Summary
O objetivo do presente protocolo é fornecer um sistema celular que Replica a formação do alfa-synuclein agrega na vivo. Inclusões intracelulares alfa-synuclein são semeados nos neurônios primários pela internalização e propagação de exógeno administrado agregados nativo associado microssomas alfa-synuclein, isolados de ratos transgênicos doentes alfa-synuclein.
Abstract
Durante anos, a incapacidade de replicar a formação de inclusões de alfa-synuclein insolúveis (αS) em culturas de células tem sido uma grande limitação no estudo da agregação de CORS na doença de Parkinson (PD). Recentemente, o desenvolvimento de novos modelos animais através da inoculação exógena de extractos de cérebro de ratos transgénicos CORS doentes ou pacientes com DP deu novas esperanças para a possibilidade de criação de modelos mais adequados de célula de agregação de CORS. Infelizmente, quando se trata de células em culturas, administração de extratos crus de cérebro não provou tão bem sucedida como ratos e a fonte de escolha dos agregados exógenas ainda é em vitro pré-formado fibrilas de CORS.
Nós desenvolvemos um método para induzir a formação de inclusões intracelulares CORS nos neurônios primários através da administração exógena de nativo CORS microssomas-associados agregados, uma espécie de CORS altamente tóxicas isolada de áreas doentes de ratos transgênicos. Esta fração de agregados de CORS que está associada com as vesículas microssomas, é internalizada de forma eficiente e induz a formação de inclusões intracelulares positivos para agregados e fosforilada CORS. Em comparação com em vitro-fibrilas pré-formados que são feitas de CORS recombinantes, nosso método é mais rápido e garante que a semeadura patogênica é feita com agregados de CORS autêntico extraído de modelos animais doentes de PD, imitando mais estreitamente o tipo de inclusões Obtém em vivo. Como resultado, a disponibilidade de tecidos ricos em inclusões de CORS é obrigatória.
Acreditamos que esse método irá fornecer um modelo versátil de célula para estudar os aspectos microscópicos da agregação de CORS e a fisiopatologia celular relacionados na vivo e será um ponto de partida para a criação de célula mais precisa e sofisticada paradigma de PD.
Introduction
Acúmulo de alfa-synuclein (αS) inclusões proteicas é uma característica proeminente e importante de Parkinson doença (PD) e alfa-synulceinopathies1. Infelizmente, enquanto modelos animais são capazes de fornecer um ambiente de celular e bioquímico suficiente para induzir as etapas de agregação necessárias para a formação de fibrilas de proteína2, replicando a formação do corpo de Lewy complexo (LB)-como agregados em culturas de pilha é difícil e desafiador.
Aqui nós descrevemos um método para induzir a formação de inclusões de CORS, semelhantes à proteína agregados obtidos em modelos animais e em pacientes com DP, em culturas de células, usando os neurônios primários de rato do cérebro isolado. Nosso protocolo baseia-se a administração exógena de CORS microssomas-associados agregados isoladas de CORS sintomático transgénica (Tg) dos ratos para neurônios primários hippocampal ou cortical de rato. Este método aproveita a capacidade de difusão e propagação de espécies tóxicas de CORS, que, quando adicionado ao meio de cultura, são capazes de se tornar internalizada e induzir a formação de agregados maduros de CORS-positivo3,4, 5,6,7,8.
Originalmente, os métodos padrão para obter a formação de fibrilas de CORS em culturas de células foram baseados na superexpressão do cDNA correspondentes αS através dos protocolos de transfeccao regular ou infecção viral mediada9. Enquanto no primeiro caso, obtenção de CORS LB-como agregados foram fortuitos, mostrou baixa eficiência e dependia do tipo de célula, o segundo protocolo levou à formação de fibrilas insolúveis, incluindo espécies de alto peso molecular (HMW) em 24-48 h de infecção 10. em um desses métodos, a formação de agregados era provavelmente devido a um excessivo e desequilibrada em quantidade de proteína de CORS que se torna insolúvel ao invés de uma conversão patológica da conformação de CORS que dita a agregação. Em vez disso, a técnica que apresentamos aqui não altera o nível de expressão de CORS mas induz agregação de proteínas generalizada devido a internalização de fibrilas exógenas. Além disso, a formação de agregados de CORS através da administração de fibrilas exógenas é um processo moroso que requer dias ou semanas para se tornar exaustiva, permitindo-nos estudar estágios precoce e intermediários da formação de inclusões CORS forma um lapso de tempo e para correlacioná-lo com as alterações bioquímicas celulares. Assim, nosso método é uma aplicação valiosa para criar modelos de celulares da agregação de CORS que são úteis para estudar a formação de fibrila CORS microscopicamente em relação à fisiopatologia celular.
Além disso embora administração do cérebro cru extrai de CORS doentes de camundongos transgênicos (Tg)11,12 ou PD humano cérebro6,13 é capaz de induzir a deposição de CORS em Tg ou tipo selvagem (WT) animais, aplicação do mesmo procedimento para as culturas de células não provou ser tão bem sucedido, possivelmente devido a baixa quantidade de agregados nas amostras utilizadas e a falta de um procedimento padrão para isolar CORS nativo espécies tóxicas14. Por isso, em vitro pré-formado fibrilas (PFFs) de CORS têm sido a fonte de agregados de escolha até agora para a indução de inclusões de CORS nas células e animal modelos3,4,6,7 ,15,16. Com nosso protocolo, no entanto, nós mostramos que espécie de agregados microssomas associada αS isolado de ratos de Tg CORS eficientemente pode induzir a acumulação de inclusões de CORS LB-como intracelulares nos neurônios primários.
Em nosso laboratório, espécies agregadas CORS microssomas associadas são isolados do tecido da medula espinhal (SpC) dos ratos doentes Tg expressando o gene humano de CORS A53T sob o controle do rato príon proteína (PrP) promotor [Prp humano A53T CORS Tg ratos, linha G2-3,17]. Estes ratos mostram um fenótipo de idade-dependente neurodegenerativas que inclui disfunção motora robusta e formação de inclusões no sistema nervoso central constituído fosforilada, ubiquitinated e insolúvel CORS, começando depois de 9 meses de idade. Uma vez que a disfunção motora aparece, o fenótipo rapidamente evolui para paralisia, a partir de membros posteriores, o que leva à morte em 2-3 semanas. Acumulação de agregados de CORS paralelo a manifestação da doença. Camundongos sacrificados no início da estação a disfunção motora mostram um robusto nível de agregação de CORS no SpC, tronco cerebral e cerebelo. Não há nenhuma necessidade de esperar até paralisia define a sacrificar o mouse. Pré-sintomático ratos são tomados em 9 meses de idade animais que não são exibidos com disfunção motora.
Protocol
A utilização de animais WT e Tg foi aprovada e cumprida na íntegra pelo nacional e internacional as leis para o bem-estar dos animais de laboratório e experimentação (CEE Conselho Directiva 86/609, 12 de dezembro de 1987 e Directiva 2010/63/UE, 22 de setembro de 2010). Todos os protocolos descritos neste trabalho sigam as orientações de cuidados com animais de nossa instituição.
1. isolamento de CORS microssomas-associados agregados de A53T doentes αS Tg ratos
- Prepare o tampão de homogeneização que é composto de sacarose de 250 mM, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2, EDTA 2 mM e 1 x fosfatase /-inibidores da protease. Mantenha o buffer no gelo.
- Homogeneizar o fresco ou congelado o tecido em um 01:10 volume de (p/v) de tampão de homogeneização gelada usando um Teflon judiava homogenizador, com pinceladas de 10-15.
- Transferência inicial homogeneizado (1-2 mL) para um tubo de microcentrifugadora e centrifugar a 1.000 × g por 10 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga refrigerada para remover células ininterrupta e núcleos no sedimento resultante (P1). Descarte a P1.
- Transferir o sobrenadante (S1) para um tubo limpo microcentrifuga e centrifugar S1 a 10.000 × g por 20 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga refrigerada a fim de obter o segundo sobrenadante (S10) e o pellet (P10).
Nota: P10 é uma pelota crua de membrana que contém mitocôndrias e sinaptossomas. Descarte o P10. - Transferir o sobrenadante (S10) para um frasco de policarbonato (> 1 mL) e centrifugar S10 a 100.000 × g, durante 1 h a 4 ° C, usando um se e um rotor de ângulo fixo (90 Ti).
Nota: O sobrenadante é a fração de puro citosol enquanto o pellet, P100, contém agregados CORS microssomas associadas. - Ressuspender o P100 com 500 µ l de tampão de homogeneização. Transferi o P100 para um tubo limpo microcentrifuga e centrifugar 10.000 × g por 20 min a 4 ° C em uma centrífuga refrigerada.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender P100 com 100 µ l de tampão de homogeneização.
Nota: Esta fração é os agregados de CORS microssomas associadas. - Proceda à sonicação amostras para 2 s no gelo [1 watts (RMS) de potência de saída definido]. Armazenar as amostras a-80 ° C.
- No dia seguinte, determinar a quantidade de proteína usando análise BCA.
2. Western Blot
Nota: Caracterização bioquímica dos agregados CORS microssomas associada é avaliada por Western Blot.
- Lançar um gel de polyacrylamide do Tris-glicina gradiente 4-20% sobre um aparelho de eletroforese vertical.
- Carrega de 1 µ g de frações associadas microssomas CORS, dissolvido no buffer de amostra de desnaturação.
- Em um bem diferente, carrega 5 µ l de marcador padrão de proteína.
- Funcione o gel a 100 V em um Tris/glicina/SDS executando o tampão até proteína atinge o final do gel.
- Transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose, usando um buffer de carbonato básico (10mm NaCO3, 3mm NaHCO3, 20% metanol) O/N a 4 ° C, a 200 mA, constante.
- Bloquear a membrana com PBS-não iónico surfactante 0,05% (PBS-T) com leite seco desnatado de 5% em um agitador orbital durante 30 min à RT
- Brevemente, lavar a membrana com PBS-T.
- Incube a membrana com Syn-1 (1:5, 000) ou anticorpo pSer129-CORS (1:5, 000) no leite seco isento de matéria gorda de 2,5% em PBS-T, O/N a 4 ° C em um agitador orbital.
- Lave a membrana por 10 min a RT com PBS-T em um agitador orbital.
- Incubar a membrana com antirato ou anti-coelho HRP-conjugado anticorpo secundário (1:3, 000) em 2,5% sem gordura leite em PBS-T por 1h no RT
- Lave a membrana por 10 min a RT com PBS-T em um agitador orbital. Repita 3x.
- Obter o sinal através os kits de quimioluminescência regular.
3. principais culturas Neuronal
Nota: Culturas neuronal preliminares foram preparadas a partir do hipocampo de rato (P0) recém-nascido WT ou córtex (linha C57BL/6). Todo o procedimento, menos as etapas de centrifugação, é realizado sob uma capa de cultura celular, em condições estéreis.
- Trate de lamelas (18 mm Ø) com solução de ácido nítrico 65% pelo menos 12 h no RT
- Remova o ácido nítrico. Enxague as lamelas duas vezes com PBS 10x e várias vezes com água destilada.
- Inserir as lamelas em pratos 24-poço e revesti-los com poli-lisina-D (0,1 mg/mL em água destilada esterilizada ou PBS 1 x) para 1 h a 37 ° C.
- Retire o poli-D-lisina e lave as lamelas três vezes com água destilada. Armazená-los em 4 ° C, até que seja necessário.
- Abater os filhotes de rato por decapitação e separe as cabeças dos corpos. Coloque as cabeças em pratos e dissecar suavemente a pele.
- Usando a tesoura bem, abra o crânio, fazendo uma incisão nas bases dos cérebros. Separar as duas metades dos crânios e removê-los cuidadosamente.
- Com o uso de fórceps, beliscar fora ao cérebro de bases e isolar o córtex e hipocampo. Transferi-los para dois pratos separados contendo meio de solução sal equilibrado (HBSS) do Hank contendo 1% penicilina/estreptomicina.
- Repita as etapas de 3.6 e 3.7 para cada animal. Esteja ciente de que todo o processo não deve tomar mais de 30-45 min.
- Picar os tecidos coletados e transferi-los para dois tubos de cónico de 50 mL (um para o hipocampo) e outro para o córtex com 10 mL de meio de HBSS contendo tripsina 0,1%. Incubar em banho-maria por 7 min a 37 ° C.
Nota: Não há agitação é necessária. - Adicione 1 mL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10 µ g/mL DNase para o homogeneizado para bloquear a atividade da tripsina.
- Centrifugue o tecido resultante dissociado em 200 × g por 5 min em RT em uma centrífuga e retire o sobrenadante.
Nota: A pelota representa as células dissecadas do tecido. - Ressuspender as células em meio de chapeamento, contendo 2% B27, glutamina 2mm, glicose de 6 mg/mL, 10% FBS, 12,5 µM glutamato e gentamicina 10 µ g/mL.
- Placa dissociada de neurônios em lamelas de poli-D-lisina em 24 placas bem de acordo com a relação: 1 córtex/12 poços e poços de hipocampo de 1/6, resultando em aproximadamente 150.000/200.000 células por poço. Manter as células em incubação a 37 ° C.
- No dia seguinte (dia em vitro, DIV. 1), substitua o chapeamento do meio o meio contendo 2% B27, 10 µ g/mL gentamicina e glutamina de 2 mM.
- No DIV 2, retire 1/3 do meio e adicionar 1/3 do meio fresco contendo 2,5 µM citosina arabinoside para 48 h reduzir a contaminação glia.
- Manter os neurônios a 37 ° C e substituir metade do meio de três em três dias.
4. neurônios tratamento
Nota: O tratamento foi realizado em 7 DIV. Todas as etapas sejam exercidas sob uma capa de cultura de células em condições estéreis. Um exemplo de densidade de cultura neuronal cortical na DIV 7 é ilustrado na Figura 1.
- Agregados de microssomas associada αS piscina obtidos a partir da medula espinhal de três ratos doentes diferentes do Tg para poder ter uma 1 µ g / µ l solução, usando o buffer de homogeneização original para a diluição.
- Retire 1/3 do meio e substituí-lo suavemente com o meio fresco contendo 2% B27, 1 x glutamina gentamicina e 2 mM.
- Adicione 1 µ g de agregados em pool CORS microssomas associadas ao meio de célula. Retornar os neurônios na incubadora a 37 ° C.
- Cada 3 dias para 1 semana, adicionar 1/3 de meio fresco. Não substitua o meio. Basta adicioná-lo.
- Após 1 semana de tratamento, remover 1/3 do meio e substituí-lo suavemente com o meio fresco contendo 2% B27, 10 µ g/mL gentamicina e glutamina de 2 mM. Repeti a cada 3 dias.
- Corrigi os neurônios após 2 semanas de tratamento (DIV. 21).
5. imunofluorescência
- Corrigir os neurônios com 2% paraformaldeído em PBS 1x e solução de sacarose 5% por 15 min em RT sem tremer, sob um químico das emanações dos bosques.
- Remova a solução de fixação. Brevemente, lave com PBS 1 x, 3 vezes.
Nota: Execute todas as etapas de lavagem suavemente porque neurônios primários não grudar firmemente as lamelas de poli-lisina. - Permeabilize neurônios com 0,3% de surfactante não iônico em PBS 1 x durante 5 min à RT
- Brevemente, lave com PBS 1 x, 3 vezes.
- Incubar os neurônios com 3% FBS em PBS 1 x por 30 min em RT, para bloquear sites de ligação inespecíficos, um agitador orbital.
- Incubar os neurônios com anticorpo primário adequado dissolvido em 3% FBS em PBS 1 x, O/N a 4 ° C em um agitador orbital.
Nota: syn303 (1:1, 000), mouse CORS (1: 200), pser129-CORS (1:1, 000) e Tau (01:10, 000) anticorpos foram usados. - Remova a solução de anticorpo e lavagem, brevemente, com PBS 1 x, 3 vezes.
- Incubar os neurônios com apropriado anticorpo secundário fluorescente dissolvido em 3% FBS em PBS, por 1h no RT no escuro em um agitador orbital.
- Remova a solução de anticorpo e lavagem, brevemente, com PBS 1 x, 3 vezes.
- Mancha de neurônios com solução DAPI (0,1 µ g/mL de PBS 1 x) por 15 min em RT no escuro em um agitador orbital.
- Remova a solução de anticorpo e lavagem, brevemente, com PBS 1 x, 3 vezes.
- Lamelas de montagem em um slide usando o meio de montagem antidesgaste.
Representative Results
Seguindo o protocolo descrito acima e resumida na Figura 2, temos purificado agregados CORS microssomas associada de três doentes A53T CORS Tg ratos (Figura 3). Microssomas são frações de pelota crua da membrana que contêm o retículo endoplasmático, Golgi e pequenas vesículas sinápticas. O grau de pureza do pellet microssomal em comparação com outras fracções anteriormente foi avaliado usando organela específica marcadores18.
Uma vez isolado, Caracterização bioquímica de agregados de CORS é avaliada através de SDS-Page desnaturação, seguido de incubação com Syn-1 ou CORS fosforilada em serina 129 (pSer129-CORS) anticorpo. Em comparação com pré-sintomático (PreS) e idade de correspondência não-Tg (nTg) ratos, microssomas isolados de ratos doentes co precipitado com agregados de CORS. Espécies de CORS microssomas associadas mostram as características típicas de agregados de CORS, como acúmulo de espécies resistentes ao detergente HMW, fosforilação em serina 12919 e C- e N-terminal truncado fragmentos (para uma caracterização completa do agregados de microssomas associada αS ver referência18,20,,21). Estes são requisitos fundamentais desde CORS monomérico não ter interiorizado eficientemente e não induzem CORS deposição7,15,22. É importante não utilizar qualquer detergente (iônico ou não-iônicos) para Ressuspender P100 pelotas desde que pode ser prejudicial para as células. Também, para evitar a variabilidade da amostra, agregados de CORS microssomas associada de três diferentes ratos doentes serão seja agrupados para tratamento neuronal.
Administração de 1 µ g de agregados de CORS microssomas associadas em pool de ratos doentes de A53T para o meio de cultura de neurônios corticais ou hippocampal induz uma dependente do tempo a formação de inclusões de CORS, positivos para anticorpos CORS agregados específicos tais como Syn303 (Figura 4, 5) ou pser129-CORS (Figura 5). Depois de dois dias (2d) do tratamento estes agregados aparecem como pequena, dispersa partitura que se tornarão mais abundante nos pontos de tempo mais tarde. Depois de duas semanas, inclusões de CORS assemelham-se muito tempo e amadurecer como grânulos de estruturas, fortemente espalhadas as culturas neuronais, seguindo um padrão de axônio e parcialmente co localizando com pré-sináptica e marcadores de neuritos (Figura 5). Ocasionalmente, inclusões de CORS recém-formado podem ser vistos co localizar e manchar o soma da célula ou cobrir todo o processo, assemelhando-se a neuritos necróticos.
Apesar de frações de agregados de CORS microssomas associada com eficiência podem se espalhar em culturas neuronal, sua quantidade tem que ser afinado para o número de neurônios chapeado (Figura 1). Na verdade, excedam a proporção recomendada, µ g de microssomas-associados agregados: número de neurônios, irá induzir a morte prematura de célula dentro de alguns dias (Figura 6), enquanto uma quantidade insuficiente de agregados de microssomas associada αS conduzirá a uma escasso e reduzido número de inclusões após duas semanas de tratamento, semelhante ao que foi obtido em pontos de tempo anteriores(Figura 4).
Figura 1 . Culturas de neurônios corticais. Imagem representativa, mostrando a densidade em DIV 7 das culturas neuronal corticais. Imagens foram tiradas com um microscópio invertido, objectivo de X 10. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Isolamento de microssomas associada αS agrega do rato SpC. Fluxograma do protocolo de purificação de microssomas associada αS agrega do SpC de ratos doentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Isolamento de frações de microssomas de doentes, pré-sintomático A53T CORS Tg e nTg ratos. Mostrando de análise ocidental do borrão purificado agregados microssomas associada αS isolados de três doentes (doente), pré-sintomático (PreS) e ratos de nTg envelhecido-combinadas. Os ratos doentes são ratos de Tg de CORS A53T que mostram a disfunção motora e neurológica, incluindo a acumulação de inclusões de CORS, enquanto animais pré-sintomático são saudáveis A53T CORS Tgs de 9 meses de idade que não mostram ainda qualquer patologia CORS relacionados com fenótipo. ratos de nTg são littermates de ratos doentes que não carregam o transgene CORS e portanto não desenvolvem CORS induzida por patologia. 1 µ g de cada frações purificadas foram executados em um desnaturação SDS-Page, transferido em uma membrana de nitrocelulose e apagados com anticorpo Syn-1 ou pSer129-CORS. Apenas frações de microssomas isolaram de ratos doentes contido HMW CORS detergente resistente agregados foram phosphorylated em serina 129 e mostrou C- e truncamento de N-terminal. Esta figura foi adaptada da Colla et al 18. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Dependente do tempo de indução de deposição de CORS após a administração de agregados de CORS microssomas associadas. (A) imunofluorescência de neurônios hippocampal preliminares tratados com 1 µ g de microssomas associada αS agrega fracções em pool de três diferentes ratos doentes. Os neurônios foram fixados em 2 dias (2d), 1 semana (1w) ou 2 semanas (2w) de tratamento e immunostained com syn303 (S303, 1: 1000), um anticorpo específico para oxidado e agregados CORS. As células foram counterstained com DAPI. Confocal imagens foram tiradas usando um laser confocal microscópio, objectivo de X 63. Barra de escala = 50 µm. (B) análise quantitativa de fluorescence total, após a subtração de fundo, foi feito usando o plugin de contagem de partículas do software Image J. Valores foram normalizados para o número de núcleos por campo (contagem DAPI) e expressos em percentagem do sinal de fluorescência do S303 em 2D. Os valores são dados como a média ± DP (n = 5). * * p < 0,001, * * * p < 0.00001, One-Way ANOVA, seguido pelo teste de post-hoc de LSD de Fisher. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Inclusões intracelulares CORS colocalize com rede de neuritos cortical. Imagens confocal representante dos neurônios corticais tratadocom com CORS microssomas-associados agregados obtidos de ratos doentes de Tg. Depois de 2 semanas de neurônios de tratamento eram fixas e duplo manchado com anticorpos específicos agregados [S303 (A, B) ou pser129-CORS, 1:1,000 (C)] e axônio marcadores [rato CORS, 1: 200 (A, B) ou Tau, 1:10,000 (C)]. Co de rotulagem dos sinais fluorescentes demonstrou localização co parcial de estruturas recém-formada CORS grânulo com a rede de neuritos. Ocasionalmente, inclusões de CORS acumular-se dentro o soma neuronal (A, B, setas). Empilhadas imagens foram adquiridas com um microscópio confocal, 63 objetivo X de exploração do laser. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de Colla et al 20. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Adição de suboptimal quantidade de agregados de CORS microssomas associada é tóxica para os neurônios. DAPI coloração dos neurônios tratados com o aumento da concentração de agregados de microssomas associada αS leva à morte celular. (A) neurônios corticais foram tratados com 1, 2 µ g de agregados de microssomas associada αS extraído de ratos doentes ou reserva única que não contém agregados (B) e corados com DAPI. Imagens fluorescentes foram adquiridas com um microscópio de epi-fluorescência usando um objectivo X 20. Barra de escala = 100 µm.(B) DAPI-positivo células foram contadas utilizando o software Image J. O gráfico mostra uma redução no número de núcleos com o aumento da concentração de CORS microssomas-associados agregados adicionados aos meios de comunicação neuronais. Valores são expressos em % de b e são dadas como a média ± DP (n = 5), * * * p < 0,0001, One-Way ANOVA, seguido pelo teste de post-hoc de LSD de Fisher. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Nós descrevemos um método para obter a formação de inclusões de CORS em culturas primárias de neuronais derivado do cérebro de ratos WT, através da adição de agregados purificada microssomas associada αS isoladas de modelos animais de CORS Tg.
Passos críticos do presente protocolo são os seguintes: a relação entre µ g de CORS microssomas-associados agregados/neurônios e a fonte dos agregados de CORS. Como mostrado na sessão de resultados, é fundamental otimizar a relação entre µ g de CORS microssomas-associados agregados/número de neurônios desde que trabalha em condições de qualidade inferior pode originar a morte prematura de celular ou agregação intracelular muito escassa (ver o Seção de resultados representativos). Devido a isso, é muito importante avaliar a densidade da cultura neuronal na DIV 7 (mostrado na Figura 1) antes de iniciar o tratamento. Além disso, agregados de CORS deve ser purificado de ratos de Tg CORS doentes, ou seja. de modelos animais que se acumulam LB-como inclusões caracterizam por detergente e fosforilada CORS insolúvel fibrilas HMW.
Eventuais alterações ao presente protocolo consideram o tecido, congelado ou fresco, da quais microssomas podem ser isoladas e o montante inicial. Enquanto usamos ratos SpC de Tg por causa do alto teor de agregados insolúveis de CORS, o protocolo é apropriado para isolar microssomas-associados agregados de quaisquer tecidos, desde que a área tem um alto teor em agregados de CORS. Amostras congeladas também podem ser usadas desde que o congelamento não afeta as etapas de purificação de microssomas-associados agregados ou a agregados por si. Enquanto o peso inicial recomendado para tecidos é de cerca de 100-150 mg, este protocolo é apropriado para a obtenção de microssomas de tão baixo quanto 50 mg de matéria-prima (sem limite de peso máximo). No caso do montante inferior a 100 mg, no entanto, a proporção de homogeneização adequada será 01:20 (p/v) a fim de ter pelo menos 1 mL do sobrenadante S10 para carregar na garrafa de policarbonato para a precipitação de se. Na verdade, volumes menores do que 1 mL de carregamento pode resultar no colapso da perda do tubo e amostra. Aumentando o volume de homogeneização conduzirá a um sobrenadante mais diluída, mas a concentração do pellet microssomal se mantêm inalterada.
Uma limitação do presente protocolo refere-se a Cruz-semeadura ineficiente na formação de inclusões de CORS que foram recentemente relatados na administração caso de CORS PFFs de origem humana para culturas neuronal murino, ao contrário do mouse CORS PFFs24. Uma vez que aumentando a quantidade de fibrilas de CORS exógena dado às culturas murino pode contornar esse problema, recomendamos finamente ajustar a quantidade de agregados microssomas-associado no caso da administração de fibrilas obtidos a partir de outras variantes de CORS ou diferentes espécies de culturas neuronal do mouse do que o que descrevemos.
Agregados de CORS exógena adicionados para os meios de cultura podem ser de diferentes fontes. Em vitro CORS PFFs têm sido utilizados anteriormente como modelo de propagação de agregados de CORS intracelular em culturas de células, neurônios primários e modelos animais3,7,8,15. Comparado ao nosso método onde agregados CORS microssomas associada podem ser isolados em poucas horas, a formação dos PFFs é demorado e trabalhoso, que requer várias etapas de purificação, seguida de ensaios adicionais para verificar CORS agrega confomations25 . Além disso, PFFs, sendo obtidos de humanos bacteriano-expressa ou rato CORS, ou seja, falta posttranslational modificações típicas de eucariontes, podem apresentar diferentes conformações, com propagação seletiva e propriedades patogénicas, de acordo com os protocolos de nucleação seguidos (ou seja, fitas vs fibrilas)5,8 , levando a conclusões e resultados diferentes. Em vez disso, Administração única no vivo purificado CORS agregados garante a transmissão de modelos patogênicos mais autênticas, imitando de perto o processo de formação de inclusões de CORS em modelos animais e em pacientes com DP.
Como uma futura aplicação desta técnica, acreditamos que este protocolo pode ser utilizado com sucesso isolar CORS patogénicos das sementes no cérebro de pacientes com DP ou outros modelos animais de Tg de CORS, desde que a área doente do qual microssomas são isoladas são ricas em CORS inclusões.
A nosso conhecimento, este é o primeiro método que permite a purificação de espécies tóxicas nativas de CORS na vivo modelos de PD para ser usado como propagação de modelo para a obtenção de formação de inclusões de CORS nos neurônios primários.
Acreditamos que esse método é extremamente versátil e pode fornecer um modelo baseado na célula excepcional para estudar os diferentes aspectos da agregação de CORS e sua influência sobre a fisiopatologia da célula. Porque a formação de inclusões de CORS representam um processo complexo que tem sido difícil de replicar em células cultivadas, estamos esperançosos de que este modelo irá fornecer grandes insights nos mecanismos de patogenicidade agudos, difícil de identificar na crônica e mais elaboradas sistemas tais como são modelos animais.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho tem sido apoiado pelo Ministério italiano da Universidade e pesquisa (MIUR) através do regime de concessão de reintegração de carreira (programa RLM para jovem pesquisador) e da Scuola Normale Superiore. Agradecemos o Prof Michael Lee da Universidade de Minnesota, EUA, para fornecer o CORS Prp humano A53T ratos de Tg, do qual os agregados são isolados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | 1M pH=7-7.6 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH=8 0.5M |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCO3 | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| NAHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells | Biorad | 5678094 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | 0.2 μm |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Termo Fisher Scientific | 34077 | |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 1004411000 | 65% |
| Glass Coverslips | Termo Fisher Scientific | 1014355118NR1 | 18 mm x |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Termo Fisher Scientific | 14170-500 mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Termo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Termo Fisher Scientific | D5796-500 mL | |
| Trypsin-EDTA | Termo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| B27 Supplement | Termo Fisher Scientific | 17504044 | 50X |
| Glutamax | Termo Fisher Scientific | 35050-038 | 100x |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Fetal bovine serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 1446600-1G | |
| Gentamicin | Termo Fisher Scientific | 15710 | 10 mg/ml |
| Neurobasal Medium | Termo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Cytosine arabinoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Termo Fisher Scientific | 62247 | |
| 90 Ti rotor | Beckman | N/A | Ultracentrifuge rotor |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | N/A | |
| Syn-1 antibody, clone 42 | BD Biosciences | 610786 | anti-mouse WB: 1:5000 |
| Syn303 antibody | BioLegend | 824301 | anti-mouse IF: 1:1000 |
| Tau antibody | Synaptic Systems | 314 002 | anti-rabbit IF: 1:10,000 |
| pser129-αS antibody | A gift from Fujiwara et al, reference 19 | anti-rabbit WB: 1:5000 | |
| pser129-αS antibody | Abcam | ab51253 | anti-rabbit IF: 1:1000 |
| Mouse αS (D37A6) XP | Cell Signaling | 4179 | anti-rabbit IF 1:200 |
| Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody | Termo Fisher Scientific | A27039 | |
| Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody | Termo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Microson XL-2000 | Misonix | Sonicator | |
| Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type | Science Service EU | S4484 | Ultracentrifuge tubes |
| AXIO Observer Inverted Light Microscope | Zeiss | N/A | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Inverted epi-fluorescence microscope | Nikon | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Nonionic surfactant |
References
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