Здесь мы представляем протокол производить грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) spheroplasts и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) протопласта четко визуализировать и быстро характеризуют пептид бактерии взаимодействий. Это обеспечивает систематический метод для определения мембраны локализации и translocating пептидов.
Использование confocal микроскопии в качестве метода для оценки пептид локализации шаблонов внутри бактерии обычно препятствует резолюции пределы обычных легких микроскопы. Как разрешение для данного Микроскоп невозможно укрепить легко, мы представляем протоколы для преобразования небольшой палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) в больших, легко фотосъемка сферической формы называют spheroplasts или протопласта. Это преобразование позволяет наблюдателям быстро и четко определить пептиды подать себя в бактериальной мембраны (то есть, мембраны локализации) или крест мембраны войти в камеру (например, translocating). С этим подходом мы также представляем систематический метод характеризовать пептидов как мембрана локализации или translocating. Хотя этот метод может быть использован для различных мембраны активных пептидов и бактериальных штаммов, мы продемонстрировать полезность настоящего Протокола путем наблюдать взаимодействие Buforin II P11A (BF2 P11A), антимикробного пептида (AMP), с E. coli Spheroplasts и B. megaterium протопласта.
Антимикробных пептидов (AMPs) получили внимание из-за их потенциального использования в качестве альтернатив обычные антибиотики1,2,3,4,5. Translocating через клеточную мембрану и взаимодействующих с внутриклеточных компонентов, таких как нуклеиновые кислоты или на permeabilizing мембрану, причиной утечки содержимого ячейки6ампер убивают бактерии. В дополнение к их использования как антибиотики translocating усилители могут быть адаптированы для доставки приложений наркотиков потому, что они могут-непредвиденное крест непроницаемой клеточной мембраны7,8. Мы, таким образом, стремятся понять фундаментальные AMP механизмы действий, чтобы заложить основы для их использования в конструкции снадобья.
Конфокальная микроскопия предлагает способ оценки локализации шаблонов дневно обозначенные усилителей в бактериальных клетках, обеспечивая понимание их механизм действий9,10,,11,12, 13 , 14. путем маркировки мембраны бактерий, можно определить, если дневно обозначенные пептид локализует мембраны или пространство внутриклеточных бактериальных клеток. Однако этот метод ограничен небольшой размер и стержня формы бактерий, которые могут сделать визуализации сложной из-за пределы резолюции обычных легких микроскопов и переменной ориентации бактерии на слайд15.
Цель представленных метода является возможность расширения визуализации дневно обозначенные пептид локализации шаблонов с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация является расширение, превратив маленький, тонкий, палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) бактерий в расширенном, сферической формы, именуемый Spheroplasts (для грамотрицательных штаммов) и протопласта (для грамположительных штаммов)16,17,18,19,,2021. Spheroplasts и протопласта легче изображения из-за их увеличение размера и их симметричная форма, которая делает ориентации бактерии на слайде значения для своих изображений. Кроме того мы представляем систематический подход к количественно анализа данных confocal микроскопии для того чтобы характеризовать AMPs как либо мембраны, локализация или translocating. Применение этих методов делает его легче отличить дневно помечены пептид локализации шаблонов. Протоколы, представленные здесь может использоваться для оценки локализации разнообразных мембраны активных агентов помимо усилителей, включая пептиды, проникая в клетки.
Преимущество этой техники является, что он обеспечивает понимание механизма действия усилителей на уровне одной ячейки, который может выявить гетерогенности клеток в15, в отличие от других анализов флуоресценции, обычно используется для идентификации механизмы действия усилителей, которые обеспечивают только массовой оценки9,22,23,24,25. Использование spheroplasts и протопласта для того чтобы оценить AMP запись ячейки является особенно полезным26 потому, что они являются более физиологически соответствующих15 чем другие модели, используемые для оценки записи ячейки, например липидов везикулы24.
Протоколы, представленные здесь сделать возможным для исследователей более быстро получить более крупные выборки бактериальных изображений, потому что увеличены, сферические бактерии являются гораздо проще найти, ориентации и изображения. Это расширение возможностей для сбора данн?…
The authors have nothing to disclose.
Поддержка исследования осуществлялась в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (низ-NIAID) премии R15AI079685.
Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Lysozyme | Sigma | L6876 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
Maleic acid | Sigma | M0375 | |
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |