Summary
Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.
Abstract
Yıl için hücre kültürlerinde çözünmez Alfa-synuclein (αS) kapanımlar oluşumunu çoğaltmak yetersizlik αS toplama Parkinson hastalığı (PD) çalışma odasında büyük bir sınırlama oldu. Son zamanlarda, hastalıklı αS transgenik fareler veya PD hastaların beyin özler eksojen aşılama yoluyla yeni hayvan modellerin gelişme αS toplama daha yeterli hücre modelleri oluşturma imkanı için yeni umut verdi. Ne yazık ki, hücre kültürlerinde gelince, yönetim ham beyin özler fareler gibi başarılı olarak kanıtlamıştır değil ve eksojen toplamları seçimi hala önceden oluşturulmuş vitro αS liflerinde kaynağıdır.
Yerli αS microsomes ilgili toplamları, transgenik fareler hastalıklı bölgelerden izole bir çok zehirli αS tür eksojen İdaresi ile birincil sinir hücreleri hücre içi αS kapanımlar oluşumu ikna etmek için bir yöntem geliştirdik. Microsomes veziküller ile ilişkili αS toplamları bu kısmını etkin bir şekilde içselleştirilmiş ve hücre içi kapanımlar fosforile ve isim αS için pozitif oluşumu indükler. Vitroiçin karşılaştırıldığında-rekombinant αS, bizim Yöntem yapılan ön şekillendirilmesi liflerinde daha hızlı ve patojenik tohum otantik αS toplamları ile yapılır garanti çıkarılan hastalıklı hayvan polisi, daha fazla taklit eden modellerden yakından türü kapanımlar içinde vivoelde. Sonuç olarak, durumu dokuların αS kapanımlar zengin zorunludur.
Biz bu yöntemi αS toplama ve ilgili hücresel patofizyolojisi vivo içinde mikroskobik yönlerini incelemek için çok yönlü bir hücre tabanlı modeli sağlayacak ve daha doğru ve sofistike hücre oluşturmak için bir başlangıç noktası olacaktır inanıyorum PD paradigması.
Introduction
Alfa-synuclein (αS) proteinaceous kapanımlar birikimi Parkinson hastalığı (PD) ve Alfa-synulceinopathies1, önemli ve önemli bir özelliğidir. Hayvan modelleri protein liflerinde2oluşumu için gerekli toplama adımları ikna etmek için yeterli bir hücresel ve biyokimyasal ortamı sağlamak mümkün olmakla birlikte, ne yazık ki, oluşumu karmaşık Lewy Body (LB) çoğaltma-tarihlerde toplamları Hücre kültürleri içinde zor ve zorlu.
Burada αS kapanımlar, hayvan modelleri ve kültürlü hücreleri, beyin izole fare birincil sinir hücreleri kullanarak PD hasta elde edilen protein toplamları benzer oluşumu ikna etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim protokol αS microsomes ilgili toplamları αS semptomatik transgenik (Tg) fareler fare hipokampal veya kortikal birincil nöronlar için izole eksojen yönetiminin temel alır. Bu yöntem, kültür ortamına eklenen bir kez içselleştirilmiş haline ve olgun αS pozitif toplamları3,4oluşumu teşvik edebiliyoruz αS toksik türleri yayılan ve yayılma yeteneği yararlanır, 5,6,7,8.
Aslında, αS liflerinde hücre kültürlerinde oluşumu elde etmek için standart yöntemleri düzenli transfection protokolleri veya aracılı viral enfeksiyon9ile ilgili αS cDNA overexpression dayalı idi. LB benzeri αS edinme ilk durumda toplamları düşük verimlilik gösterdi ve hücre türüne bağlı tesadüfi, iken ikinci protokolü çözünmez liflerinde, yüksek molekül ağırlıklı (HMW) türler de dahil olmak üzere 24-48 h--dan hastalık oluşumuna yol açtı 10. Bu yöntemler toplamları oluşumu muhtemelen bir aşırı nedeniyle oldu ve toplama dikte αS uyum patolojik bir dönüşüm yerine çözünmez hale αS protein tutardaki dengesiz. Bunun yerine, biz burada bulunuyorlar teknik αS ifade düzey değiştirmez ama yaygın protein toplama eksojen liflerinde içselleştirilmesi nedeniyle neden olmaktadır. Ayrıca, αS toplamları eksojen liflerinde yönetim aracılığıyla oluşumu günler ya da haftalar bize erken ve orta düzey aşamaları αS kapanımlar oluşumu hızlandırılmış bir moda çalışmaya izin ayrıntılı olmak gerektiren uzun bir süreçtir ve hücresel biyokimyasal değişiklikler ile ilişkilendirmek için. Böylece, bizim αS toplama αS fibril oluşumu olarak hücresel patofizyolojisi ile ilgili olarak çalışmak yararlı olan hücresel modeller oluşturmak için değerli bir uygulama yöntemidir.
Yönetim ham beynin hastalıklı αS Transgenic (Tg) fareler11,ayıklar Ayrıca12 -insan PD beyin6,13 αS ifade Tg veya vahşi-tipi (WT) hayvanlar, uygulama ikna etmek mümkün olsa da Hücre kültürleri için aynı yordamı muhtemelen kullanılan örnekler toplamları düşük miktarda ve yerel αS zehirli türün14yalıtmak için standart bir prosedür olmaması nedeniyle başarılı olmak için kanıtlamıştır değil. Bu nedenle, önceden oluşturulmuş vitro liflerinde (PFFs) αS kadar αS kapanımlar hücrelerdeki indüksiyon için Şimdi seçim toplamları kaynağı olmuştur ve hayvan3,4,6,7 modelleri ,15,16. Bizim iletişim kuralıyla ancak, microsomes ilgili αS toplanan türler αS Tg fareler izole verimli bir şekilde hücre içi LB benzeri αS kapanımlar birincil nöronlar içinde birikimi tetikleyebilir gösteriyoruz.
Bizim laboratuarımızda microsomes ilişkili αS toplanan türler insan A53T αS gen fare prion protein (PrP) Organizatörü [Prp insan A53T αS Tg fareler, hat G2-317] kontrol altında ifade hastalıklı Tg farelerin omurilik (SpC) dokusundan izole edilmiştir. Sağlam motor fonksiyon bozukluğu ve kapanımlar oluşumu merkezi sinir sistemi içerir bir yaş bağımlı nörodejeneratif fenotip yapılmış bu fareler Haritayı fosforile, ubiquitinated ve sonra 9 ay-in yaş başlangıç çözünmez αS. Motor fonksiyon bozukluğu göründüğünde, fenotip içine 2-3 hafta içinde ölüme götüren arka bacaklarda başlayan felç hızla gelişmektedir. αs toplamları birikimi hastalığı tezahürü paraleldir. Motor disfonksiyon başlangıcında feda fareler αS toplama güçlü bir ölçüde SpC, beyin ve beyincik göster. Fare feda etmeye felç ayarlar beklemek gerek yoktur. Presymptomatic fareler motor fonksiyon bozukluğu görüntülemeyen 9 ay-yaşlı hayvanlar alınır.
Protocol
WT ve Tg hayvanlar kullanımı onaylanmış ve tam tarafından ulusal ve uluslararası yasa laboratuvar hayvan refahı ve deneme (EEC Konsey 86/609, 12 Aralık 1987 yönergesi ve yönergesi 2010/63/AB, 22 Eylül 2010) için uyulması. Bu raporda açıklanan tüm iletişim kuralları kuruluşumuzun hayvan bakımı yönergeleri izleyin.
1. αS Microsomes ilgili toplamları üzerinden hastalıklı A53T αS Tg fareler yalıtım
- 250 mM sükroz, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM EDTA ve 1 x fosfataz/proteaz-inhibitörleri oluşan homojenizasyon arabellek hazırlayın. Arabellek buz üzerinde tutun.
- Taze homojenize veya doku 1:10 içinde donmuş buz gibi homojenizasyon arabelleği bir Teflon kullanarak hacmi (w/v) havaneli homogenizer, 10-15 vuruş ile.
- İlk homogenate (1-2 mL) bir microcentrifuge tüp ve çekirdek ve kesilen hücreleri elde edilen Pelet (P1) kaldırmak için Soğutmalı Santrifüj kullanarak 4 ° C'de 10 dakika 1000 × g, santrifüj aktarın. P1 atmak.
- Süpernatant (S1) bir temiz microcentrifuge tüp aktarmak ve Soğutmalı Santrifüj ikinci süpernatant (S10) ve Pelet (P10) elde etmek için kullanarak 4 ° C'de 20 dk için 10.000 × g de S1 santrifüj kapasitesi.
Not: Mitokondri ve synaptosomes içeren bir ham membran Pelet P10 var. P10 atmak. - Polikarbonat şişe süpernatant (S10) aktarım (> 1 mL) ve bir ultracentrifuge ve bir sabit açılı rotor kullanarak 4 ° C'de 1 h için 100.000 × g de S10 santrifüj kapasitesi (90 Ti).
Not: Pelet, P100, microsomes ilişkili αS toplamları içeren süpernatant saf sitozol kesir iken. - P100 Pelet 500 µL homojenizasyon arabelleği ile resuspend. P100 bir temiz microcentrifuge tüp ve Soğutmalı Santrifüj 4 ° C'de 20 dk için 10.000 × g, santrifüj aktarın.
- Süpernatant atın ve P100 homojenizasyon arabellek 100 µL ile resuspend.
Not: Bu kesir microsomes ilişkili αS toplamları alınır. - Örnekleri 2 için solüsyon içeren temizleyicide buz [set çıkış güç 1 watt (RMS)] s. Örnekleri-80 ° C'de depolayın
- Bir gün sonra BCA analizi ile protein miktarını belirlemek.
2. Western Blot
Not: αs microsomes ilgili toplamları biyokimyasal karakterizasyonu Western Blot tarafından değerlendirilir.
- Bir degrade 4-%20 Tris-glisin polyacrylamide jel dikey Elektroforez cihazları üzerinde döküm.
- Denaturing örnek arabellekte çözünmüş microsomes ilişkili αS kesirler 1 µg yükleyin.
- Farklı bir kuyuda protein standart işaretleyicinin 5 µL yükleyin.
- Jel 100 V bir Tris/glisin/SDS protein marker jel sonuna ulaşana kadar tampon çalıştıran içinde çalıştırın.
- Bir temel karbonat tampon kullanarak bir nitroselüloz membran proteinleri transfer (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, % 20 metanol) O/N 200 4 ° C'de Anne, sürekli.
- Membran ile PBS-noniyonik yüzey aktif %0,05 (PBS-T) %5 yağsız Kuru süt için 30 dk RT. az bir orbital çalkalayıcı ile engellemek
- Kısaca, durulama zar ile PBS-T.
- Syn-1 (1:5, 000) veya pSer129-αS antikor (1:5, 000) PBS-t, O/N bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de % 2.5 yağsız Kuru süt membran kuluçkaya.
- RT PBS-T bir orbital çalkalayıcı ile membran 10 dakika yıkayın.
- Membran ile Anti-fare ya da anti-tavşan HRP Birleşik ikincil antikor (1:3, 000) % 2.5 yağsız Kuru süt PBS-t RT. 1 h için kuluçkaya
- RT PBS-T bir orbital çalkalayıcı ile membran 10 dakika yıkayın. 3 x tekrarlayın.
- Düzenli Kemiluminesan kitleri aracılığıyla sinyal elde edilir.
3. birincil nöronal kültürler
Not: Birincil nöronal kültürler WT yeni doğan (P0) farenin hipokampus veya korteks (hat C57BL/6) hazırlanmıştır. Santrifüjü adımları eksi bütün prosedür bir hücre kültür mahallede Steril koşullar altında gerçekleşir.
- RT coverslips (18 mm Ø) % 65 nitrik asit çözüm için en az 12 h ile tedavi
- Nitrik asit kaldırın. Coverslips iki kez PBS 10 x ile ve birkaç kez distile su ile durulayın.
- Coverslips 24-iyi yemekleri eklemek ve onları poli-D-lisin ile kat (0.1 mg/mL steril distile su veya PBS 1 x) 37 ° C'de 1 h için
- Poli-D-lizin kaldırmak ve coverslips üç kez distile su ile yıkayın. İhtiyaç kadar 4 ° C de stok onları.
- İşten çıkarma tarafından fare pups ötenazi ve kafaları vücutlarından ayrı. Kafaları yemekleri yerleştirin ve nazikçe cildi incelemek.
- İyi makas kullanarak, kafatası beyin üslerini bir kesi yaparak dosyayı açtı. "Kurukafalar" iki yarısını ayrı ve onları dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Forseps kullanarak, bazlar gelen beyin kapalı çimdik ve korteks ve hipokampus izole etmek. Onları Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) orta % 1 penisilin/streptomisin içeren içeren iki ayrı yemeklerin aktarın.
- Adım 3,6 ve 3,7 her hayvan için yineleyin. Tüm süreç daha--dan 30-45 dk almamalıdır unutmayın.
- Toplanan doku kıyma ve tripsin %0,1 içeren HBSS orta 10 mL ile iki 50 mL konik tüp (hipokampus) diğeri korteks için içine aktarabilirsiniz. 7 dk. 37 ° C'de için su banyosunda kuluçkaya
Not: Hiçbir ajitasyon gereklidir. - 1 mL % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 10 µg/mL DNaz homogenate içeren DMEM tripsin faaliyetleri engellemek için ekleyin.
- Elde edilen Disosiye doku üzerinde bir santrifüj RT, 5 min için 200 × g, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
Not: Pelet dokudan disseke hücreleri temsil eder. - Kaplama orta, % 10 %2 B27, 2 mM glutamin, 6 mg/mL glikoz, içeren hücrelerde resuspend FBS, 12,5 µM glutamat ve 10 µg/mL gentamisin.
- Plaka ayrışmış nöronlar poli-D-lizin coverslips oranı göre 24 iyi tabak içinde Tarih: 1 korteks/12 kuyu ve 1 hipokampus/6 wells, iyi başına yaklaşık 150.000/200.000 hücre sonuçlanan. 37 ° C'de kuluçka hücreleri korumak
- Bir gün sonra (gün vitro, DIV 1), %2 B27, 10 µg/mL gentamisin ve 2 mM glutamin içeren orta ile kaplama orta değiştirin.
- Sayı 2, 1/3 orta çıkarın ve 1/3 2.5 µM sitozin arabinoside gliyal kirliliği azaltmak 48 saat için içeren taze orta ekleyin.
- Nöronlar 37 ° C'de korumak ve orta yarısı yerine üç günde.
4. nöronlar tedavi
Not: Tedavi DIV 7'de sahne aldı. Tüm belgili tanımlık merdiven steril koşullarda hücre kültür başlık altında devam. Bir örnek kortikal nöronal kültür yoğunluğu DIV 7 Şekil 1' de gösterilmiştir.
- αs microsomes ilgili toplamları seyreltme için orijinal homojenizasyon tampon kullanarak bir 1 µg/µL çözüm için üç farklı hastalıklı Tg farelerin omurilik elde edilen havuz.
- 1/3 orta çıkarın ve hafifçe %2 B27, 1 x 2 mM, gentamisin ve glutamin içeren taze orta ile değiştirin.
- Havuza alınan αS microsomes ilgili toplamları 1 µg cep orta olarak ekleyin. 37 ° C'de kuluçka dönüş nöronlar
- 3 günde 1 hafta, 1/3 taze orta ekleyin. Orta yerine koymayın. Sadece ekleyin.
- 1 hafta sonra tedavi, 1/3 orta çıkarın ve hafifçe %2 B27, 10 µg/mL gentamisin ve 2 mM glutamin içeren taze orta ile değiştirin. 3 günde bir tekrarlayın.
- Nöronlar tedavi (DIV 21) 2 hafta sonra düzeltmek.
5. ayirt
- PBS % 2 paraformaldehyde ile sinir hücreleri tamir 1 x ve %5 sükroz çözüm sallayarak, olmadan 15 dakika RT adlı bir kimyasal altında duman hood.
- Sabitleme çözüm kaldırın. Kısaca, PBS ile 1 x, 3 kez yıkayın.
Not: birincil nöronlar sıkıca poli-lizin coverslips için sopa olamaz çünkü yavaşça tüm çamaşır adımları gerçekleştirin. - Nöronlar PBS 1, Nonyonik yüzey aktif % 0.3'ile permeabilize x 5 dk RT. az için
- Kısaca, PBS ile 1 x, 3 kez yıkayın.
- Nöronların % 3 ile kuluçkaya FBS PBS 1 x 30 dk RT belirsiz bağlama sitelerinde bir orbital çalkalayıcı engellemek için az için.
- Yılında % 3 çözünmüş uygun birincil antikor ile nöronlar kuluçkaya FBS PBS 1 x, O/N bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de.
Not: syn303 (1:1, 000), fare αS (1: 200), pser129-αS (1:1, 000) ve Tau (1:10, 000) antikorları kullanılmıştır. - Antikor çözüm ve yıkama, kısaca, PBS 1 x, 3 kez ile kaldırın.
- Nöronlar uygun floresan ikincil antikor %3 içinde çözünmüş ile kuluçkaya FBS PBS, karanlıkta bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT, 1 h için.
- Antikor çözüm ve yıkama, kısaca, PBS 1 x, 3 kez ile kaldırın.
- Nöronlar DAPI çözüm ile leke (PBS 1 0.1 µg/mL x) içinde belgili tanımlık karanlık bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT, 15 dakika.
- Antikor çözüm ve yıkama, kısaca, PBS 1 x, 3 kez ile kaldırın.
- Mount coverslips kullanarak antifade montaj orta bir slayttaki.
Representative Results
Protokol sonrası yukarıda açıklanan ve Şekil 2' de özetlenmiştir, biz αS microsomes ilgili toplamları üzerinden üç hastalıklı A53T αS Tg fare (Şekil 3) saf. Microsomes endoplazmik retikulum, Golgi ve küçük sinaptik veziküller içeren ham membran Pelet kesirler bulunmaktadır. Diğer kesirler için karşılaştırıldığında mikrozomal Pelet saflık derecesini önceden belirli organel işaretleri18kullanılarak değerlendirilmiştir.
Bir zamanlar αS toplamları biyokimyasal karakterizasyonu kuluçka Syn-1 veya serin 129 (pSer129-αS) antikor, fosforile αS ardından denaturing SDS-sayfası üzerinden değerlendirilir. Presymptomatic (PreS) ve yaş eşlemeli sigara-Tg (nTg) fareler, hasta farelerin ortak çökelti αS toplamları ile gelen izole microsomes karşılaştırıldığında. Microsomes ilişkili αS türler αS toplayan, birikimi HMW deterjan dirençli türler, fosforilasyon serin 12919 ve C gibi tipik özelliklerini göster- ve N-terminal kesilmiş parçaları (için tam bir karakterizasyonu αS microsomes ilgili toplamları başvuru18,20,21' e bakın). Monomeric αS değil de verimli bir şekilde içselleştirilmiş ve αS ifade7,15,22teşvik değil beri bunlar temel gereksinimleri vardır. Herhangi bir deterjan (İyonik veya non-iyonik) hücreleri için zararlı olabilir bu yana P100 granül resuspend için kullanmamanız önemlidir. Ayrıca, örnek değişkenlik önlemek amacıyla, microsomes ilişkili αS toplamları üzerinden üç farklı hastalıklı fare nöronal tedavi için havuza.
Havuza alınan microsomes ilişkili αS toplamları üzerinden hastalıklı A53T fareler kortikal veya hipokampal nöronların kültür orta 1 µg İdaresi αS kapanımlar, toplamları özel αS karşı antikorlar gibi olumlu bir saat-bağımlı oluşumu neden olmaktadır. Syn303 (Şekil 4, 5) veya pser129-αS (Şekil 5). İki gün sonra bu toplamları görünür sonraki zaman noktalarda daha bol olacak küçük, dağınık puncta olarak tedavi (2d). İki hafta sonra αS kapanımlar uzun benzer ve boncuk benzeri yapıları, ağır olgun takip neurite desen ve kısmen ile presynaptic'ı Co yerelleştirme nöronal kültürleri boyunca yayılmış ve neurites işaretleri (Şekil 5). Zaman zaman, yeni kurulan αS kapanımlar Co yerelleştirilmesine ve hücre soma leke veya nekrotik neurites benzeyen tüm süreç, kapak için görülebilir.
αs microsomes ilgili toplamları kesirler verimli nöronal kültürlerde yayılabilir, kendi tutar ince kaplama nöronlar (Şekil 1) sayısı şekilde ayarlanmış vardır. Aslında, önerilen oranı, microsomes ilgili toplamları µg aşan: nöron, numara αS microsomes ilgili toplamları yetersiz bir miktar olacak yol süre zarfında birkaç yaşam (Şekil 6), erken hücre ölümü neden bir tedavi, ne için benzer iki hafta sonra kapanımlar kıt ve sınırlı sayıda önceki zaman noktalarda (Şekil 4A) elde edildi.
Resim 1 . Kortikal nöronal kültürler. Yoğunluğu kortikal nöronal kültürlerin DIV 7'de gösterilen temsili resim. Görüntüleri bir ters ışık mikroskobu, 10 X amacı ile alındı. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . αs microsomes ilişkili olan agrega fare SpC. Microsomes ilişkili αS arıtma Protokolü akış çizelgesi hastalıklı fareler SpC toplar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Tg ve nTg A53T αS fareler hastalıklı, presymptomatic üzerinden microsomes kesirler işlemleri olan. Western blot Analizi gösteren saf αS microsomes ilgili toplamları üç hastalıklı (hasta), izole presymptomatic (PreS) ve yaşlı eşlemeli nTg fareler. Hastalıklı fareler vardır presymptomatic hayvanların sağlıklı A53T iken αS kapanımlar, birikimi de dahil olmak üzere motor ve nörolojik disfonksiyon göster A53T αS Tg fareler αS Tgs görünmüyor yaş henüz herhangi bir αS patoloji 9 aylık fenotip ilgili. nTg fareler αS transgene olarak yerine ve bu nedenle αS geliştirmek mi hastalıklı fareler littermates patoloji indüklenen vardır. saflaştırılmış her kesirler 1 µg denaturing SDS-sayfasında çalıştırılan, nitroselüloz membran üzerinde transfer ve Syn-1 veya pSer129-αS antikor ile deyimiyle. Microsomes kesirler hasta fareler serin 129 fosforile ve C gösterdi içerilen HMW deterjan dayanıklı αS toplamları izole sadece- ve N-terminal kesme. Bu rakam Colla vd adapte edilmiş 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Saat-bağımlı indüksiyon αS ifade αS microsomes ilgili toplamları yönetim sonra. (A) ayirt birincil hipokampal nöronların tedavi ile 1 µg microsomes ilişkili αS, üç farklı hastalıklı fare havuzlu kesirler toplar. Nöronlar günde 2 sabit (2d), 1 hafta (1w) ya da 2 hafta (2w) tedavi ve syn303 ile immunostained (S303, 1: 1000), bir antikor için belirli okside ve αS toplanan. Hücreleri DAPI ile counterstained. Confocal görüntüleri confocal mikroskop, 63 X amaç tarama bir lazer kullanarak alındı. Ölçek çubuğu arka plan çıkarma sonra 50 µm. (B) kantitatif analizini toplam fluorescence =, yapıldı parçacıkları sayısı eklentisi görüntü J yazılım kullanarak. Değerler alan (DAPI sayısı) başına çekirdek sayısı için normalleştirilmiş ve S303 floresans sinyalinin 2D, yüzde olarak ifade. Değerleri ortalama ± SD verilmiştir (n = 5). ** p < 0,001, *** p < 0,00001, One-way ANOVA, Fisher'ın LSD post-hoc testi ile izledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Hücre içi αS kapanımlar kortikal neurites ağ ile colocalize. Hastalıklı Tg fareler elde edilen αS microsomes ilgili toplamları ile tedavi kortikal nöronların temsilcisi confocal görüntüleri. Sabit ve çift tedavi nöronların 2 hafta sonra toplamları özel antikorlar [S303 (A, B) ya da pser129-αS, 1:1,000 (C)] ve [fare αS, 1: 200 (A, B) veya Tau, 1:10,000 (C)] neurite işaretçileri olan lekeli. Floresan sinyallerini birlikte etiketleme neurites ağ ile yeni kurulan αS boncuk benzeri yapıların ortak kısmi yerelleştirme gösterdi. Zaman zaman αS kapanımlar nöronal soma (A, B, ok uçları) içinde birikir. Yığılmış görüntüleri confocal mikroskop, 63 X amaç tarama bir lazer ile elde. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu rakam Colla vd değiştirildi 20. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . αs microsomes ilgili toplamları suboptimal miktarı ilavesi nöronlar için toksiktir. αs microsomes ilgili toplamları konsantrasyonu artan ile tedavi nöronların DAPI boyama hücre ölümüne yol açar. (A) kortikal nöronlar tedavi edildi 1, αS microsomes ilgili toplamları 2 µg çıkarılan hastalıklı fareler veya olmayan öğeler tek tampon (B) toplar ve DAPI ile lekeli. Floresan görüntüleri bir 20 X hedefi kullanarak bir epi-floresans mikroskobu ile elde. Ölçek çubuğu 100 µm.(=B) DAPI pozitif hücreler sayılır görüntü J yazılım kullanarak. Grafik, nöronal ortama eklenen αS microsomes ilgili toplamları konsantrasyonu artan çekirdek sayısında bir azalma gösterir. Değerleri b % ifade edilir ve ortalama ± SD verilmiştir (n = 5), *** p < 0,0001, One-way ANOVA, Fisher'ın LSD post-hoc testi ile izledi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
αs Tg hayvan modellerden izole saf αS microsomes ilgili toplamları, aracılığıyla WT fareler αS kapanımlar beyin kaynaklı birincil nöronal kültürlerde oluşumu almak için bir yöntem açıkladığımız.
Bu protokol önemli adımlar şunlardır: oranı µg microsomes ilişkili αS toplamları/nöronların ve αS toplamları kaynağıdır. Sonuçları oturumda gösterildiği gibi bu suboptimal koşullarda çalışma erken hücre ölümü veya çok az hücre içi toplama yol açabilir beri µg microsomes ilişkili αS toplamları/dizi neurons oranını optimize etmek önemlidir (bkz: Temsilcisi sonuçları bölümü). Bu nedenle, bu sayı 7 ( Şekil 1' de gösterilen) nöronal kültür yoğunluğu tedaviye başlamadan önce değerlendirmek çok önemlidir. Ayrıca, αS toplamları hastalıklı αS Tg fareler, yanisaf zorunda. birikir hayvan modellerden LB benzeri kapanımlar HMW liflerinde fosforile ve deterjan çözünmez αS tarafından karakterize.
Bu iletişim kuralı için olası değişiklikler doku, dondurulmuş veya taze, hangi microsomes ayrılmış olabilir ve başlangıç tutarı ilgili. Tg SpC fareler αS çözünmez toplamları yüksek içerik nedeniyle kullanılan süre alanının içeriği yüksek αS toplamları sahip olması koşuluyla protokol microsomes ilgili toplamları üzerinden herhangi bir doku yalıtmak uygundur. Donma microsomes ilgili toplamları veya toplamları özüarıtma adımlardan etkilemez beri Donmuş numuneler de kullanılabilir. Dokular için önerilen Başlangıç ağırlığı yaklaşık 100-150 mg olmakla birlikte, bu protokolü üzerinden microsomes elde etmek için uygun hammadde (ağırlık maksimum sınır yok) 50 mg olarak düşük. Tutarı 100 mg düşük olması durumunda, ancak, uygun homojenizasyon oranı 1:20 (w/v) en az 1 mL ultracentrifuge yağış Polikarbonat şişe yükleneceğini süpernatant S10 sağlamak için olacaktır. Aslında, 1 mL küçük birimlere yükleme tüp ve örnek kaybı çöküşü neden olabilir. Homojenizasyon cilt artan bir daha seyreltilmiş süpernatant için yol açacaktır ancak mikrozomal Pelet konsantrasyonu etkilenmemiş kalır.
Bu iletişim kuralı bir sınırlama verimsiz çapraz-tohum fare nöronal kültürlere karşı fare αS PFFs24αS PFFs insan kaynaklı olgu yönetiminde son zamanlarda bildirilmiştir αS kapanımlar oluşumunda ilgilendiriyor. Fare kültürler için verilen eksojen αS liflerinde miktarını artırarak bu sorun atlayabilir aldığından, ince agrega microsomes ilişkili diğer αS türevleri veya farklı elde liflerinde, yönetimi söz konusu olduğunda miktarını ayarlamak için önerilir Ne açıkladığımız daha fare nöronal kültürler için türler.
Eksojen αS toplamları kültür ortama eklenen farklı kaynaklardan olabilir. Vitro αS PFFs daha önce sağlanan şablon hücre içi αS toplamları hücre kültürleri, birincil nöronlar ve hayvan modelleri3,7,8,15/ olarak kullanılmaktadır. Nerede microsomes ilgili αS toplamları birkaç saat içinde izole bizim yöntemi, PFFs oluşumu uzun ve zahmetli, αS confomations25 toplar denetlemek için ek deneyleri tarafından takip purifications, birden çok adım gerektiren karşılaştırılır . Buna ek olarak, bakteriyel ifade insan veya fare αS elde PFFs, yani eksik olan ardından değişiklikler Ökaryotlar tipik sunabilirim farklı biçimler, seçici tohum ve patojenik özellikleri ile göre çekirdekleşme protokolleri (yani kurdela vs liflerinde)5,8 farklı sonuçlar ve sonuçlara yol izledi. Bunun yerine, in vivo saf αS agrega tek yönetim iletim yakından αS kapanımlar hayvan modelleri ve PD oluşumu süreci taklit eden, daha gerçekçi patojenik şablonları garanti eder.
Bu teknik yönelik bir uygulama, biz αS içinde zengin hastalıklı alana hangi microsomes izole olması koşuluyla bu iletişim kuralı başarıyla αS PD hastaların beyin ya da diğer αS Tg hayvan modelleri, patojenik tohumlarından izole etmek için kullanılabileceğini inanıyorum kapanımlar.
Bilgimizi, bu toksik tür yerli tohum oluşumu αS kapanımlar birincil nöronlar içinde elde etmek için şablon olarak kullanılacak vivo içinde PD modellerden αS arınma sağlar ilk yöntemdir.
İnandığımız bu yöntem son derece çok yönlü ve αS toplama ve hücre patofizyolojisi üzerindeki etkisi farklı yönlerini incelemek için olağanüstü bir hücre tabanlı modeli sağlayabilir. αs kapanımlar oluşumu temsil çünkü kültürlü hücrelerde çoğaltmak zor olan karmaşık bir süreç, biz bu modeli akut patojenik mekanizmaların, kronik ve daha ayrıntılı olarak tanımlamak zor, büyük anlayışlar sağlayacaktır umutlu hayvan modelleri gibi sistemlerdir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser sayesinde kariyer Reintegration grant (RLM Program genç araştırmacı için) İtalyan Bakanlığı Üniversite ve araştırma (MIUR) tarafından desteklenmiştir ve Scuola Normale Superiore üzerinden. Prof Michael Lee: Minnesota Üniversitesi, USA, Tg fareler, hangi toplamları izole Prp insan A53T αS verdiğiniz için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
- Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
- Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
- Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
- Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
- Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
- Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
- Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
- Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
- Fujiwara, H., et al.
- Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
- Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
- Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
- Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).
