Summary
Målet med denne protokol er at give en celle-baseret system, der replikerer dannelsen af alfa-synuclein aggregater i vivo. Intracellulære alpha-synuclein indeslutninger er seedet i primære neuroner ved internalisering og formering af eksogene administreres indfødte microsomes-associerede alpha-synuclein aggregater isoleret fra syge alpha-synuclein Transgene mus.
Abstract
For år, har manglende evne til replikering af dannelsen af uopløseligt alpha-synuclein (αS) optagelser i cellekulturer været en stor begrænsning i undersøgelsen af αS sammenlægning i Parkinsons sygdom (PD). For nylig, udviklingen af nye animalske modeller gennem de eksogene podning af hjernen uddrag af syge αS Transgene mus eller PD patienter har givet nye håb om muligheden for at oprette mere passende cell modeller af αS samling. Desværre, når det kommer til celler i kulturer, administration af rå hjernen uddrag har ikke vist sig så vellykket som mus og kilden til valg af eksogene aggregater er stadig in vitro- præfabrikerede αS fibriller.
Vi har udviklet en metode til at fremkalde dannelse af intracellulære αS optagelser i primære neuroner gennem eksogene administrationen af indfødte microsomes-associerede αS aggregater, et meget giftigt αS arter isoleret fra syge områder af Transgene mus. Denne fraktion af αS aggregater, der er knyttet til microsomes vesikler, er effektivt internaliseret og inducerer dannelsen af intracellulære inklusioner positive for aggregerede og fosforyleres αS. I forhold til in vitro-præfabrikerede fibriller, som er lavet af rekombinante αS, vores metode er hurtigere og garantier for, at sygdomsfremkaldende seeding er lavet med autentiske αS aggregater udvundet fra syge dyr modeller af PD, efterligne mere nøje typen indeslutninger fremstillet in vivo. Som et resultat er tilgængeligheden af væv rige i αS indeslutninger obligatorisk.
Vi mener, at denne metode vil give en alsidig celle-baseret model for at studere de mikroskopiske aspekter af αS sammenlægning og relaterede cellulære Patofysiologi i vivo og vil være et udgangspunkt for oprettelse af mere præcise og avancerede celle paradigme af PD.
Introduction
Ophobning af alfa-synuclein (αS) proteinholdige indeslutninger er en fremtrædende og vigtige træk ved Parkinsons sygdom (PD) og alpha-synulceinopathies1. Desværre, mens dyremodeller er i stand til at give en tilstrækkelig cellulære og biokemiske miljø for at fremkalde de sammenlægning trin er nødvendige for dannelsen af protein fibriller2, replikerende dannelsen af komplekse Lewy Body (LB)-gerne aggregater i cellekulturer er vanskelige og udfordrende.
Her beskriver vi en metode til at inducere dannelse af αS optagelser, svarende til protein aggregater opnåede i dyremodeller og PD patienter, i dyrkede celler, ved hjælp af hjernen isoleret musen primære neuroner. Vores protokol er baseret på de eksogene administration af microsomes-associerede αS aggregater isoleret fra αS symptomatisk transgene (Tg) mus til mus hippocampus eller kortikale primære neuroner. Denne metode udnytter αS giftige arter, som engang føjet til næringssubstratet, er købedygtig blive internaliseret, og inducerer dannelsen af modne αS-positive aggregater3,4, udbredelse og formering evne 5,6,7,8.
Oprindeligt, standard metoder til at opnå dannelsen af αS fibriller i cellekulturer var baseret på overekspression af den tilsvarende αS cDNA gennem regelmæssig Transfektion protokoller eller viral-medieret infektion9. Mens det i det første tilfælde at opnå LB-lignende αS aggregater var tilfældigt, viste lav effektivitet, og afhang celletype, den anden protokol førte til dannelsen af uopløseligt fibriller, herunder høj molekylvægt (HMW) arter i 24-48 h fra infektion 10. i disse metoder, dannelsen af aggregater var sandsynligvis på grund af en overdreven og ubalanceret i αS protein beløb, der bliver uopløselig i stedet for en patologisk konvertering af αS kropsbygning, der dikterer sammenlægning. I stedet, den teknik, som vi fremlægger her ændrer ikke αS udtryk niveau men inducerer udbredt protein aggregering på grund af internaliseringen af eksogene fibriller. Derudover dannelsen af αS aggregater gennem administrationen af eksogene fibriller er en langvarig proces, der kræver dage eller uger at blive udtømmende tillader os at studere begyndelsen og mellemliggende faser af αS inklusioner dannelse i en time-lapse mode og at korrelere det med de cellulære biokemiske ændringer. Vores metode er således et værdifuldt program at skabe cellulære αS aggregation-modeller, der er nyttige at studere αS fibril formation mikroskopisk i forhold til cellulære patofysiologi.
Desuden selv om administration af rå hjernen ekstrakter fra syge αS Transgenic (Tg) mus11,er12 eller menneskelige PD hjerner6,13 stand til at inducere αS deposition i Tg eller wild-type (WT) dyr, ansøgning af den samme procedure, cellekulturer har ikke bevist for at være så succesfulde, muligvis på grund af det lave antal aggregater i de prøver, der indgår og manglen på en standard procedure at isolere indfødte αS giftige arter14. På grund af dette, in vitro- præfabrikerede fibriller (PFFs) af αS har været aggregater kilde valg indtil nu for induktion af αS optagelser i celler og dyr modeller3,4,6,7 ,15,16. Med vores protokol, men viser vi at microsomes-associerede αS aggregerede arter isoleret fra αS Tg mus effektivt kan fremkalde ophobning af intracellulære LB-lignende αS optagelser i primære neuroner.
I vores laboratorium er microsomes-associerede αS aggregerede arter isoleret fra rygmarven (SpC) væv af de syge Tg mus udtryk for menneskelige A53T αS gen under kontrol af musen prion protein (PrP) promotor [Prp menneskelige A53T αS Tg mus, linje G2-317]. Disse mus viser en aldersbetinget neurodegenerative fænotype, der omfatter robust motor dysfunktion og dannelsen af optagelser i centralnervesystemet lavet af fosforyleret, ubiquitinated, og uopløselige αS, starter efter 9 måneder i alder. Når motor dysfunktion vises, fænotype hurtigt udvikler sig til lammelse, startende fra bageste lemmer, der fører til død i 2-3 uger. Ophobning af αS aggregater paralleller sygdom manifestation. Mus ofret i starten af den motoriske dysfunktion viser en robust αS sammenlægning i SpC, hjernestammen og cerebellum. Der er ingen grund til at vente indtil lammelse indstiller for at ofre musen. Præsymptomatiske mus er taget på 9 måneder gamle dyr, der ikke viser motor dysfunktion.
Protocol
Brugen af WT og Tg dyr blev godkendt og overholdes i fuld af nationale og internationale love for laboratoriet dyrevelfærd og eksperimenter (EØF Rådets direktiv 86/609, 12 December 1987 og direktiv 2010/63/EU, 22 September 2010). Alle de protokoller, der er beskrevet i denne hvidbog følge retningslinjerne dyrs pleje af vores institution.
1. isolering af Microsomes-associerede αS aggregater fra syge A53T αS Tg mus
- Forberede den homogenisering buffer, som er sammensat af 250 mM saccharose, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 2 mM EDTA og 1 x fosfatase/protease-hæmmere. Holde buffer på is.
- Homogeniseres frisk eller frossen væv i en 1:10 (w/v) volumen af iskold homogenisering buffer ved hjælp af en Teflon støder homogeniseringsapparat, med 10-15 slag.
- Overføre indledende homogenatet (1-2 mL) til en microcentrifuge rør og centrifugeres ved 1.000 × g i 10 min. ved 4 ° C ved hjælp af en nedkølet centrifuge for at fjerne kerner og ubrudt celler i den resulterende pellet (P1). Kassér P1.
- Overføre supernatanten (S1) til en ren microcentrifuge tube og centrifugeres S1 ved 10.000 × g i 20 min. ved 4 ° C ved hjælp af en nedkølet centrifuge for at få den anden supernatanten (S10) og pellet (P10).
Bemærk: P10 er en rå membran pellet, der indeholder mitokondrier og synaptosomes. Kassér P10. - Overføre supernatanten (S10) til en polycarbonat flaske (> 1 mL) og centrifugeres S10 på 100.000 × g, i 1 time ved 4 ° C ved hjælp af en ultracentrifuge og en fast vinkel rotor (90 Ti).
Bemærk: Supernatanten er ren cytosol brøkdel mens pellet, P100, indeholder microsomes-associerede αS aggregater. - Resuspenderes P100 med 500 µL af homogenisering buffer. Overføre P100 til en ren microcentrifuge rør og centrifugeres ved 10.000 × g i 20 min. ved 4 ° C i en nedkølet centrifuge.
- Supernatanten og resuspend P100 med 100 µL af homogenisering buffer.
Bemærk: Denne fraktion er microsomes-associerede αS aggregater. - Der sonikeres prøver til 2 s på is [sæt udgangseffekt 1 watt (RMS)]. Opbevare prøver ved-80 ° C.
- Dagen efter, bestemme det protein beløb ved hjælp af BCA analyse.
2. vestlige skamplet
Bemærk: Biokemiske karakterisering af microsomes-associerede αS aggregater er evalueret af Western Blot.
- Støbt en gradient 4-20% Tris-glycin polyacrylamid gel på en lodret elektroforese apparater.
- Indlæse 1 µg for microsomes-associerede αS brøker, opløst i den denaturering prøvebuffer.
- I en anden brønd, indlæse 5 µL af protein standard markør.
- Kør gelen på 100 V i en Tris/glycin/SDS kører buffer, indtil protein markør når enden af gelen.
- Overføre proteiner til en nitrocellulose membran ved hjælp af en grundlæggende karbonat buffer (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, 20% Methanol) O/N ved 4 ° C, på 200 mA, konstant.
- Blokere membran med PBS-nonionisk overfladeaktivt stof 0,05% (PBS-T) med 5% fedtfrit tørt mælk på en orbitalryster for 30 min på RT.
- Kort, skyl membran med PBS-T.
- Inkuber membran med Syn-1 (1:5, 000) eller pSer129-αS antistof (1:5, 000) i 2,5% fedtfrit tørt mælk i PBS-T, O/N ved 4 ° C på en orbitalryster.
- Vask membran i 10 min på RT med PBS-T på en orbitalryster.
- Inkuber membran med anti-mus eller anti-kanin HRP-konjugerede sekundær antistof (1:3, 000) i 2,5% fedtfrit tørt mælk i PBS-T i 1 time på RT.
- Vask membran i 10 min på RT med PBS-T på en orbitalryster. Gentag 3 x.
- Få signal gennem regelmæssig kemiluminescens kits.
3. primære Neuronal kulturer
Bemærk: Primære neuronal kulturer blev udarbejdet fra WT nyfødte (P0) mus hippocampus eller cortex (linje C57BL/6). Hele proceduren, minus trinene centrifugering kan gennemføres under en celle kultur hætte, under sterile forhold.
- Behandling af coverslips (18 mm Ø) med 65% salpetersyreopløsning i mindst 12 timer på RT.
- Fjerne salpetersyre. Skyl coverslips to gange med PBS 10 x og adskillige gange med destilleret vand.
- Indsæt coverslips i 24-godt retter og belægge dem med poly-D-lysin (0,1 mg/mL i sterilt destilleret vand eller PBS 1 x) i 1 time ved 37 ° C.
- Fjerne poly-D-Lysin og vaske coverslips tre gange med destilleret vand. Opbevar dem ved 4 ° C indtil det skal bruges.
- Aflive mus unger ved halshugning og adskille lederne fra organer. Læg hovedet på retter og forsigtigt dissekere huden.
- Ved hjælp af fine saks, åbne kraniet ved at gøre et snit på grundlag af hjerner. Adskille de to halvdele af kranier og fjerne dem omhyggeligt.
- Ved at bruge pincet, knivspids for hjerner fra baser og isolere cortex og hippocampus. Overføre dem ind i to separate skåle, som indeholder Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) medium indeholdende 1% penicillin/streptomycin.
- Gentag trin 3.6 og 3.7 for hvert dyr. Vær opmærksom på at hele processen ikke bør tage mere end 30-45 min.
- Hakkekød indsamlet væv og overføre dem til to 50 mL konisk rør (én for hippocampus) og én til cortex med 10 mL af HBSS medium indeholdende Trypsin 0,1%. Der inkuberes i vandbad i 7 min. ved 37 ° C.
Bemærk: Ingen agitation er nødvendig. - Der tilsættes 1 mL af DMEM indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 10 µg/mL DNase til homogenatet at blokere trypsin aktivitet.
- Centrifugeres den resulterende dissocierede væv på 200 × g i 5 min på RT på en centrifuge og Fjern supernatanten.
Bemærk: Pellet repræsenterer cellerne dissekeret fra vævet. - Resuspend celler i plating medium, der indeholder 2% B27, 2 mM glutamin, 6 mg/mL glukose, 10% FBS, 12,5 µM glutamat og 10 µg/mL gentamicin.
- Plade dissocieres neuroner på poly-D-lysin coverslips i 24 godt plader efter forhold: 1 cortex/12 brønde og 1 hippocampus/6 wells, hvilket resulterer i ca 150.000 til 200.000 celler pr. brønd. Opretholde cellerne i varmeskab ved 37 ° C.
- Dagen efter (dag i vitro, DIV 1), erstattes det medium, der indeholder 2% B27, 10 µg/mL gentamicin og 2 mM glutamin plating medium.
- På DIV 2, fjerne 1/3 af medium og tilsæt 1/3 af den friske medium indeholdende 2,5 µM cytosin arabinoside for 48 h til glial kontaminationen reduceres.
- Vedligeholde neuroner ved 37 ° C og erstat halvdelen af medium hver tre dage.
4. neuroner behandling
Bemærk: Behandlingen er blevet udført på DIV 7. Alle trin er udført under en celle kultur hætte i sterile forhold. Et eksempel på kortikale neuronal kultur tæthed på DIV 7 er illustreret i figur 1.
- Pool microsomes-associerede αS aggregater opnåede fra rygmarven af tre forskellige syge Tg mus for at få en 1 µg/µL opløsning, ved hjælp af den oprindelige homogenisering buffer for fortynding.
- Fjerne 1/3 af medium og erstatte det forsigtigt med den friske medium indeholdende 2% B27, 1 x gentamicin og 2 mM glutamin.
- Tilføj 1 µg poolet microsomes-associerede αS aggregater til celle medium. Returnere neuroner i varmeskab ved 37 ° C.
- Hver 3 dage til 1 uge, tilføje 1/3 af frisk medium. Erstat ikke mediet. Blot tilføje den.
- Efter 1 uge med behandling, fjerne 1/3 af medium og erstatte det forsigtigt med den friske medium indeholdende 2% B27, 10 µg/mL gentamicin og 2 mM glutamin. Gentag hver 3 dage.
- Fix neuroner efter 2 ugers behandling (DIV 21).
5. immunfluorescens
- Fix neuroner med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS 1 x og 5% rørsukkeropløsning for 15 min på RT uden rysten, under en kemisk fume hætte.
- Fjerne den fastsættelse løsning. Kort, vask med PBS 1 x 3 gange.
Bemærk: Udføre alle vask trin forsigtigt fordi primære neuroner ikke holde fast til poly-lysin coverslips. - Permeabilize neuroner med 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS 1 x til 5 min på RT.
- Kort, vask med PBS 1 x 3 gange.
- Inkuber neuroner med 3% FBS i PBS 1 x til 30 min på RT, at blokere uspecifik bindingssteder, på en orbitalryster.
- Inkuber neuroner med passende primære antistof opløst i 3% FBS i PBS 1 x, O/N ved 4 ° C på en orbitalryster.
Bemærk: syn303 (1:1, 000), mus αS (1:200), pser129-αS (1:1, 000) og Tau (1:10, 000) antistoffer blev brugt. - Fjern antistof løsning og vask, kort, med PBS 1 x 3 gange.
- Inkuber neuroner med passende fluorescerende sekundær antistof opløst i 3% FBS i PBS, for 1 h i RT i mørke på en orbitalryster.
- Fjern antistof løsning og vask, kort, med PBS 1 x 3 gange.
- Pletten neuroner med DAPI løsning (0,1 µg/mL i PBS 1 x) til 15 min på RT i mørke på en orbitalryster.
- Fjern antistof løsning og vask, kort, med PBS 1 x 3 gange.
- Montere coverslips på et dias ved hjælp af antifade montering medium.
Representative Results
Efter protokollen beskrevet ovenfor og sammenfattet i figur 2, vi renset microsomes-associerede αS aggregater fra tre syge A53T αS Tg mus (figur 3). Microsomes er rå membran pellet fraktioner, der indeholder endoplasmatiske reticulum, Golgi og små synaptiske vesikler. Renhedsgraden af de mikrosomale pellet i forhold til andre fraktioner var tidligere evalueres ved hjælp af specifikke organelle markører18.
Når isoleret, vurderes biokemiske karakterisering af αS aggregater gennem denaturering SDS-Page, efterfulgt af inkubation med Syn-1 eller fosforyleres αS på Serin 129 (pSer129-αS) antistof. I forhold til præsymptomatiske (PreS) og alder-matchede ikke-Tg (nTg) mus, microsomes isoleret fra syge mus Co bundfaldet med αS aggregater. Microsomes-associerede αS arter viser de typiske funktioner af αS aggregater, såsom ophobning af HMW vaskemiddel-resistente arter, fosforylering på Serin 12919 og C- og N-terminale afkortet fragmenter (for en fuld karakterisering af microsomes-associerede αS aggregater Se reference18,20,21). Disse er grundlæggende krav, da monomere αS ikke få effektivt internaliseret og ikke fremkalde αS deposition7,15,22. Det er vigtigt ikke at bruge nogen vaskemiddel (ionisk eller ikke-ionisk) til resuspend P100 træpiller, da det kan være skadeligt for celler. Også, for at undgå prøve variation, microsomes-associerede αS aggregater fra tre forskellige syge mus vil forenes neuronale behandling.
Administration af 1 µg poolet microsomes-associerede αS aggregater fra syge A53T mus til substratet af kortikale eller hippocampus neuroner inducerer en tidsafhængig dannelsen af αS inklusioner, positiv for tilslagsmaterialer-specifikke αS antistoffer som Syn303 (figur 4, 5) eller pser129-αS (figur 5). Efter to dage (2d) behandling disse aggregater vises som små, spredte puncta, der bliver mere rigelige på senere tidspunkter. Efter to uger, αS inklusioner ligner længe og modne perler-lignende strukturer, stærkt spredt over hele de neuronale kulturer, efter et neurite mønster og delvist Co lokalisering med præsynaptiske og neurites markører (figur 5). Lejlighedsvis, kan nydannede αS optagelser ses at co lokalisere og plette celle soma eller dække hele processen, der ligner nekrotiske neurites.
Selv om microsomes-associerede αS aggregater fraktioner kan effektivt sprede i neuronal kulturer, har deres beløb at være fintunet til antallet af neuroner forgyldt (figur 1). I virkeligheden overstiger de anbefalede forholdet, µg for microsomes-associerede aggregater: antallet af neuroner, vil fremkalde for tidlige celledød indenfor få dage (figur 6), mens en utilstrækkelig mængde af microsomes-associerede αS aggregater vil føre til en knappe og reduceret antallet af medtagelser efter to ugers behandling, svarende til hvad var opnået på tidligere tidspunkter (figur 4A).
Figur 1 . Kortikale neuronal kulturer. Repræsentative billede viser tæthed på DIV 7 af kortikale neuronal kulturer. Billeder blev taget med en inverteret lysmikroskop, 10 X mål. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Isolering af microsomes-associerede αS aggregater fra mus SpC. Flowchart af rensning protokol af microsomes-associerede αS aggregater fra SpC af syge mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Isolation af microsomes fraktioner fra syge, præsymptomatiske A53T αS Tg og nTg mus. Western blot analyse viser renset microsomes-associerede αS aggregater isoleret fra tre syge (syge), præsymptomatiske (PreS) og alderen-matchede nTg mus. Syge mus er A53T αS Tg mus, der viser den motor og neurologiske dysfunktion, herunder ophobning af αS optagelser, mens præsymptomatiske dyrene er sunde A53T αS Tgs 9 måneder i alder, som ikke viser endnu en αS patologi relateret fænotype. nTg mus er littermates af syge mus, som ikke bære αS transgenet og derfor ikke udvikler αS induceret patologi. 1 µg af hver renset fraktioner var kører på en denaturering SDS-Page, overføres på en nitrocellulose membran og renset med Syn-1 eller pSer129-αS antistof. Kun microsomes brøker isoleret fra syge mus indeholdt HMW vaskemiddel-resistent αS aggregeringer, der var fosforyleret på Serin 129 og viste C- og N-terminale trunkering. Dette tal er blevet tilpasset fra Colla et al. 18. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Tidsafhængig induktion af αS deposition efter administration af microsomes-associerede αS aggregater. (A) immunfluorescens af primære hippocampus neuroner behandlet med 1 µg for microsomes-associerede αS aggregater fraktioner samles fra tre forskellige syge mus. Neuroner blev fastsat til 2 dage (2d), 1 uge (1w) eller 2 uger (2U) af behandling og immunostained med syn303 (S303, 1:1000), et antistof, der er specifikke for oxideret og aggregerede αS. Celler var counterstained med DAPI. Konfokal billeder blev taget ved hjælp af en laser scanning Konfokal mikroskop, 63 X mål. Skalalinjen = 50 µm. (B) kvantitativ analyse af total fluorescence, efter baggrund subtraktion, blev gjort ved hjælp af partikler count plugin billede Jørgensen software. Værdier var normaliseret for antallet af kerner pr. felt (DAPI count) og udtrykkes som en procentdel af S303 fluorescens signal på 2D. Værdierne er angivet som den gennemsnit ± SD (n = 5). ** p < 0,001, *** p < 0.00001, One-way ANOVA, efterfulgt af Fisher's LSD post-hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Intracellulær αS inklusioner colocalize med kortikale neurites netværk. Repræsentative Konfokal billeder af kortikale neuroner behandlet med microsomes-associerede αS aggregater fra syge Tg mus. Efter 2 ugers behandling neuroner var fast og dobbelt farves med aggregater-specifikke antistoffer [S303 (A, B) eller pser129-αS, 1:1,000 (C)] og neurite markører [mus αS, 1:200 (A, B) eller Tau, 1:10,000 (C)]. Co mærkning af de fluorescerende signaler demonstreret delvis Co lokalisering af nydannede αS perle-lignende strukturer med neurites netværk. Lejlighedsvis ophobes αS inklusioner i de neuronale soma (A, B, pilespidser). Stablede billeder er anskaffet med en laser scanning Konfokal mikroskop, 63 X mål. Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra Colla et al. 20. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Tilsætning af suboptimal mængden af microsomes-associerede αS aggregater er giftigt for neuroner. DAPI farvning af neuroner behandlet med stigende koncentration af microsomes-associerede αS aggregater fører til celledød. (A) kortikale neuroner blev behandlet med 1, 2 µg for microsomes-associerede αS aggregater udvundet fra syge mus eller kun buffer, som ikke indeholder aggregater (B) og farves med DAPI. Fluorescerende billeder blev erhvervet med en epi-fluorescens mikroskop ved hjælp af en 20 X mål. Skalalinjen = 100 µm.(B) DAPI-positive celler blev talt ved hjælp af billede Jørgensen software. Grafen viser en reduktion i antallet af kerner med stigende koncentration af microsomes-associerede αS aggregater tilføjes neuronal medierne. Værdierne er udtrykt i % af b og er givet som den gennemsnit ± SD (n = 5), *** p < 0,0001, One-way ANOVA, efterfulgt af Fisher's LSD post-hoc test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi beskrevet en metode til at opnå dannelsen af αS optagelser i hjernen-afledte primære neuronal kulturer fra WT mus, gennem tilsætning af renset microsomes-associerede αS aggregater isoleret fra αS Tg dyremodeller.
Kritiske trin i denne protokol er følgende: forholdet mellem µg for microsomes-associerede αS aggregater/neuroner og kilde af αS aggregater. Som vist i resultaterne session, er det afgørende at optimere forholdet mellem µg for microsomes-associerede αS aggregater/antallet af neuroner, da arbejder i suboptimal betingelser kan føre til for tidlig celledød eller alt for knappe intracellulære sammenlægning (se den Repræsentative resultater afsnit). Derfor er det meget vigtigt at vurdere tætheden af neuronal kultur på DIV 7 (vist i figur 1) før du starter behandling. Derudover har αS aggregater skal renses fra syge αS Tg mus, dvs. fra dyremodeller, der ophobes præget LB-lignende optagelser af fosforyleres og vaskemiddel uopløselige αS HMW fibriller.
Mulige ændringer til denne protokol betragter væv, frosne eller friske, fra hvilke microsomes kan isoleres og grundbeløb. Mens vi brugt SpC af Tg mus på grund af det høje indhold af αS uopløselige aggregater, er protokollen egnet til at isolere microsomes-associerede aggregater fra noget væv, forudsat at området har et højt indhold i αS aggregater. Frosne prøver kan også bruges, eftersom indefrysning ikke påvirker rensning trin af microsomes-associerede aggregater eller de aggregater i sig selv. Mens den anbefalede startvægt for væv er omkring 100-150 mg, denne protokol er velegnede til at opnå microsomes fra så lavt som 50 mg af råmateriale (ingen maksimumsvægt). For beløb lavere end 100 mg, vil passende homogenisering forholdet dog være 1:20 (w/v) for at få mindst 1 mL af supernatanten S10 indlæses på polycarbonat flasken for ultracentrifuge nedbør. I virkeligheden, kan lastning mængder mindre end 1 mL resultere i sammenbrud af rør og prøve tabet. Stigende homogenisering volumen vil føre til en mere fortyndet supernatanten men koncentrationen af de mikrosomale pellet vil forblive upåvirket.
En begrænsning af denne protokol vedrører den ineffektive cross-såning i dannelsen af αS optagelser, der har været for nylig rapporteret i den sag administration af αS PFFs af menneskelig oprindelse til murine neuronal kulturer i stedet for musen αS PFFs24. Da øge mængden af eksogene αS fibriller givet til murine kulturer kan omgå dette problem, anbefaler vi fint tune mængden af microsomes-associerede aggregater for administration af fibriller fremstillet af andre αS varianter eller fra forskellige arter til musen neuronal kulturer end hvad vi beskrevet.
Eksogene αS aggregater tilføjes kultur medier kan være fra forskellige kilder. In vitro αS PFFs har tidligere været brugt som seeding skabelon af intracellulære αS aggregater i cellekulturer, primære neuroner og dyremodeller3,7,8,15. Sammenlignet med vores metode, hvor microsomes-associerede αS aggregater kan være isoleret i få timer, er dannelsen af PFFs lang og besværlig, der kræver flere trin af purifications, efterfulgt af yderligere assays til at kontrollere αS aggregater confomations25 . Derudover PFFs bliver fremstillet af bakteriel-udtrykt menneskelige eller mus αS, dvs. mangler posttranslationelle modifikationer typisk for eukaryoter, kan præsentere forskellige konformationer, med selektiv såning og sygdomsfremkaldende egenskaber, ifølge Nukleering protokoller fulgt (dvs. bånd vs fibriller)5,8 fører til forskellige resultater og konklusioner. I stedet, enkelt indgift af i vivo renset αS aggregater garanterer overførsel af mere autentisk patogene skabeloner, efterligne tæt processen med dannelsen af αS optagelser i dyremodeller og PD patienter.
Som en fremtidig anvendelse af denne teknik, mener vi, at denne protokol med held kan anvendes til at isolere αS patogene frø fra hjernen af PD patienter eller andre αS Tg dyremodeller, forudsat at syge området hvorfra microsomes er isoleret er rig på αS optagelser.
Til vores viden er dette den første metode, der giver mulighed for rensning af giftige arter af αS fra i vivo PD modeller anvendes som seeding skabelon for at opnå dannelsen af αS optagelser i primære neuroner.
Vi mener, at denne metode er meget alsidig og kan give en ekstraordinær celle-baseret model for at studere de forskellige aspekter af αS sammenlægning og dens indflydelse på celle patofysiologi. Fordi dannelsen af αS inklusioner repræsenterer en kompleks proces, der har været vanskelige at formere sig i kulturperler celler, er vi håber, at denne model vil give stor indsigt i akut patogene mekanismer, svært at identificere i kroniske og mere omfattende systemer er så som dyremodeller.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet støttet af den italienske Universitet og forskning (MIUR) gennem karriere Reintegration tilskudsordning (RLM Program for unge forsker) og fra Scuola Normale Superiore. Vi takker Prof Michael Lee fra University of Minnesota, USA, for at give Prp menneskelige A53T αS Tg mus, hvorfra aggregater er isoleret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
