Aquí presentamos un protocolo para producir Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) Esferoplastos y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplastos claramente visualizar y caracterizar rápidamente interacciones de péptido-bacterias. Esto proporciona un método sistemático para definir la localización de la membrana translocación de péptidos.
Comúnmente, el uso de microscopia confocal como un método para determinar patrones de localización de péptidos dentro de las bacterias es inhibido por los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales. Como la resolución de un microscopio dado no puede ser fácilmente mejorada, presentamos protocolos para transformar la pequeña barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) en formas esféricas más grandes, fácilmente reflejadas llaman esferoplastos o protoplastos. Esta transformación permite observadores a rápidamente y claramente determinar si péptidos se alojan en la membrana bacteriana (es decir, localización de membrana) o cruzan la membrana para entrar en la célula (es decir, translocación). Con este enfoque, también presentamos un método sistemático para caracterizar péptidos como membrana de localización o translocación. Si bien este método puede utilizarse para una variedad de péptidos activos de membrana y cepas bacterianas, demostramos la utilidad de este protocolo mediante la observación de la interacción de Buforin II P11A (BF2 P11A), un péptido antimicrobiano (AMP), con e. coli Esferoplastos y protoplastos B. megaterium .
Péptidos antimicrobianos (AMPs) han obtenido la atención debido a su uso potencial como alternativas a los antibióticos convencionales1,2,3,4,5. Amperios de matan bacterias por translocación a través de la membrana celular e interactuando con componentes intracelulares tales como ácidos nucleicos o por permeabilizing la membrana causando fugas de contenido de la célula6. Además de su uso como antibióticos, translocación amperios puede ser adaptado para solicitudes de entrega de medicamentos porque no disruptiva puede cruzar la membrana celular impermeable7,8. Por lo tanto, buscamos comprender los mecanismos fundamentales de la AMP de acción para sentar las bases para su uso en el diseño de fármacos.
La microscopia confocal ofrece una manera para determinar patrones de localización de fluorescencia etiquetadas amperios en células bacterianas proporcionando penetraciones en su mecanismo de acción9,10,11,12, 13 , 14. al etiquetado de la membrana de las bacterias, uno puede determinar si un péptido fluorescente etiquetado localiza a la membrana o en el espacio intracelular de una célula bacteriana. Sin embargo, esta técnica está limitada por el pequeño tamaño y barra de forma de bacterias, que puede hacer difícil debido a los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales y la orientación variable de las bacterias en la diapositiva15la proyección de imagen.
El objetivo del método presentado es mejorar la visualización de los patrones de localización de péptido fluorescente etiquetado usando microscopia confocal. Visualización se ha mejorado el pequeños, finos, barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) bacterias en formas de agrandamiento, esféricas conocido como Esferoplastos (para las cepas Gram negativas) y protoplastos (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. Esferoplastos y protoplastos son más fáciles de imagen debido a su mayor tamaño y su forma simétrica, lo que hace irrelevante para la proyección de imagen de la orientación de una bacteria sobre un portaobjetos. Además, presentamos un enfoque sistemático para analizar cuantitativamente datos de microscopia confocal para caracterizar amperios como cualquier membrana de localización o translocación. Aplicación de estos métodos resulta más fácil distinguir marcada fluorescencia patrones de localización de péptido. Los protocolos aquí presentados pueden utilizarse para evaluar la localización de una variedad de agentes activos de membrana distintos amplificadores, incluyendo péptidos de penetración celular.
Una clara ventaja de esta técnica es que proporciona penetraciones en el mecanismo de acción de amp a nivel unicelular, que puede revelar la heterogeneidad celular de la célula15, frente a otros ensayos de fluorescencia se utiliza comúnmente para identificar la mecanismos de acción de amperios, que sólo proporcionan a granel estimaciones9,22,23,24,25. El uso de Esferoplastos y protoplastos para evaluar la entrada de amplificador celular es útil particular26 porque son más fisiológico relevantes15 que otros modelos utilizados para evaluar la entrada de la célula, como lípido vesículas24.
Los protocolos aquí presentados hacen posible para los investigadores a obtener más rápidamente más grandes tamaños de muestra de imágenes bacterianas porque las bacterias ampliadas, esféricas son mucho más fáciles de ubicar, orientar y la imagen. Esta mayor capacidad para recopilar datos es valiosa en varios aspectos. En primer lugar, permite un análisis cuantitativo más sistemático de los patrones de localización de péptido. Mientras las tendencias cualitativas pueden demostrarse de pequeñas series de im…
The authors have nothing to disclose.
Investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIH-NIAID) Premio R15AI079685.
Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Lysozyme | Sigma | L6876 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
Maleic acid | Sigma | M0375 | |
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |