syror inblandade i glykolys och TCA cykler.
Introduction
Bananflugan Drosophila melanogaster har vuxit fram som ett idealiskt system för att studera den molekylära mekanismen som reglerar intermediär ämnesomsättning. Inte bara bevaras de flesta metaboliska vägar mellan Drosophila och människor, men viktiga näringsämnen sensorer och tillväxtreglerande, såsom insulin, Tor och myc, är också aktiva i flyga1,2. Drosophila kan därför användas för att utforska metabola grunden för mänskliga sjukdomar allt från diabetes och fetma till neurodegeneration och cancer. I detta avseende ger Drosophila larval utveckling den idealiska ramen att studera en metabolisk program som kallas aerob glykolys eller Warburg effekt. Precis som många tumörer använder aerob glykolys generera biomassa från kolhydrater, så aktivera gör Drosophila larver aerob glykolys för att främja utvecklingsmässiga tillväxt3,4,5. Dessa likheter mellan larver och tumör metabolism etablera Drosophila som en viktig modell för att förstå hur aerob glykolys är reglerade i vivo.
Trots det faktum att flugan har vuxit fram som en populär modell för att studera metabolism, de flesta Drosophila studier förlitar sig på metoder som är avsedda att mäta enskilda metaboliter3, såsom trehalos, triglycerider eller ATP. Eftersom ett visst protokoll krävs för att mäta varje metabolit, är assay-baserade studier arbetsintensiva, dyra och partisk mot dessa föreningar som kan mätas med kommersiella kit. En lösning på dessa begränsningar har framkommit inom metabolomik, vilket ger ett mer effektivt och opartiskt sätt att studera Drosophila metabolism. Till skillnad från en test-baserad studie, kan en enda metabolomiska analys samtidigt mäta hundratals småmolekylära metaboliter och tillhandahålla en omfattande förståelse av en organisms metaboliska status6,7. Denna teknik har avsevärt utökat tillämpningsområde Drosophila metabola studier och representerar framtiden för denna framväxande fält8.
Metabolomiska studier utförs främst med tre tekniker: a kärnmagnetisk resonans (NMR), (ii) flytande kromatografi-masspektrometri (LC-MS) och (iii) gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)9. Varje strategi erbjuder tydliga fördelar och nackdelar, och alla dessa tekniker har använts framgångsrikt studera Drosophila metabolism. Eftersom den forskning som bedrivs i vårt labb är inriktad på små, polära metaboliter, anställer vi främst en GC-MS-baserad metod. GC-MS ger användaren ett antal fördelar, inklusive hög reproducerbarhet, peak upplösning, känslighet, och tillgången till en standard elektron inverkan (EI) spektrala bibliotek, vilket möjliggör snabb identifiering av upptäckte metabola funktioner10,11. Beredning av prover för GC-MS, men är ganska komplicerat och kräver en noggrann uppmärksamhet på Detaljer. Prover måste samlas in, tvättas, vägde, och frysta på ett sätt som snabbt släcker metaboliska reaktioner. Dessutom flyga kadavret är resistent mot standard homogenisering protokoll och kräver en pärla kvarn att säkerställa optimal metabolit extraktion. Slutligen måste prover analyseras av GC-MS genomgå kemiska derivatisering före identifiering12. Medan tidigare publicerade metoder beskriva alla dessa steg3,13,14, krävs fortfarande en visuell protokoll som skulle tillåta nybörjarens reproducibly generera data av hög kvalitet. Här visar vi hur att förbereda Drosophila larval prover för GC-MS-baserad metabolomik analys. Detta protokoll tillåter användaren att reproducibly mäta många av de små polära metaboliter som komponera centrala kol metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ägg insamling
- Samla vuxna hannar och jungfruliga hondjur av de önskade genotyperna. Individuellt ålder dessa djur i en injektionsflaska av mat med standard Bloomington media för 3 – 5 dagar.
- Ställ in den lämpliga parningar genom att överföra 25 och 50 jungfruliga hondjur till en ny mat-injektionsflaska.
Obs: Ett minimum av sex oberoende parningar bör inrättas för varje genotyp. Endast ett prov kommer att samlas in från varje parning (dvs sex prover som tagits från sex oberoende parningar). -
Förbereda melass äggläggningen caps.
- Blanda 115 mL melass och 29 g agar med 700 mL H2O i en 2 L kolv.
- Koka melass agar blandningen på en värmeplatta.
- Kyl till 70 ° C.
- Tillsätt 25 mL syra mix (20 mL 85% fosforsyra och 209 mL propionsyra i 1 L H2O; Förvaras i en brun flaska) och 10 mL 10% p-hydroxy-benzoic acid methyl Ester i 95% etanol.
- Häll melass ägarn i både locket och botten delen av en 35 x 10 mm2 vävnadsodling maträtt.
Obs: Innan hälla melass agarplattor, vara säker på att den lock eller bas av 35 x 10 mm2 plattan passar snuggly i munnen på en Drosophila lager flaska (som beskrivs i steg 1,6). Olika märken av plattor används, kanske basen inte kan användas.
- Göra färsk jäst klistra in genom att lägga till destillerat vatten till aktiv torrjäst (5 g jäst/7 mL vatten) tills blandningen blir en pasta som lätt kan spridas på ett fast underlag (dvs, konsekvens av jordnötssmör).
- Spridning ca 1,5 g jäst pasta på ytan av en melass äggläggningen cap.
- Sticka fyra lufthål i motsatta sidor av en plast 6 oz. Drosophila lager flaska med hjälp av en 22 G nål.
- Över de nya Parade flugorna från injektionsflaskan med mat till kultur flaskor.
Obs: Flugor kan överföras genom att antingen använda CO2 som en tillfällig bedövningsmedel eller genom håller toppen av flaskan i munnen av flaskan och knacka kraftigt på botten av flaskan mot en bänkmonterade. - Snabbt placera en melass äggläggningen mössa med jäst pasta på ytan i munnen på en Drosophila lager flaska. Använda laboratorium tejp för att säkra äggläggningen locket på plats.
Obs: Om flugor var sövda före att överföra, flaskan bör placeras horisontellt på bänkmonterade tills alla flugor har tillfrisknat. När flugor är helt mobil, placera flaskan i en inkubator med melass äggläggningen locket längst ned på kulturen. - Hättan på melass äggläggningen minst en gång om dagen för de första två dagarna av Invertera lager flaskan, att knacka på botten av flaskan mot bänkmonterade, avlägsnande av gamla ägg locket och placera omedelbart badmössa nya ägg i munnen av flaskan. Kassera den gamla äggläggningen cap.
Obs: Det här steget säkerställer att kvinnor inte håller sina ägg och möjliggör insamling av synkroniserade populationer. - Placera en ny äggläggningen lock i lager flaskan efter dag 3, Ersätt efter 2 h, och kassera. Ta bort och ersätta andra äggläggningen locket efter fyra timmar. Etikett längst ned på denna äggläggningen keps med datum, tid och genotyp.
Obs: Ägg som samlats in under 4 h fönstret kommer att användas för analys. Detta synkronisering är kritisk för att analysera specifika utvecklingsstadier. Ägg kan samlas på detta sätt i flera dagar. - Infoga de äggläggande locken i en 60 x 15 mm2 Petri plattan och plats i en inkubator på önskad temperatur och luftfuktighet.
- Inspektera äggläggningen mössor varje dag för problem med svält, befolkningstäthet eller kontaminering.
Obs: Larver måste ha tillgång till tillräcklig föda att säkerställa kontinuerlig utveckling. Om nödvändigt, kan färsk jäst pasta spridas på äggläggningen versaler som används i experimentet . Dessutom om Pseudocoremia befolkningstätheten är för hög, börjar larverna vandra ut ur kultur plattan. Dessa prover bör inte användas för metabolomiska analys eftersom de hög befolkningstäthet och mellanliggande anfall av svält upplevt när de vandrande kommer leda till inkonsekventa data. En densitet på ~ 80 – 100 mellersta andra instar larver (L2) per platta eller 40 – 50 mellersta tredje instar larver (L3) per platta rekommenderas. Prover som är synbart förorenat med bakterier eller svamp ska kasseras.
2. larval provsamling
- Ålder larverna tills önskad scenen. Om samlande L3 larver, synkronisera prover på de L2-L3 molt. Omsynkroniseringen uppnås vanligen med hjälp av en tidigare beskrivna metod som använder de främre trakeer som en utvecklande milstolpe15. Alternativt, mid-L3 larver kan synkroniseras med en sgs3 reporter gen16.
Obs: I detta hänseende finner vi mitten av-L2 larverna (~ 60 h efter äggläggning) är idealisk för de flesta analyser eftersom larver utveckling är fortfarande relativt synkron i detta skede, omsorgsfullt insamlade prover har tillräcklig föda utvecklas till denna tidpunkt, och antalet djur per prov är hanterbar (se nedan). Ett ytterligare synkronisering steg är nödvändigt för L3 larver eftersom många ecdysone pulserna som inträffar under L3 utveckling ha dramatiska effekter på ämnesomsättning och genererar artefakter i osynkroniserade populationer. - Använd en dissekera nål försiktigt lyfta jäst pastan av ägarn. Placera jästen till en ny melass agar cap.
Obs: De flesta larver äter vid gränssnittet mellan melass ägarn och jäst pastan. - Använd en liten pensel för att samla larver från den nyligen exponerade ytan av melass agar. Placera larverna i ett 1,5 mL centrifugrör på is.
Obs: Lämpliga urvalsstorlekar för varje utvecklingsfas är följande: 50 första instar larver (L1); 25 mid-L2-larver; 20 tidig L3 larver; 15 mid-L3 eller sena L3 larver. - Tvätta och frysa prover (steg 2.3 genom 2,8) i små partier (fyra till sex prover) medan samla en stor provuppsättning. Proverna frysas inom 20 min att placera larver i rören.
Obs: Vi rekommenderar att du använder Eppendorf 1,5 mL Flex rör eftersom andra rör kan störa prov överföringen på steg 3. Prover måste samlas i microfuge rör. Samlar inte prover i pärla rören beskrivs i steg 3.1. Keramiska pärlor behålla tvättlösningen NaCl, vilket resulterar i felaktig massa mätningar och introducerar främmande ämnen i provet. - Tillsätt 1 mL iskallt 0,9% NaCl i röret, Stäng locket och vertikalt vänd röret att noggrant tvätta larverna.
- Placera röret tillbaka på is för ~ 30 s. Under denna tid larver kommer att sjunka till botten av röret, men jäst förblir i suspension. När alla larver har bildat en löst pellet, ta bort den NaCl-lösning med 1 mL pipett.
- Upprepa steg 2.4 och 2.5 två gånger, eller tills sista tvättlösningen är klart.
Obs: Ytterligare tvätta stegen kan vara nödvändigt om det insamlade provet innehåller en överdriven mängd jäst. - Centrifugera proverna vid 2 000 × g i 1 min vid 4 ° C.
- Ta bort alla återstående lösning med 200 µL pipett.
- Genast frysa provet i flytande kväve.
Obs: Protokollet kan pausas vid detta steg. Prover kan lagras i upp till 3 månader vid-80 ° C.
3. överföring av prover till Bead rör
- Varje larval prov måste överföras från den 1,5 mL mikrofugrör till en 2 mL Skruvkapsyl rör som innehåller 1,4 mm keramiska pärlor. Förberedelse för denna överföring steg, använda en etanol-bevis markör för att märka sidan av en 2 mL Skruvkapsyl pärla tube (markeringar på locket kommer att förstöras under steg 4.4).
- Tare massa märkt pärla röret med en exakt mäta 0,01 mg Analysvåg.
- Om larver proverna förvarades vid-80 ° C, placera provrör i flytande kväve före överföring.
- Använd lång pincett bort 1,5 mL prov röret från det flytande kvävgasen dewar.
- Bära nitrilhandskar, greppa de frusna rör, Invertera och kraftigt pund tube locket mot den bänkmonterade rubba den frysta pelleten. Häll omedelbart pelleten i en pre tarerad 2 mL Skruvkapsyl pärla tub. Om pelleten inte rubba, tillbaka röret till flytande kväve och upprepa.
Obs: Larval pellets kommer inte få bort från alla microfuge rör. Om du använder en slang än den rekommenderade, avgöra om Pseudocoremia pellets kan rubbas före insamling av prov för analys. - Snabbt mäta kombinerade massa larver pellets och pärla röret. Placera omedelbart prov röret i flytande kväve. Larval pelleten massan kommer att användas för att normalisera metabolomiska data.
Obs: Protokollet kan pausas vid detta steg. Prover kan lagras i upp till 3 månader vid-80 ° C.
4. prov utvinning
- Placera provrör i ett-20 ° C bänkmonterade svalare.
- Tillsätt 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90% metanol som innehåller 2 µg/mL bärnstenssyra-d4 syra i varje rör. Flytta provet tillbaka till i-20 ° C bänkmonterade svalare.
Obs: Bärnstenssyra-d4 syran fungerar som intern standard. Endast använda HPLC grad H2O och metanol. Eftersom metanol och andra organiska lösningsmedel är flyktiga och svårt att exakt mäta använder air deplacement pipetter, rekommenderar vi att du använder positiv-deplacement pipetter för detta steg och alla följande steg. - Ställ in en negativ kontroll genom att lägga till 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90% metanol som innehåller 2 µg/mL bärnstenssyra-d4 syra i en tom pärla röret.
- Homogenisera prover för 30 andra 6,45 m/s med en pärla kvarn Homogenisatorer ligger i en 4 ° C temperatur kontrollrummet.
Obs: Underlåtenhet att snabbt och fullständigt homogenisera larval pelleten är en vanlig källa till variation i metabolomik analys. Använd endast Homogenisatorer som kan förstöra frysta larval vävnader inom 30 s. - Återgå homogeniserade prover rören till den-20 ° C bänkmonterade svalare och inkubera dem i-20 ° C frys för minst 1 h.
- Centrifugera rören på 20 000 × g eller maximal hastighet i 5 minuter vid 4 ° C för att ta bort resulterande fällningen.
- Över 600 µL av supernatanten till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör. Stör inte fällningen. Om den förhastade pelleten blir rubbas medan pipettering supernatanten, tillbaka alla supernatanten till röret och upprepa steg 4,6.
- Placera provrör i ett vakuum centrifug. Vara säker på att alla rör är öppna innan tätning centrifugen. Torka proverna i rumstemperatur tills all vätska är borta (detta steg brukar ta ~ 16 h att slutföra).
Obs: Om det behövs kan protokollet pausas vid detta steg. Torkat prov kan förvaras vid-80 ° C.
5. kemiska derivatisering
- Om de torkade proverna förvarades vid-80 ° C, placera oöppnade provrör i ett vakuum centrifug och torka i 30 min. Det här steget måste utföras innan ett prov röret.
Obs: Detta steg tar bort den kondens som samlar på utsidan av mikrofugrör när bort från frysen. Denna del av protokollet är ytterst känsliga för H2O och extra försiktighet måste vidtas för att hålla alla reagenser så torra som möjligt. -
Bered en lösning 40 mg/mL methoxylamine hydroklorid (MOX) i vattenfri pyridin. Använd endast vattenfri pyridin. Lagra MOX och pyridin i exsickator och bereda MOX-lösning dagligen.
FÖRSIKTIGHET: MOX och pyridin är giftiga. Bered lösningen i dragskåp.- Använda en värmepistol för att torka en 1 mL spruta av glas.
- Stick in nålen på sprutan i flaskan med vattenfri pyridin. Ta bort 1 mL pyridin och lägga till i ett mikrofugrör med 40 mg av MOX.
- Spola flaskan med vattenfri pyridin med argon. Förslut flaskan och återgå till exsickatorn.
- Lös MOX i pyridin genom inkubation röret i en termisk mixer vid 35 ° C i 10 min vid 600 rpm.
- Tillsätt 40 µL av 40 mg/mL MOX i vattenfri pyridin lösning till torkade provet.
- Virvel för 10 s och kort centrifug (10 000 x g för 20 s).
- Inkubera vid 30 ° C för 1 h vid 600 rpm i en termisk mixer.
- Centrifugera vid 20 000 × g eller maximal hastighet för 5 min att ta bort partiklar.
- Över 25 µL av supernatanten till en autosampler injektionsflaska med en 250 µL avaktiveras microvolume infoga.
- Tillsätt 40 µL av N- metyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) som innehåller 1% TMCS.
Varning: MSTFA är giftiga. Utför det här steget i dragskåp.
Obs: Om tillgängligt, detta steg kan utföras av en Gerstel autosampler. - Placera ett lock på autosampler injektionsflaskan och förslut med ett crimper verktyg.
- Inkubera provet vid 37 ° C i 1 timme under skakning (250 rpm).
- Förbereda en fatty acid methyl ester (FAMES) standardlösning som tidigare desceribed3. Lägga till 3 µL av FAMES autosampler injektionsflaskan med en robotic autosampler omedelbart före injektion.
Obs: FAMEs används för att kalibrera retention Timeshift och kontrollera instrument prestanda. Om det finns ingen robotic autosampler kan FAMEs läggas under steg 5,8.
6. GC-MS upptäckt
Obs: I de flesta fall, användaren kommer att genomföra detta steg med hjälp av en massa spektroskopi core facility. Detta protokoll är utformad för att användas med en 30 m, GC kolumn med en 5 m guard kolumn.
- Randomize provet ordning.
-
Förbereda GC-MS.
- Uppsättning helium carrier gasflödet till 1 mL/min.
- Ställa in inloppet temperaturen till 250 ° C.
- Programmera GC till utföra den följande temperaturgradient:
- Utgångstemperaturen till 95 ° C med tag på 1 min.
- Öka temperaturen till 110 ° C med en hastighet av 40 ° C/min med ett tag i 2 min.
- Öka till 250 ° C med 5° C min ramp.
- Öka till 330 ° C med en hastighet av 25 ° C/min med en slutlig tag i 4 min.
- Lösningsmedel fördröjning till 3,5 min.
Obs: Tiden kan ändras enligt GC-MS-systemet. Syftet med detta steg är att förhindra att MSTFA och MOX skada detektorn.
- Injicera 1 µL av derivatized provet i GC-MS (delad förhållandet 10:1).
Obs: Injicera 2 µL prov om intensiteten i topparna är för låg. Ordern injektion av prover bör vara randomiserade. - Driva masspektrometer i fullständig genomsökning läge över en massa rad 50 – 500 m/z.
7. dataanalys
- Analysera metabolomiska data med hjälp av antingen en riktade eller oriktade strategi. Riktade analysen fokuseras på att mäta överflödet av en definierad uppsättning metaboliter, till exempel de laktat mått som vi beskriver nedan. Däremot använder oriktade analys en förutsättningslös metod för att identifiera någon metabolisk funktion som ändras avsevärt mellan två provningssatser.
Obs: Vårt labb primärt använder gratis program MetAlign17 och MetaboAnalyst18,19 för dataanalys. Eftersom en adekvat Beskrivning av både kvalitetskontroll, normalisering och databehandling steg utanför ramen för detta manuskript hänvisa vi användaren till mer detaljerade protokoll som ägnas databehandling20,21, 22. Dessutom kan ett flödesschema som beskriver de steg som krävs för denna analys hittas någon annanstans8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laktatdehydrogenas (dLDH) mutanter, som saknar dLDH aktivitet4och genetiskt-matchade kontroller har samlats in som mid-L2-larver och bearbetas enligt protokoll som beskrivs ovan. Jämfört med kontroller, uppvisar muterade larver betydande förändringar i laktat och pyruvat L-2-hydroxyglutarate4. Spektra förvärvades med Agilent GC6890-5973i MS system. Ett exempel på GC-MS spektra generera med våra protokoll visas i figur 1. Det finns många synliga funktioner och en anmärkningsvärd topp för trehalos, som normalt representerar den högsta bergstoppen i ett larval prov och är oftast övermättad (figur 1AB). Enskilda spectrumen av negativa kontrollprov visas i figur 1 c. Men det finns fortfarande flera synliga topparna i det negativa kontrollprovet, reduceras intensiteten och antalet toppar jämfört med experimentella proverna visas i figur 1A, B. Dessa toppar är primärt följd av kolumn blöda, intern standard (bärnstenssyra-d4 syra), FAMEs och kontaminerande fettsyror. Misslyckade provberedning kommer att generera ett spektrum som liknar det som visas i figur 1 c.
Alla spektra var preprocessed använder MetAlign17 och data var normaliserade med intern standard och pellet massa. Därefter lämnades data till MetaboAnalyst18,19 för statistisk analys. Principen Komponentanalys (PCA) visar tydligt att de två grupperna separata från varandra och att det inte finns några avvikare i antingen grupp (figur 2A). Ytterligare analyser visar betydande förändringar i de metaboliter som visat sig påverkas av förlust av dLDH (figur 2B)4.
Figur 1 : Representant GC-MS spektra av Drosophila larver extrakt. (A-B) Typiska spektra av mid-L2 larval extrakt från vildtyp (WT) och dLDH mutanter (KO). (C) ett representativt GC-MS spektrum genereras från ett negativt kontrollprov (NC). De flesta av topparna i detta spektrum är från intern standard, FAMEs och fettsyror. (D-F) Vid jämförelse med WT prover, KO prover utställningen förhöjda nivåer av (D) pyruvat och minskade nivåer av (E) laktat och (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Statistisk analys visar de olika metaboliska profilerna mellan vildtyp (WT) och dLDH knockout (KO) larver. (A) PCA score plot. (B) metaboliter som uppvisar betydande förändringar i dLDH mutanter. Alla datapunkter ritas av genomsnittet av de WT kontroll, vilket justerades till ett godtyckligt värde på 100. Före analys, data var normaliserade till bärnstenssyra-d4 syran inre standard och larver pellet massa. Data som visas som medelvärde ± en standardavvikelse. p < 0,01 för alla metaboliter med hjälp av en tvåsidiga t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabolomik ger en oöverträffad möjlighet att kartlägga de metaboliska reaktioner som komponerar intermediär ämnesomsättning. Känsligheten hos denna teknik, återger dock data mottagliga för genetisk bakgrund, utvecklingsmässiga ledtrådar och en mängd olika miljöpåfrestningar, inklusive temperatur, luftfuktighet, befolkningstäthet och näringsämnen tillgänglighet. Därför en hög kvalitet och reproducerbara metabolomik analysen kräver att prover tas under mycket kontrollerade förhållanden. Medan flera recensioner betona denna punkt3,8,23, tillhandahåller här vi en stegvis metod för insamling av larver som syftar till att säkerställa reproducerbarhet.
Den vanligaste källan av variabilitet i en metabolomik analys härrör från ett misslyckande att släcka eller sluta, metaboliska reaktioner efter provet samlas. I detta avseende ämnesomsättning kommer att sluta vid frysning i flytande kväve och metabola enzymer kommer att förstöras när provet är homogeniserad i-20 ° C metanol. Förutsatt att användaren ägnar särskild uppmärksamhet åt att hålla ett prov som fryst före metanol extraktion, är våra protokoll utformad för att säkerställa att de metabolomics data som genereras av detta förfarande utgör en korrekt ögonblicksbild av larval metabolism. Bör användaren uppleva oacceptabla nivåer av data variabilitet, användaren bör omvärdera den samling och metaboliten extraktion protokollet med särskild uppmärksamhet ägnas garanterar (1) det ämnesomsättningen snabbt kylda (steg 2,9 – 4.2) och (2) att den provet är effektivt homogeniseras i 90% metanol (steg 4,4). I detta sammanhang många pärla mills ger tillräcklig kraft för att homogenisera prover inom angiven tid och vi uppmuntrar användaren att använda ett instrument som har använts i tidigare studier8.
Våra protokoll belyser också viktiga steg som nybörjarens måste notera att reproducibly derivatize prover. Detta är viktigt för GC-MS eftersom många metaboliter har begränsad volatilitet eller dålig termisk stabilitet. Derivatisering ökar både volatilitet och termisk stabilitet av många metaboliter, vilket ökar antalet föreningar som kan mätas reproducibly. Som ett resultat, ställer prover som genomgått ofullständig derivatisering ut icke-reproducerbara peak områden, höjder och former. Som vi understryka här, är en vanlig källa till misslyckade derivatisering exponering av provet för vatten, vilket minskar den kemiska derivatisering effektiviteten. Alla reagenser, inklusive MSTFA, MOX och pyridin, måste därför hållas fuktfri villkor. Behovet av att upprätthålla torra förhållanden sträcker sig även till att förbereda prover som lagras vid-80 ° C, som bör placeras i ett vakuum Centrifugera under 30 minuter innan du öppnar för att säkerställa att kondens inte kommer in provet. Vi vill också betona att GC-MS är en känslig teknik, och därmed större prover inte nödvändigtvis kommer att generera bättre data. Våra protokoll ger experimentellt testade urvalsstorlekar och mäter reproducibly de flesta metaboliter i centrala kol metabolism. Några av dessa metaboliter är mycket riklig och ökad urvalsstorlek leder för att signalera mättnad i spektrumet. I själva verket signalen för trehalos är redan mättad i vår analys och en split baserat på 100: 1 GC-MS injektion måste användas till att exakt mäta denna förening. Användaren bör slutligen, notera att våra protokoll inte är lämpligt för lipid utvinning eftersom vi använder en polar extraktionslösningen. Våra protokoll tar också inte hänsyn till fettsyror föroreningar som kunde närvara på plaströr och tips, det är därför vissa fettsyror signaler visas i det negativa kontrollprovet (figur 1B).
Slutligen de metoder som beskrivs här ger ett kraftfullt verktyg för att studera Drosophila metabolism. Detta protokoll, dock är inte specifika för Drosophila och kan användas med några ändringar för metabola studier i några små ryggradslösa djur. Oavsett art möjliggör denna enkla metod relativ kvantifiering av nästan alla aminosyror, intermediärer vid glykolys och TCA cykeln, samt ett antal andra små polära molekyler. I kombination med oöverträffad genetiska verktyg tillgängliga för gemenskapens Drosophila , förlägger denna typ av metabolomiska analys i farten i spetsen för metabolisk forskning för överskådlig framtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Tack vare medlemmarna i Indiana University massa spektroskopi anläggningen och University of Utah metabolomik Core Facility för hjälp med att optimera detta protokoll. J.M.T. stöds av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health under Award nummer R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
