Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو توفير نظام يستند إلى الخلية أن يعيد تشكيل ألفا سينوكلين المجاميع في فيفو. هي تبذر تضمينات سينوكلين ألفا داخل الخلايا في الخلايا العصبية الأولية بالاستيعاب ونشر خارجية تدار المجاميع الأصلية المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين المعزولة من المريضة ألفا-سينوكلين الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
لسنوات، قد عجز عن تكرار تشكيل إدراجات غير قابلة للذوبان ألفا-سينوكلين (αS) في الثقافات الخلية قيد كبير في الدراسة من αS التجميع في مرض باركنسون (PD). في الآونة الأخيرة، أعطت تطوير نماذج حيوانية جديدة عن طريق تطعيم خارجية الدماغ مقتطفات من الفئران المحورة وراثيا αS مريضة أو المرضى PD آمال جديدة لإمكانية إنشاء نماذج الخلية أكثر ملائمة لتجميع αS. لسوء الحظ، عندما يتعلق الأمر بالخلايا في الثقافات، لم تثبت إدارة مستخلصات الدماغ الخام ناجحاً كما هو الحال في الفئران ومصدر اختيار المجاميع الخارجية لا تزال في المختبر بريفورميد ييفات αS.
قمنا بتطوير أسلوب للحث على تشكيل تضمينات αS داخل الخلايا في الخلايا العصبية الأولية من خلال إدارة خارجية المجاميع الأصلية αS المرتبطة ميكروسوميس، أنواع شديدة سمية αS معزولة عن المناطق المريضة من الفئران المعدلة وراثيا. هذا جزء من αS المجاميع المرتبطة مع الحويصلات ميكروسوميس، متغللة بكفاءة والحث على تشكيل تضمينات داخل الخلايا إيجابية ل αS مجمعة وفوسفوريلاتيد. مقارنة في المختبر-ييفات بريفورميد التي تصنع من αS المؤتلف، لدينا طريقة أسرع وضمانات أن بذر المسببة للأمراض مع المجاميع αS أصيلة المستخرجة من نماذج الحيوانات المريضة من PD، محاكاة أكثر عن كثب النوع حصل تضمينات في فيفو. نتيجة لذلك توافر أنسجة غنية بتضمينات αS إلزامي.
ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب سوف تقدم نموذجا يستند إلى الخلية تنوعاً لدراسة الجوانب المجهرية αS التجميع والفيزيولوجيا المرضية الخلوية ذات الصلة في فيفو وستكون نقطة انطلاق لإنشاء خلية دقيقة ومتطورة أكثر نموذج للمشتريات.
Introduction
تراكم من تضمينات البروتينية ألفا-سينوكلين (αS) ميزة بارزة وهامة من باركنسون مرض (PD) وألفا-سينولسينوباثيس1. ولسوء الحظ، في حين قادرة على توفير بيئة الخلوية والكيمياء الحيوية كافية للحث على اتخاذ الخطوات اللازمة لتشكيل البروتين ييفات2تجميع نماذج حيوانية، تكرار تشكيل من جسم ليوى المعقدة (رطل)-مثل المجاميع في الثقافات الخلية صعوبة وتحديا.
هنا يصف لنا وسيلة للحث على تشكيل تضمينات αS، مماثلة للمجاميع البروتين التي تم الحصول عليها في نماذج حيوانية والمرضى PD، في الخلايا المستزرعة، استخدام الدماغ معزولة الماوس الخلايا العصبية الأولية. ويستند لدينا بروتوكول إدارة خارجية للمجاميع المرتبطة microsomes αS معزولة من αS أعراض الفئران (تيراغرام) المعدلة وراثيا للماوس هيبوكامبال أو القشرية الخلايا العصبية الأولية. يأخذ هذا الأسلوب ميزة على إشاعة ونشر قدرة αS الأنواع السامة التي، بمجرد إضافة إلى متوسط الثقافة، يمكنها أن تصبح استيعابه، والحث على تشكيل المجاميع αS-الإيجابية الناضجة3،4، 5،6،،من78.
في الأصل، استندت الأساليب القياسية للحصول على تشكيل ييفات αS في الثقافات الخلية overexpression كدنا αS المقابلة من خلال بروتوكولات تعداء العادية أو العدوى الفيروسية بوساطة9. بينما في الحالة الأولى الحصول على αS رطل مثل المجاميع كانت عارضة، أظهرت انخفاض الكفاءة، ويتوقف على نوع الخلية، البروتوكول الثاني أدى إلى تشكيل ييفات غير قابلة للذوبان، بما في ذلك الأنواع عالية الوزن الجزيئي (حمو) في ح 24-48 من الإصابة 10. في هذه الأساليب، تشكيل المجاميع ربما كان نتيجة الإفراط وغير المتوازنة في كمية البروتين αS التي تصبح غير قابلة للذوبان بدلاً من تحويل مرضية لتكيف αS يملي التجميع. بدلاً من ذلك، الأسلوب الذي نقدمه هنا لا يغير من مستوى التعبير αS لكن الحث على تجميع البروتين على نطاق واسع بسبب استيعاب ييفات الخارجية. وعلاوة على ذلك، تشكيل المجاميع αS من خلال إدارة ييفات الخارجية هو عملية طويلة تتطلب أيام أو أسابيع لتصبح شاملة مما يسمح لنا بدراسة المراحل المبكرة والمتوسطة من αS تضمينات تشكيل بطريقة الوقت الفاصل بين و لربط ذلك مع التغييرات البيوكيميائية الخلوية. وهكذا، لدينا أسلوب هو تطبيق قيمة لإنشاء نماذج التجميع αS الخلوية التي قد تكون مفيدة لدراسة تشكيل فيبريل αS مجهريا بالنسبة للهاتف الخلوي الفيزيولوجيا المرضية.
وبالإضافة إلى ذلك على الرغم من أن إدارة الدماغ الخام يستخرج من الفئران المريضة αS ترانسجينيك (تيراغرام)11،12 أو6،العقول PD البشرية13 قادرة على حمل αS ترسب في تيراغرام أو الحيوانات البرية من نوع (وزن)، والتطبيق لنفس الإجراء للثقافات الخلية لم يثبت أن تكون ناجحة، ربما بسبب انخفاض كمية من المجاميع في العينات المستخدمة وعدم وجود إجراءات موحدة لعزل الأنواع السامة αS الأصلي14. وبسبب هذا، كانت مصدرا المجاميع المفضلة حتى الآن لاستحثاث تضمينات αS في الخلايا في المختبر بريفورميد ييفات (بفس) من αS والنماذج الحيوانية3،،من46،7 ،،من1516. مع أن البروتوكول، إلا أن نظهر أن الأنواع المجمعة المرتبطة microsomes αS المعزولة من αS تيراغرام الفئران يمكن أن يستحث كفاءة تراكم تضمينات αS مثل رطل داخل الخلايا في الخلايا العصبية الأولية.
في المختبر لدينا، الأنواع المجمعة المرتبطة microsomes αS معزولة من أنسجة النخاع الشوكي (SpC) من الفئران تيراغرام المريضة معربا عن A53T αS الجينات البشرية تحت سيطرة الماوس بريون البروتين (PrP) المروج [الحزب الثوري A53T البشرية αS تيراغرام الفئران، خط G2-317]. تظهر هذه الفئران النمط الظاهري الأعصاب تعتمد على سن يتضمن الخلل موتور قوي وتشكيل المشمولات في الجهاز العصبي المركزي مصنوعة من فوسفوريلاتيد، أوبيكويتيناتيد، وغير قابلة للذوبان αS، تبدأ بعد 9 أشهر عمر. حالما يظهر الخلل في السيارات، يتطور النمط الظاهري سرعة إلى الشلل، بدءاً من أطرافه الخلفية، والتي تؤدي إلى الوفاة في 2-3 أسابيع. تراكم من المجاميع αS يوازي مظاهر المرض. إظهار الفئران ضحى بداية الخلل الحركي بدرجة قوية من αS التجميع في توافق آراء ساو باولو وجذع الدماغ والمخيخ. ليست هناك حاجة الانتظار لحين تعيين الشلل إلى التضحية بالماوس. وتؤخذ الفئران بريسيمبتوماتيك في 9 أشهر من العمر الحيوانات التي لا تعرض الخلل في السيارات.
Protocol
استخدام الحيوانات WT وتيراغرام وافقت والتزمت بالكامل بالوطنية والقوانين الدولية للرفق بالحيوان المختبر والتجريب (EEC 86 توجيه المجلس/609، 12 ديسمبر 1987 والتوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي، 22 سبتمبر 2010). جميع البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة اتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان لمؤسستنا.
1-عزل المجاميع المرتبطة Microsomes αS من A53T المريضة αS تيراغرام الفئران
- إعداد المخزن المؤقت التجانس الذي يتكون من السكروز 250 ملم وعيار 20 ملم حبيس، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل2، يدتا 2 مم و x 1 الفوسفاتيز/البروتياز-مثبطات. الحفاظ على الجليد المخزن المؤقت.
- مجانسة الطازجة أو المجمدة الأنسجة في 01:10 (w/v) حجم المخزن المؤقت التجانس المثلج باستخدام تفلون مدقة الخالطون، بحدود 10-15.
- نقل هوموجيناتي الأولى (1-2 مل) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي مبردة بغية إزالة الأنوية والخلايا دون انقطاع في بيليه الناتجة (P1). تجاهل P1.
- نقل المادة طافية (S1) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة والطرد المركزي S1 في 10,000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام أجهزة الطرد مركزي مبردة من أجل الحصول على المادة الثانية طافية (S10) وبيليه (P10).
ملاحظة: هو P10 بيليه غشاء النفط خام الذي يحتوي على الميتوكوندريا وسينابتوسوميس. تجاهل P10. - نقل المادة طافية (S10) باستخدام زجاجة البولي (> 1 مل) والطرد المركزي S10 في 100,000 × ز، ح 1 في 4 درجات مئوية باستخدام أولتراسينتريفوجي ودوار زاوية ثابتة (90 Ti).
ملاحظة: المادة طافية هو الكسر سيتوسول نقية بينما بيليه، P100، يحتوي على المجاميع المرتبطة microsomes αS. - ريسوسبيند بيليه P100 مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت التجانس. نقل P100 إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد مركزي مبردة.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند P100 مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للتجانس.
ملاحظة: هذا جزء من المجاميع المرتبطة microsomes αS. - Sonicate العينات 2 s على الجليد [طاقة إخراج مجموعة 1 واط (RMS)]. تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
- اليوم، وبعد تحديد كمية البروتين باستخدام تحليل اتفاق التعاون الأساسي.
2-الغربية وصمة عار
ملاحظة: يتم تقييم توصيف البيوكيميائية المجاميع المرتبطة microsomes αS "الغربية لطخة".
- يلقي هلام polyacrylamide تريس-جليكاين تدرج 4-20% على جهاز التفريد رأسي.
- تحميل 1 ميكروغرام من الكسور المرتبطة microsomes αS، حلت في المخزن المؤقت الذي يشوه عينة.
- بئر مختلفة، يتم تحميل 5 ميليلتر من البروتين علامة قياسية.
- تشغيل الهلام في 100 الخامس في تريس/جليكاين/الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت حتى يصل البروتين علامة نهاية الهلام.
- نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام مخزن مؤقت كربونات أساسية (10 ملم ناكو3، 3 مم ناكو3، 20% الميثانول) س/ن في 4 درجات مئوية، 200 mA، مستمرة.
- كتلة الغشاء مع برنامج تلفزيوني النطاق الفاعل 0.05% (برنامج تلفزيوني-T) مع 5% غير الدسم الحليب الجاف على شاكر مدارية مدة 30 دقيقة في الرايت
- بإيجاز، شطف الغشاء مع برنامج تلفزيوني-ت.
- احتضان الغشاء بازل-1 (1:5، 000) أو جسم pSer129-αS (1:5، 000) في 2.5% غير الدسم الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني-تي، س/ن في 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
- يغسل الغشاء لمدة 10 دقائق في الرايت مع برنامج تلفزيوني-T في شاكر مداري.
- احتضان الغشاء مع الماوس المضادة أو أرنب المضادة مترافق HRP الثانوية جسم (1:3، 000) في الحليب الجاف غير الدسم 2.5% في برنامج تلفزيوني-T ح 1 في الرايت
- يغسل الغشاء لمدة 10 دقائق في الرايت مع برنامج تلفزيوني-T في شاكر مداري. كرر 3 x.
- الحصول على الإشارة من خلال مجموعات تشيميلومينيسسينسي العادية.
3-الابتدائي الثقافات العصبية
ملاحظة: تم إعداد الثقافات الخلايا العصبية الأولية من وزن الوليد (P0) الحصين الماوس أو اللحاء (خط C57BL/6). ويتم الإجراء بأكمله، ناقص الخطوات الطرد المركزي، تحت غطاء ثقافة خلية، في ظروف معقمة.
- علاج كوفيرسليبس (18 ملم Ø) مع 65% وحمض النيتريك الحل على الأقل 12 ح في الرايت
- إزالة حمض النتريك. أشطف كوفيرسليبس مرتين مع برنامج تلفزيوني 10 x وعدة مرات بماء مقطر.
- إدراج كوفيرسليبس في أطباق 24-جيدا ومعطف لهم مع بولي-د-يسين (0.1 مغ/مل بالماء المقطر المعقم أو برنامج تلفزيوني 1 x) ح 1 في 37 درجة مئوية.
- إزالة بولي-د-يسين وتغسل كوفيرسليبس ثلاث مرات بماء مقطر. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى حاجة.
- Euthanize الجراء الماوس بقطع الرأس وفصل الرؤساء الهيئات. وضع الرؤساء على الأطباق وتشريح الجلد بلطف.
- باستخدام مقص جيد، فتح الجمجمة بإجراء شق في القواعد للعقول. فصل نصفي الجماجم وإزالتها بعناية.
- باستخدام الملقط، قرصه خارج أدمغة انطلاقا من القواعد وعزل القشرة والحصين. تحويلها إلى اثنين أطباق منفصلة تتضمن حل متوازن الملح (حبس) المتوسطة هانك التي تحتوي على 1% البنسلين/ستربتوميسين.
- كرر الخطوات من 3.6 و 3.7 لكل الحيوانات. كن على علم أن العملية برمتها ينبغي أن لا تأخذ أكثر من 30-45 دقيقة.
- فرم الأنسجة التي تم جمعها ونقلها إلى اثنان أنابيب مخروطية 50 مل (واحد الحصين) وواحد للقشرة مع 10 مل من حبس المتوسطة التي تحتوي على التربسين 0.1%. احتضان في حمام الماء لمدة 7 دقائق في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: مطلوب لا تحريض. - أضف 1 مل دميم التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 10 ميكروغرام/مل الدناز إلى هوموجيناتي لحظر نشاط التربسين.
- الطرد المركزي الأنسجة ينتابها الناتجة في ز × 200 لمدة 5 دقائق في RT على أجهزة الطرد مركزي وإزالة المادة طافية.
ملاحظة: يمثل بيليه الخلايا تشريح من الأنسجة. - ريسوسبيند الخلايا في المتوسط الطلاء، الذي يحتوي على 2% B27، الجلوتامين 2 مم، والجلوكوز 6 مغ/مل، 10% FBS، 12.5 غلوتامات ميكرومتر والجنتاميسين 10 ميكروغرام/مل.
- لوحة فصل الخلايا العصبية في كوفيرسليبس بولي-د-يسين في 24 لوحات جيدا وفقا للنسبة: قشرة 1/12 بئرا وآبار الحصين 1/6، أسفر عن الخلايا 150,000/200,000 حوالي الساعة الواحدة وكذلك. الحفاظ على الخلايا في الحضانة عند 37 درجة مئوية.
- اليوم التالي (يوم في المختبر، الدرجة 1)، استبدال المتوسطة الطلاء مع الوسط الذي يحتوي على 2% B27، 10 ميكروغرام/مل الجنتاميسين والجلوتامين 2 مم.
- في الدرجة 2، إزالة 1/3 للمتوسطة وأضف 1/3 المتوسط الطازجة التي تحتوي على 2.5 ميكرون السيتوزين أرابينوسيدي عن 48 ساعة للحد من تلوث الدبقية.
- المحافظة على الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية واستبدال نصف المتوسط كل ثلاثة أيام.
4-الخلايا العصبية العلاج
ملاحظة: العلاج، وقد أجريت في DIV 7. جميع الخطوات التي تتم تحت غطاء ثقافة خلية في ظروف معقمة. ويتضح مثال على ثقافة العصبية القشرية الكثافة في الدرجة 7 في الشكل 1.
- تجمع المجاميع المرتبطة microsomes αS تم الحصول عليها من النخاع الشوكي ثلاثة فئران تيراغرام المريضة مختلفة بغية حل 1 ميكروغرام/ميليلتر، باستخدام المخزن المؤقت التجانس الأصلي للتخفيف.
- إزالة 1/3 للمتوسطة واستبدله بلطف متوسطة جديدة تحتوي على 2% B27، 1 x الجلوتامين الجنتاميسين و 2 مم.
- أضف 1 ميكروغرام من المجاميع αS المجمعة المرتبطة microsomes إلى متوسط الخلية. عودة الخلايا العصبية في الحضانة عند 37 درجة مئوية.
- كل 3 أيام لمدة أسبوع واحد، أضف 1/3 متوسطة جديدة. عدم استبدال المتوسطة. إضافة فقط.
- بعد أسبوع واحد من العلاج، إزالة 1/3 للمتوسطة واستبدله بلطف متوسطة جديدة تحتوي على 2% B27، 10 ميكروغرام/مل الجنتاميسين والجلوتامين 2 مم. كرر كل 3 أيام.
- إصلاح الخلايا العصبية بعد أسبوعين علاج (DIV 21).
5-الفلورة
- إصلاح الخلايا العصبية مع بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني 1 x و 5% من محلول السكروز لمدة 15 دقيقة في RT دون الهز، تحت مادة كيميائية الأبخرة هود.
- قم بإزالة تثبيت الحل. بإيجاز، يغسل مع برنامج تلفزيوني 1 × 3 مرات.
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات الغسل بلطف لأن الخلايا العصبية الأولية لا تلتزم بثبات كوفيرسليبس بولي-يسين. - بيرميبيليزي الخلايا العصبية مع 0.3% من النطاق الفاعل في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 5 دقائق في الرايت
- بإيجاز، يغسل مع برنامج تلفزيوني 1 × 3 مرات.
- احتضان الخلايا العصبية مع 3% FBS في برنامج تلفزيوني 1 x ل 30 دقيقة في الرايت، لحظر مواقع الربط غير محدد، على شاكر مداري.
- احتضان الخلايا العصبية بجسم الأولية المناسبة حله في 3% FBS في برنامج تلفزيوني 1 x، O/N في 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
ملاحظة: syn303 (1:1، 000)، الماوس αS (1: 200)، pser129-αS (1:1، 000) وتأو (01:10، 000) واستخدمت الأجسام المضادة. - إزالة الحل جسم والمياه والصرف الصحي، بإيجاز، مع برنامج تلفزيوني 1 × 3 مرات.
- احتضان الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت المناسبة حله في 3% FBS في برنامج تلفزيوني، عن ح 1 في RT في الظلام على شاكر مداري.
- إزالة الحل جسم والمياه والصرف الصحي، بإيجاز، مع برنامج تلفزيوني 1 × 3 مرات.
- وصمة عار الخلايا العصبية مع الحل DAPI (0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني 1 x) لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام على شاكر مداري.
- إزالة الحل جسم والمياه والصرف الصحي، بإيجاز، مع برنامج تلفزيوني 1 × 3 مرات.
- جبل كوفيرسليبس على شريحة باستخدام التركيب أنتيفادي المتوسطة.
Representative Results
يتبع البروتوكول المذكورة أعلاه وتلخيصها في الشكل 2، ونحن تنقية المجاميع المرتبطة microsomes αS من αS A53T المريضة ثلاث تيراغرام الفئران (الشكل 3). ميكروسوميس هي كسور بيليه غشاء الخام تحتوي على هيولى، غولجي، وحويصلات صغيرة متشابك. تم تقييم درجة نقاء بيليه microsomal مقارنة بسائر الكسور سابقا باستخدام علامات محددة عضية18.
مرة واحدة معزولة، يتم تقييم توصيف البيوكيميائية αS المجاميع من خلال صفحة الحزب الديمقراطي الصربي يشوه، تليها الحضانة بازل-1 أو αS فوسفوريلاتيد في جسم سيرين 129 (pSer129-αS). مقارنة مع بريسيمبتوماتيك (برية) والفئران مطابقة العمر غير--تيراغرام (المجموعة الوطنية للتقنية)، ميكروسوميس المعزولة من المرضى فئران متسرعا المشارك مع المجاميع αS. الأنواع المرتبطة microsomes αS تظهر ملامح نموذجية من αS المجاميع، مثل تراكم أنواع المنظفات المقاوم حمو، الفسفرة في سيرين 12919 وج-والطرفي ن اقتطاع أجزاء (بالنسبة لتوصيف كامل ل انظر المجاميع المرتبطة microsomes αS مرجع18،،من2021). هذه هي المتطلبات الأساسية نظراً لعدم الحصول على كفاءة استيعاب αS أحادي والحث على عدم αS ترسب7،،من1522. من المهم عدم استخدام أي منظفات (الأيونية أو غير أيونى) ريسوسبيند الكريات P100 نظراً لأنها يمكن أن تكون ضارة بالخلايا. أيضا، تجنبا لتباين العينة، سوف تجمع المجاميع المرتبطة microsomes αS من ثلاثة مختلفة الفئران المريضة للعلاج الخلايا العصبية.
إدارة 1 ميكروغرام من المجاميع αS المجمعة المرتبطة ميكروسوميس من المريضة A53T الفئران إلى متوسط الثقافة من الخلايا العصبية القشرية أو هيبوكامبال الحث على تشكيل تعتمد على الوقت من تضمينات αS، إيجابية للأجسام المضادة αS المجاميع الخاصة مثل Syn303 (الشكل 4، 5) أو pser129-αS (الشكل 5). وبعد يومين (2d) لعلاج هذه المجاميع تظهر بونكتا الصغيرة والمتناثرة التي سوف تصبح أكثر وفرة في نقاط زمنية لاحقة. بعد أسبوعين، تضمينات αS تشبه طويلة وتنضج الهياكل الشبيهة بالخرز، وشدة منتشرة في جميع أنحاء ثقافات العصبية، اتباع نمط نورت وترجمة جزئيا يشترك مع presynaptic وعلامات نيوريتيس (الشكل 5). في بعض الأحيان، يمكن رؤية تضمينات αS شكلت حديثا تعريب المشترك ووصمة عار سوما الخلية أو تغطية العملية برمتها، تشبه نيوريتيس نخرية.
على الرغم من أن كفاءة يمكن أن تنتشر الكسور المجاميع المرتبطة microsomes αS في الثقافات الخلايا العصبية، قد على المبلغ يتم ضبطها بدقة للعدد من الخلايا العصبية مطلي (الشكل 1). في الواقع، تتجاوز نسبة الموصى به، ميكروغرام مجاميع المرتبطة ميكروسوميس: عدد الخلايا العصبية، سوف تحفز موت الخلية قبل الأوان في غضون أيام قليلة (الشكل 6)، بينما كمية غير كافية من المجاميع المرتبطة microsomes αS ستؤدي إلى النادرة وانخفاض عدد المشمولات بعد أسبوعين علاج، مماثلة لما حصل في نقاط زمنية سابقة (الشكل 4أ).
الشكل 1 . الثقافات العصبية القشرية. صورة تمثيلية توضح كثافة في 7 DIV الثقافات العصبية القشرية. وقد اتخذت الصور مع مجهر مقلوب خفيفة، 10 X الهدف. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . عزل المرتبطة microsomes αS المجاميع من الماوس توافق آراء ساو باولو- مخطط انسيابي للبروتوكول تنقية المجاميع المرتبطة microsomes αS من توافق آراء ساو باولو فئران المريضة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . عزل كسور microsomes من المريضة، بريسيمبتوماتيك A53T αS تيراغرام والمجموعة الوطنية للتقنية الفئران. عرض تحليل لطخة غربية تنقية المجاميع المرتبطة microsomes αS معزولة عن ثلاثة المريضة (المرضية)، بريسيمبتوماتيك (برية) والفئران مطابقة للمسنين المجموعة الوطنية للتقنية. الفئران المريضة هي A53T αS تيراغرام الفئران التي تظهر الخلل الحركية والعصبية، بما في ذلك تراكم تضمينات αS, بينما الحيوانات بريسيمبتوماتيك A53T صحية αS Tgs من 9 أشهر من العمر التي لم تظهر بعد أي أمراض αS المتعلقة بالنمط الظاهري. الفئران المجموعة الوطنية للتقنية هي ليتيرماتيس فئران المريضة التي لا تحمل التحوير αS و ولذلك لا تتطور αS الناجم عن الأمراض. 1 ميكروغرام لكل الكسور المنقي تم تشغيل على صفحة الحزب الديمقراطي الصربي يشوه ونقلها في غشاء النيتروسليلوز ومسح مع جسم اصطناعي-1 أو pSer129-αS. فقط كسور ميكروسوميس المعزولة من الفئران المريضة همو الوارد αS المقاوم للمنظفات المجاميع التي كانت فوسفوريلاتيد في سيرين 129 وأظهرت ج-واقتطاع الطرفي ن. وهذا الرقم قد تم تكييفه من والكوِتشوا et al. 18- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تعتمد على الوقت التعريفي لترسب αS بعد إدارة المجاميع المرتبطة microsomes αS. (أ) الفلورة الخلايا العصبية هيبوكامبال الابتدائي تعامل مع 1 ميكروغرام αS المرتبطة microsomes المجاميع الكسور التي تجمع من ثلاثة مختلفة الفئران المريضة. تم إصلاح الخلايا العصبية في أيام 2 (2d)، (1w) في الأسبوع 1 أو 2 أسابيع (2w) للعلاج وإيمونوستينيد مع syn303 (S303، 1: 1000)، جسم معين لتتأكسد وتجميعه αS. وقد كونتيرستينيد الخلايا مع DAPI. تم أخذ صور [كنفوكل] باستخدام ليزر مسح [كنفوكل] المجهر، 63 X الهدف. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) التحليل الكمي من مجموع fluorescence، بعد الطرح الخلفية، وقد تم ذلك باستخدام البرنامج المساعد عدد الجسيمات من البرنامج "ي الصورة". تم تطبيع لعدد الأنوية في كل حقل (DAPI العد) القيم ومعبرا عنه بالنسبة المئوية للإشارة fluorescence S303 في 2D. يتم إعطاء قيم ك ± يعني SD (n = 5). * * ف < 0.001، * * * ف < 0.00001، One-way ANOVA، متبوعاً باختبار الوظائف المخصصة LSD فيشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . تضمينات αS داخل الخلايا كولوكاليزي مع شبكة نيوريتيس القشرية. صور [كنفوكل] الممثل من الخلايا العصبية القشرية تعامل مع المجاميع المرتبطة microsomes αS التي تم الحصول عليها من المريضة تيراغرام الفئران. بعد أسبوعين من العلاج الخلايا العصبية كانت ثابتة ومزدوجة ملطخة بالأجسام المضادة الخاصة بالمجاميع [S303 (أ، ب) أو pser129-αS، 1:1,000 (ج)] وعلامات نيوريتي [αS الماوس أو 1: 200 (أ، ب) أو تاو، المضيفين (ج)]. شارك وضع العلامات من إشارات الفلورسنت أظهرت ترجمة جزئية المشارك من هياكل تشبه حبة αS شكلت حديثا مع شبكة نيوريتيس. أحياناً تضمينات αS تتراكم داخل سوما العصبية (أ، ب، ورؤوس الأسهم). تم اقتناء صور مكدسة مع ليزر المسح [كنفوكل] المجهر، 63 X الهدف. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من والكوِتشوا et al. 20- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . إضافة مبلغ دون الحد الأمثل من المجاميع المرتبطة microsomes αS سامة للخلايا العصبية. DAPI تلطيخ الخلايا العصبية التي تعامل مع زيادة تركيز المجاميع المرتبطة microsomes αS يؤدي إلى موت الخلية. (أ) تعامل الخلايا العصبية القشرية مع 1، 2 ميكروغرام من المجاميع المرتبطة microsomes αS المستخرجة من الفئران المريضة أو المخزن المؤقت فقط تحتوي على مجاميع من (ب) والملون مع DAPI. الصور الفلورية تم الحصول عليها مع مجهر الأسفار برنامج التحصين الموسع استخدام هدفا X 20. شريط المقياس = 100 ميكرومتر.(ب) أحصى DAPI-إيجابية الخلايا باستخدام البرمجيات "ي الصورة". يظهر الرسم البياني انخفاضا في عدد الأنوية مع زيادة تركيز المجاميع المرتبطة microsomes αS إضافة إلى الوسائط العصبية. القيم يعبر عن كنسبة مئوية من ب وترد ك ± يعني SD (n = 5)، * * * ف < 0.0001، One-way ANOVA، متبوعاً باختبار الوظائف المخصصة LSD فيشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وصفت لنا طريقة الحصول على تشكيل تضمينات αS في الثقافات الخلايا العصبية الأولية المستمدة من الدماغ من وزن الفئران، عن طريق إضافة مجاميع المنقي αS المرتبطة ميكروسوميس المعزولة من αS تيراغرام نماذج حيوانية.
الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول هي التالية: نسبة ميكروغرام من المجاميع المرتبطة microsomes αS/الخلايا العصبية ومصدر αS المجاميع. كما هو موضح في الدورة النتائج، من المهم تحسين نسبة ميكروغرام من المجاميع المرتبطة microsomes αS/عدد الخلايا العصبية حيث يعملون في ظروف دون المستوى الأمثل يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية قبل الأوان أو التجميع داخل الخلايا النادرة جداً (انظر مقطع تمثيلي النتائج). وبسبب هذا، من المهم جداً تقييم كثافة ثقافة العصبية في 7 DIV (كما هو موضح في الشكل 1) قبل بدء العلاج. بالإضافة إلى ذلك، قد αS المجاميع يتم تنقيته من αS المريضة تيراغرام الفئران، أي. من النماذج الحيوانية التي تتراكم تميزت تضمينات الشبيهة برطل αS غير قابلة للذوبان فوسفوريلاتيد والمنظفات ييفات همو.
إمكانية إدخال تعديلات على هذا البروتوكول تعتبر الأنسجة، المجمدة أو الطازجة، من ميكروسوميس التي يمكن أن تكون معزولة ومبلغ بداية. بينما كنا "توافق آراء ساو باولو تيراغرام" الفئران بسبب ارتفاع محتوى αS المجاميع غير قابلة للذوبان، البروتوكول مناسبة لعزل المجاميع المرتبطة ميكروسوميس من أي أنسجة، شريطة أن المنطقة محتوى المرتفع في المجاميع αS. يمكن أيضا استخدام العينات المجمدة منذ التجميد لا يؤثر على خطوات تنقية المجاميع المرتبطة ميكروسوميس أو المجاميع في حد ذاتها. بينما الوزن الموصى بها للأنسجة حوالي 100-150 ملغ، هذا البروتوكول مناسبة للحصول على ميكروسوميس من منخفضة تصل إلى 50 ملغم مواد الخام (لا يوجد حد أقصى وزن). في حالة كمية أقل من 100 مغ، ومع ذلك، سيكون نسبة التجانس المناسب 01:20 (w/v) كي يكون على الأقل 1 مل S10 طافية تحميل على زجاجة البولي لهطول الأمطار أولتراسينتريفوجي. وفي الواقع، قد يؤدي تحميل وحدات التخزين أصغر من 1 مل انهيار فقدان الأنبوب وعينه. زيادة حجم التجانس يؤدي إلى المادة طافية مخففة أكثر ولكن تركيز بيليه microsomal سوف تظل غير متأثرة.
حد من هذا البروتوكول تتعلق عدم كفاءة عبر البذر في تشكيل تضمينات αS التي أبلغ عنها مؤخرا في قضية إدارة بفس αS البشرية المنشأ للثقافات العصبية مورين بدلاً من الماوس αS بفس24. نظراً لزيادة كمية ييفات αS خارجية نظراً إلى الثقافات مورين يمكن تجاوز هذه المشكلة، نوصي بأن يوفق ناعما مقدار المجاميع المرتبطة ميكروسوميس في حالة إقامة ييفات التي تم الحصول عليها من متغيرات αS أخرى أو من مختلف أنواع الثقافات الماوس الخلايا العصبية من ما وصفت لنا.
يمكن أن تكون المجاميع αS الخارجية إضافة إلى ثقافة وسائل الإعلام من مصادر مختلفة. في المختبر بفس αS قد استخدمت سابقا كقالب نثر البذور من المجاميع αS داخل الخلايا في الثقافات الخلية والخلايا العصبية الأولية، ونماذج حيوانية3،،من78،15. بالمقارنة مع أسلوب لدينا حيث يمكن أن تكون معزولة المجاميع المرتبطة microsomes αS في الساعات القليلة، تشكيل بفس طويلة وشاقة، تتطلب خطوات متعددة لتنقية، متبوعاً بفحوصات إضافية للتأكد من المجاميع αS كونفوميشنز25 . وبالإضافة إلى ذلك، يجري الحصول عليها من الإنسان أعربت عن البكتيريا أو الماوس αS بفس، أي تفتقر إلى التعديلات بوستترانسلاشونال نموذجية من حقيقيات النوى، يمكن أن يقدم والتشكلات المختلفة، مع البذور الانتقائي والخصائص المسببة للأمراض، واستنادا إلى يتبع البروتوكولات نويات (أي شرائط مقابل ييفات)5،8 مما يؤدي إلى نتائج مختلفة والاستنتاجات. بدلاً من ذلك، تضمن إدارة واحدة في فيفو تنقية المجاميع αS نقل قوالب الممرضة أكثر واقعية، محاكاة عن كثب عملية تشكيل αS المشمولات في نماذج حيوانية والمرضى PD.
كتطبيق المستقبلية لهذا الأسلوب، ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها بنجاح لعزل البذور αS المسببة للأمراض من الدماغ للمرضى PD أو غيرها αS تيراغرام نماذج حيوانية، شريطة أن تكون غنية في αS المنطقة المصابة التي ميكروسوميس معزولة تضمينات.
على حد علمنا، هذا هو الأسلوب الأول الذي يسمح التنقية الأنواع السامة من αS من نماذج في فيفو PD لاستخدامه كقالب للحصول على تكوين αS المشمولات في الخلايا العصبية الأولية البذر.
ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب هو مرنة للغاية ويمكن أن توفر نموذجا يستند إلى الخلية استثنائية لدراسة الجوانب المختلفة لتجميع αS ونفوذها في الفسيولوجيا المرضية الخلية. نظراً لتشكيل تضمينات αS تمثل عملية معقدة وأن كان من الصعب إجراء نسخ متماثل في الخلايا المستزرعة، ونحن نأمل أن يوفر هذا الطراز الأفكار العظيمة في الآليات المسببة للأمراض الحادة، من الصعب تحديد المزمنة وأكثر تفصيلاً نظم مثل نماذج حيوانية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
دعمت هذا العمل بالوزارة الإيطالية للجامعة والبحوث (وزارة) من خلال نظام المنح "الإدماج الوظيفي" (RLM البرنامج للباحثين الشباب) ومن مدرسة المعلمين العليا. ونحن نشكر البروفيسور مايكل لي من جامعة مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير αS A53T البشرية Prp الفئران تيراغرام، من حيث المجاميع معزولة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
