Her præsenterer vi en protokol for at producere gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts at visualisere, klart og hurtigt karakterisere peptid-bakterier interaktioner. Dette giver en systematisk metode til at definere membran lokalisering og translocating peptider.
Konfokal mikroskopi anvendes som en metode til at vurdere peptid lokalisering mønstre inden for bakterier er almindeligvis hæmmet af opløsning grænserne for konventionelle lys mikroskoper. Som opløsning for en given mikroskop ikke kan være let forbedret, præsenterer vi protokoller for at omdanne små stavformet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) i større, let afbildet sfæriske formularer kaldes spheroplasts eller protoplasts. Denne transformation tillader observatører til hurtigt og klart fastslå, om peptider indgive sig ind i den bakterielle membran (dvs, membranen lokalisering) eller krydse membran for at komme ind i cellen (dvs. translocating). Med denne tilgang fremlægge vi også en systematisk metode til at karakterisere peptider som membran lokalisering eller translocating. Mens denne metode kan bruges til en bred vifte af membran-aktive peptider og bakteriestammer, vi påvise nytten af denne protokol ved at observere samspillet mellem Buforin II P11A (BF2 P11A), et antimikrobielt peptid (AMP), med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.
Antimikrobielle peptider (AMP’er) har fået opmærksomhed på grund af deres potentielle anvendelse som alternativer til konventionel antibiotika1,2,3,4,5. Ampere dræbe bakterier ved enten translocating over cellemembranen og interagere med intracellulære komponenter såsom nukleinsyrer eller af permeabilizing membranen forårsager lækage af celle indhold6. Ud over deres anvendelse som antibiotika, kan translocating ampere tilpasses for drug delivery ansøgninger fordi de kan ikke-båndstationer krydser uigennemtrængelige cellemembranen7,8. Derfor søger vi, at forstå grundlæggende AMP virkningsmekanismer at lægge fundamentet for deres anvendelse i stof design.
Konfokal mikroskopi tilbyder en måde at vurdere lokalisering mønstre af fluorescently mærket ampere i bakterieceller giver indsigt i deres mekanisme af aktion9,10,11,12, 13 , 14. ved mærkning membranen af bakterier, kan man bestemme, hvis en fluorescently mærket peptid lokaliserer membranen eller det intracellulære rum for en bakteriel celle. Dog, denne teknik er begrænset af den lille størrelse og stang form af bakterier, som kan gøre imaging udfordrende på grund af resolution grænserne for konventionelle lys mikroskoper og den variable orientering af bakterier på slide15.
Målet med metoden præsenteres er at aktivere udvidet visualisering af fluorescently mærket peptid lokalisering mønstre ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Visualisering er forbedret ved at dreje på små, tynde, stavformet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier i udvidet, sfæriske formularer omtales som spheroplasts (for gram-negative stammer) og protoplasts (for gram-positive stammer)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts og protoplasts er nemmere at billedet på grund af deres større størrelse og deres symmetriske form, hvilket gør orientering af en bakterie på et dias irrelevant for dens billeddannelse. Derudover præsenterer vi en systematisk metode til at analysere kvantitativt konfokalmikroskopi data for at karakterisere ampere som enten membran lokalisering eller translocating. Disse metoder gør det lettere at skelne fluorescently mærket peptid lokalisering mønstre. Protokollerne præsenteres her kan bruges til at vurdere lokalisering af en bred vifte af membran-aktive agenter end ampere, herunder celle-gennemtrængende peptider.
En klar fordel af denne teknik er, at det giver et indblik i virkningsmekanismen af ampere på en enkelt celle niveau, som kan afsløre celle til celle heterogenitet15, i modsætning til andre fluorescens assays almindeligt anvendt til at identificere de virkningsmekanismer ampere, som kun giver bulk skøn9,22,23,24,25. Brug af spheroplasts og protoplasts for at vurdere AMP celleindtastning er særlig nyttige26 , fordi de er mere fysiologisk relevante15 end andre modeller, der anvendes til at vurdere celleindtastning som lipid vesikler24.
Protokollerne præsenteres her gøre det muligt for forskere at hurtigere få større stikprøvestørrelser af bakteriel billeder fordi de udvidede, kugleformede bakterier er meget lettere at finde, orientere og image. Denne udvidede evne til at indsamle data er værdifulde i flere henseender. Først, det giver mulighed for en mere systematisk kvantitativ analyse af peptid lokalisering mønstre. Mens kvalitative tendenser kan godtgøres fra mindre sæt af billeder, kun stor stikprøve sæt af billeder i høj kvalitet afs…
The authors have nothing to disclose.
Forskning blev støttet af National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIH-NIAID) award R15AI079685.
Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
Lysozyme | Sigma | L6876 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
Maleic acid | Sigma | M0375 | |
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |