Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

الإنتاج والتصور جدارها البكتيرية وبروتوبلاستس لتميز التعريب الببتيد مضادات الميكروبات

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لإنتاج الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) جدارها وإيجابية Bacillus megaterium (باء-ميجاتيريوم) بروتوبلاستس تصور واضح وتميز سرعة التفاعلات البكتيريا الببتيد. يوفر هذا أسلوب منهجي لتعريف غشاء إضفاء الطابع المحلي وترانسلوكاتينج الببتيدات.

Abstract

تحول دون استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] كطريقة لتقييم أنماط التعريب الببتيد داخل البكتيريا عادة بحدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية. كما لا يمكن تعزيز القرار مجهر معين بسهولة، نقدم البروتوكولات لتحويل صغيرة على شكل قضيب الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) وإيجابية Bacillus megaterium (ميجاتيريوم) ودعا إلى أشكال كروية المصورة بسهولة أكبر، وجدارها أو بروتوبلاستس. ويسمح هذا التحول المراقبين لتحديد سرعة ووضوح سواء الببتيدات تقديم أنفسهم إلى الغشاء الجرثومي (أي، ترجمة غشاء) أو عبر الغشاء بدخول الخلية (أي، ترانسلوكاتينج). مع هذا النهج، نقدم أيضا أسلوب منهجي لتوصيف الببتيدات كغشاء إضفاء الطابع المحلي أو ترانسلوكاتينج. بينما يمكن استخدام هذا الأسلوب لمجموعة متنوعة من الببتيدات غشاء نشطة والسلالات البكتيرية، نظهر فائدة هذا البروتوكول عن طريق مراقبة التفاعل بين بوفورين الثاني P11A (BF2 P11A)، ببتيد مضادات الميكروبات (أمبير)، مع كولاي جدارها وبروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) .

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد اكتسبت الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير) الاهتمام بسبب إمكانية استخدامها كبدائل للمضادات الحيوية التقليدية1،2،3،،من45. الامبير تقتل البكتيريا أما ترانسلوكاتينج عبر غشاء الخلية، والتفاعل مع المكونات داخل الخلايا مثل الأحماض النووية أو بيرميبيليزينج الغشاء مما تسبب في تسرب محتويات الخلية6. بالإضافة إلى استخدامها كالمضادات الحيوية، ترانسلوكاتينج الامبير قد تكون مكيفة لطلبات تسليم المخدرات نظراً لأنها غير ديسروبتيفيلي يمكن عبر7،غشاء الخلية كتيمة8. ولذلك، نحن، تسعى إلى فهم آليات أمبير الأساسية العمل على إرساء الأسس لاستخدامها في تصميم الأدوية.

[كنفوكل] الفحص المجهري يوفر وسيلة لتقييم أنماط الترجمة من الامبير المسمى فلوريسسينتلي في الخلايا البكتيرية تقديم رؤى في إليه العمل9،10،،من1112، 13 , 14-بوصفها غشاء البكتيريا، واحد يمكن تحديد إذا يموضع ببتيد مسمى فلوريسسينتلي للغشاء أو الفضاء داخل الخلية للخلية البكتيرية. ومع ذلك، يقتصر هذا الأسلوب الشكل صغيرة الحجم وقضيب من البكتيريا، والتي يمكن أن تجعل التصوير صعبة بسبب حدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية والاتجاه المتغير من البكتيريا على شريحة15.

وهدف طريقة عرض تمكين التصور تعزيز أنماط التعريب الببتيد المسمى فلوريسسينتلي باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. هو تعزيز التصور بتحويل صغيرة، رقيقة، على شكل قضيب الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) وإيجابية Bacillus megaterium (ميجاتيريوم) البكتيريا إلى أشكال كروية الموسع، ويشار إليه بوصفه جدارها (لسلالات الغرام) وبروتوبلاستس (لسلالات إيجابية)16،17،،من1819،،من2021. جدارها وبروتوبلاستس أسهل للصورة بسبب زيادة حجمها وشكلها متماثل، مما يجعل التوجه للبكتيريا على شريحة غير ذي صلة التصوير. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتحليل البيانات مجهرية [كنفوكل] كمياً لوصف الامبير الغشاء أما محلياً أو ترانسلوكاتينج. تطبيق هذه الأساليب يجعل من السهل التمييز بين المسمى فلوريسسينتلي أنماط التعريب الببتيد. يمكن استخدام البروتوكولات المقدمة هنا لتقييم إضفاء الطابع المحلي على مجموعة متنوعة من العوامل النشطة غشاء خلاف المكاتب الإقليمية للمرأة، بما في ذلك اختراق الخلية الببتيدات.

واحد ميزة واضحة لهذا الأسلوب هو أن فإنه يوفر نظرة ثاقبة إليه العمل للمكاتب الإقليمية للمرأة على مستوى خلية واحدة، التي قد تكشف التغايرية خلية إلى15، بدلاً من فحوصات الفلورية الأخرى استخداماً لتحديد آليات العمل للمكاتب الإقليمية للمرأة، التي توفر معظم التقديرات9،،من2223،24،25فقط. استخدام جدارها وبروتوبلاستس من أجل تقييم إدخال خلية أمبير هي مفيدة خاصة26 لأنها ذات الصلة أكثر فسيولوجيا15 من النماذج الأخرى المستخدمة لتقييم إدخال خلية، مثل الدهن حويصلات24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-حل إعداد

ملاحظة: إعداد الحلول هو موضح في الخطوات 1.1-1.9 و 1.8-1.11 بغية إنتاج جدارها كولاي وبروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) ، على التوالي.

  1. تحضير 1 م تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 7.8 بتذويب 10.34 ز HCl تريس وز 4.17 أوه تريس في 50 مل من dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد الحل (20 مم مجكل2، 0.7 متر السكروز، 10 مم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 7.8) بتذويب ز 0.10 مجكل2 (95.2 g/mol) وز 11.98 السكروز (342.3 g/mol) في 25 مل dH2س في قارورة 125 مل. إضافة ميليلتر 500 1 متر تريس-Cl (pH 7.8) وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير حل ب (10 مم مجكل2, السكروز 0.8 م, 10 ملم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 7.8) بتذويب ز 0.05 مجكل2 (95.2 g/mol) وز 13.69 السكروز (342.3 g/mol) في 25 مل dH2س في قارورة 125 مل. إضافة ميليلتر 500 1 متر تريس-Cl (pH 7.8) وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد السكروز 0.8 م بحل السكروز ز 13.69 (342.3 g/mol) في 50 مل dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد ديوكسيريبونوكليسي 5 ملغ/مل أنا (الدناز أنا) بتذويب ز 0.015 الدناز أنا في 3 مل من dH2س في قارورة 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون. حل الكوة في [ميكروفوج] أنابيب ومخزن في-20 درجة مئوية.
  6. إعداد 0.125 M حمض الإيثيلين (يدتا)، ويذوي pH 8.0 بحل ثنائي يدتا ز 0.698 (372.2 g/mol) إلى 15 مل dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  7. إعداد 600 ميكروغرام/مل سيفاليكسين بتذويب 0.03 غرام هيدرات سيفاليكسين (365.404 g/mol) في 50 مل من dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي عند 4 درجة مئوية.
  8. إعداد lysozyme 5 ملغ/مل بتذويب lysozyme ز 0.015 في 3 مل من dH2س في قارورة 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون. حل الكوة في [ميكروفوج] أنابيب ومخزن في-20 درجة مئوية.
  9. تحضير 3% w/v مرق فول الصويا تريبتيكاسي (TSB) بإذابة 30 غ TSB في 1 لتر من dH2س في قارورة 2 ل. قاسمة الحل في قوارير تحتوي على 25 مل أو 100 مل TSB لاستخدامها في إعداد جدارها كولاي أو (ب) ميجاتيريوم بروتوبلاستس، على التوالي. اﻷوتوكﻻف قوارير لتعقيم الوسط السائل. ويمكن تخزين TSB العقيمة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
  10. إعداد الحل ج (1 م السكروز، ماليات 0.04 متر، مجكل 0.04 متر2، الرقم الهيدروجيني 6.5) بتذويب ز 34.23 السكروز (342.3 g/mol) وحامض الماليك ز 0.46 (116.07 g/mol) 0.38 غ مجكل2 (95.21 g/mol) في 100 مل من dH2س في قارورة 250 مل. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.5. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  11. تعد المتوسطة جبلة مجردة 200 مل بخلط 100 مل 3% w/v TSB و 100 مل الحل ج في زجاجة زجاج 1 لتر. اﻷوتوكﻻف لتعقيم الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

2-إعداد الثقافة بين عشية وضحاها

ملاحظة: تنفيذ الأقسام 2-4 باستخدام تقنيات تعقيم مناسبة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن يحتوي على سلالة البكتيريا بلازميد لمقاومة المضادات الحيوية للحد من التلوث المحتملة. إذا كان استخدام سلالة مع المقاومة للمضادات الحيوية، إضافة المضادات الحيوية اللازمة في خطوات 2.1، 3.1 – 3.2 و 4.1 – 4.4.

  1. إعداد ثقافة بين عشية وضحاها بانتقاء مستعمرة واحدة من البكتيريا باستخدام تلميح ماصة معقمة ووضعه في أنبوب ثقافة 14 مل يحتوي على 2-3 مل من 3% w/v TSB. احتضان في 37 درجة مئوية، في حين تهتز ح 16-21.

3-إعداد جدارها الغرام كولاي

  1. في قارورة 250 مل، تمييع 1: 100 الثقافة بين عشية وضحاها في حجم 25 مل من 3% w/v TSB واحتضان الحل الجرثومي في 37 درجة مئوية، في حين تهتز لما يقرب من 2.5 ح حتى وصلت إلى الحل بكثافة بصرية من 0.5 – 0.8 في 600 نانومتر. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
  2. في قارورة 250 مل، تضعف هذه الثقافة 01:10 في 30 مل من 3% w/v TSB واحتضان في 37 درجة مئوية، في حين تهتز ح 2.5 حضور 60 ميكروغرام/مل سيفاليكسين (347.4 g/mol) لإنتاج خيوط خلية واحدة من حوالي 50-150 ميكرومتر في الطول ، هي التي يمكن ملاحظتها تحت 1,000 X التكبير باستخدام مجهر ضوء (الشكل 1B).
  3. الحصاد خيوط من سينتريفوجينج الحل الجرثومي في س 1,500 ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 4 صب وتجاهل المادة طافية، حجز بيليه.
  4. أغسل خيوط بإضافة 1 مل سكروز 0.8 متر، مع الحرص على عدم تعكير بيليه بلطف. احتضان لمدة 1 دقيقة، ومن ثم تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه.
  5. إضافة 150 ميليلتر من 1 م تريس-Cl (pH 7.8)، 120 ميليلتر من ليسوزيمي 5 ملغ/مل، 30 ميليلتر من 5 ملغ/مل الدناز الأول، و 120 ميليلتر يدتا 0.125 M في كل منها سعيا لبيليه واحتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  6. أضف 1 مل من محلول A تدريجيا أكثر من 1 دقيقة للحل الذي أعد في 3.5 باستخدام ميكروبيبيتي بينما يحوم بلطف الحل باليد. احتضان الحل لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. وضعت اثنين من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل 7 مل من محلول 4 درجة مئوية ب. إضافة كميات متساوية من الحل الذي أعد في 3.6 لكل واحدة من هذه الأنابيب اثنين. الطرد المركزي الحل في 1,500 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  8. بعناية باستخدام ماصة مصلية، إزالة كافة ولكن المادة طافية2 مل من 1 دون إزعاج بيليه. ريسوسبيند بيليه بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً ميكروبيبيتي P1000 باستخدام. بصريا تحقق لمعرفة تشكيل جدارها بمراقبة العينة في 1,000 X التكبير باستخدام مجهر ضوء (الشكل 1).
  9. تخزين جدارها في-20 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع، أو حتى أنهم ذهبوا من خلال دورات تجميد أذاب 3.

4-إعداد إيجابية باء-ميجاتيريوم بروتوبلاستس

  1. في قارورة 250 مل، تضعف 1:1,000 الثقافة بين عشية وضحاها في 100 مل من 3% w/v TSB واحتضان الحل الجرثومي في 37 درجة مئوية، في حين تهتز لما يقرب من 4.5 ساعة حتى وصلت إلى الحل بكثافة بصرية من 0.91.0 في 600 نانومتر. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
  2. من أجل ثقافة السائل إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. استخدام ماصة مصلية، تجاهل المادة طافية من أنابيب مخروطية الشكل على حد سواء. ريسوسبيند كل بيليه في المتوسط 2.5 مل جبلة مجردة، والجمع بين الحلول ريسوسبينديد في أنبوب مخروطي واحد. "الماصة؛" الحل ريسوسبينديد مجتمعة في قارورة 125 مل.
  4. أضف 1 مل ليسوزيمي 5 ملغ/مل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية، في حين تهتز.
  5. رصد نمو بروتوبلاستس تحت 1,000 x التكبير باستخدام مجهر ضوء، مشيراً إلى وجود أي مخالفات، مثل البكتيريا التي تظهر كقضبان منتفخة بدلاً من المجالات (الشكل 2). استخدام ماصة مصلية، نقل الحل إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 5 مل جبلة مجردة وسائط الإعلام. تخزين بروتوبلاستس في-20 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع، أو حتى أنهم ذهبوا من خلال دورات تجميد أذاب 3.

5-إعداد حل الببتيد وصبغ الغشاء للتصوير

  1. الحل الببتيد
    1. في [ميكروفوج] أنابيب ملفوفة في رقائق الألومنيوم، حل 2 مغ فيتك المسمى BF2 P11A في 800 ميليلتر dH2استخدام سين ببتيد تحتوي على بقايا التربتوفان واحد على الأقل من أجل إجراء قياسات تركيز البروتين.
    2. سبيكتروفوتوميتريكالي، قياس امتصاص الحل الببتيد في 280 نانومتر في ثلاث نسخ. حساب تركيز الببتيد باستخدام معامل الانقراض المولى التربتوفان (5,700/مليون متر مكعب).
    3. تخفيف تركيز الببتيد في dH2س إلى تركيز نهائي من 100-200 ميكرومتر. مخزن في [ميكروفوج] أنابيب في-20 درجة مئوية مغلفة برقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.
  2. صبغ الغشاء
    1. في أنبوب [ميكروفوج]، إعداد مخزون 10 ملم من دي-8-أنيبس (592.9 g/mol) بإذابة 5 ملغ أنيبس-دي-8 في 843.3 ميليلتر من [دمس]. تخزين في 4 درجات مئوية مغلفة برقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.
    2. في أنبوب [ميكروفوج]، إعداد 1 مل من 0.03 مم دي-8-أنيبس بإضافة 3 ميليلتر من 10 ملم دي-8-أنيبس إلى 997 ميليلتر [دمس]. تخزين في [ميكروفوج] أنابيب عند 4 درجة مئوية مغلفة برقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.

6-التصور جدارها كولاي و ميجاتيريوم بروتوبلاستس باستخدام مجهر [كنفوكل]

  1. "الماصة؛" 5 ميليلتر من جدارها أو بروتوبلاستس إلى شريحة بولي-L-يسين المغلفة زجاج. إضافة 2 ميليلتر من فيتك المسمى أمبير (100-200 ميكرومتر) إلى الشريحة واحتضان لمدة 3 دقائق محمية من الضوء.
  2. أضف 1 ميليلتر من الغشاء صبغ دي-8-أنيبس (0.03 مم) إلى الشريحة واحتضان لمدة 3 دقائق محمية من الضوء. تغطية مع ساترة زجاجية وختم مع طلاء الأظافر.
  3. قم بتشغيل ليزر الأرجون ومجهر [كنفوكل]. ضبط ليزر الأرجون لإنتاج الكهرباء 20% وانتقال 20%.
  4. تعيين نطاقات الطول الموجي الانبعاثات من 499 – 532 نانومتر و 670 – 745 شمال البحر الأبيض المتوسط للقناة الانبعاثات الببتيد المسمى فيتك والغشاء دي-8-أنيبس-المسمى صبغ الانبعاثات القناة، على التوالي.
  5. بروتوبلاستس الصورة أو جدارها (الشكل 1 و الشكل 2) مع هدف X 63. استخدم برامج التصوير للحصول على 8-بت، 512 × 512 المركب z-رص الصور تتألف من 0.5 ميكرومتر شرائح برمتها سفيروبلاست أو جبلة مجردة.
    ملاحظة: يستغرق النظر الدقيق الحد من الانبعاث التسييل خلال أثناء التصوير جدارها وبروتوبلاستس. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.

7-وصف للتعريب أمبير

  1. فتح الصورة المركبة z-المكدس في برامج التصوير. تحديد موقع الشريحة الأكثر مركز سفيروبلاست أو جبلة مجردة ومكان واحد دائري المنطقة من الفائدة (ROI) (0.3 ميكرومتر في القطر) في الغشاء (ROI 1)، أحدهما في مركز سفيروبلاست أو جبلة مجردة (ROI 2)، والآخر بعيداً عن سفيروبلاست أو جبلة مجردة لقياس الأسفار الخلفية (ROI 3) (الشكل 5). تجنب إدراج مشبعة بكسل. ويمكن حساب كثافة الأسفار في كل دوروا ببرامج التصوير.
    ملاحظة: في الحالات عند عدم ترجمة الببتيد للغشاء بأكملها، رسم 1 العائد على الاستثمار في منطقة الغشاء حيث يتم ترجمة الببتيد.
  2. استخدم المعادلة التالية لتحديد نسبة كثافة fluorescence الببتيد داخل الخلايا لغشاء الببتيد fluorescence كثافة:
    Equation
    ملاحظة: يتم طرح كثافة fluorescence في 3 العائد على الاستثمار من شدة الأسفار في 2 العائد على الاستثمار والعائد على الاستثمار 1 بغية مراعاة للخلفية الفلورية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

طريق توسيع البكتيريا وجعلها كروية، يمكننا أن نميز بسهولة سواء الببتيدات تعريب للغشاء الجرثومي أو سهولة ترانسلوكاتي عبر الغشاء الجرثومي. حدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية تجعل من صعوبة التمييز بين ما إذا كانت الإشارات الببتيد تنشأ من الغشاء أو مساحة داخل الخلية في البكتيريا العادية لأنه سوف تظهر إشارات مترجمة للغشاء تتداخل مع الفضاء داخل الخلايا (الشكل 3A). على العكس من ذلك، ينتج الموسع حجم جدارها (2 – 5 ميكرون) وبروتوبلاستس (2 – 3 ميكرومتر) مقارنة بالبكتيريا العادية، وهي عادة فقط 1 ميكرومتر في القطر، قرار واضح بين علامة الغشاء والمسافة داخل الخلايا مما يجعل من الأسهل التمييز بين الببتيد التعريب (الشكل 3B).

هنا، يتم استخدام جدارها وبروتوبلاستس لإظهار نمط التعريب فيتك الطرفي ن المسمى P11A BF2 أمبير. ونلاحظ فيتك المسمى P11A BF2 على كل ترجمة للغشاء وترانسلوكاتي عبر غشاء الخلية من جدارها كولاي و (ب) ميجاتيريوم بروتوبلاستس (الشكل 4). في حين أنه لوحظ نوع البرية BF2 ترانسلوكاتي عبر أغشية حويصلة كولاي والدهن، المعروف الطفرة P11A لتقليل هذا إزفاء13،،من2728. ونحن تستخدم مقاومة غير المضادات الحيوية ميجاتيريوم باء ومقاومة الأمبيسلّين أعلى 10 كولاي (pET45B) في البيانات المقدمة. وكان مقاومة الأمبيسلّين كولاي تزرع حضور الأمبيسلّين (349.4 g/mol) بتركيز 25 ميكروغرام/مل نهائي في الحل. للتصوير، واتباع النهج المنهجية المبينة في الباب 7، استخلصت رويس في الغشاء والفضاء داخل الخلايا والخلفية (الشكل 5 (ب)). وحسبت نسبة كثافة fluorescence الببتيد داخل الخلايا لكثافة fluorescence الببتيد في الغشاء لكل سفيروبلاست أو جبلة مجردة التفاعل مع BF2 P11A باستخدام المعادلة هو موضح في القسم 7.2. ويبين الشكل 5A توزيع هذه النسبة في كل من جدارها وجبلة مجردة وسجل. وسجل جدارها وبروتوبلاستس إلى حد كبير وانخفض إلى مجموعتين، مع الأغلبية من جدارها أو بروتوبلاستس لها بنسبة 0.3 أقل من أو أكبر من 1.

نظراً للمجموعات المتميزة التي تندرج النسب، حددنا التعريب الببتيد ترانسلوكاتينج عندما كانت النسبة المحسوبة في الفرع 7-2 أكبر من أو يساوي 1. على العكس من ذلك، كان يعرف التعريب الببتيد غشاء إضفاء الطابع المحلي عندما كانت نسبة هو موضح في القسم 7.2 أقل من 1. وباتباع هذه الطريقة التهديف، لاحظنا تعريب نمطاً مماثلاً ل BF2 P11A في جدارها كولاي و ب ميجاتيريوم بروتوبلاستس مع BF2 P11A إضفاء الطابع المحلي على الغشاء في 71% و 70% من الحالات جدارها كولاي و (ب) ميجاتيريوم بروتوبلاستس، على التوالي (الجدول 1).

Figure 1
الشكل 1: صور الممثل كولاي. ثعبان كولاي بكتيريا (ب) (أ) كولاي وسفيروبلاست كولاي من (ج). صور أخذت في 100 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: صور الممثل من ميجاتيريوم (ب). (أ) ميجاتيريوم (ب) البكتيريا وجبلة مجردة (ب) ميجاتيريوم (ب) . صور أخذت في 100 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: صور الممثل من ميجاتيريوم (ب). الخلايا البكتيرية (أ) ميجاتيريوم (ب) و (ب) ميجاتيريوم (ب) جبلة مجردة المسمى بغشاء العلامة دي-8-أنيبس. الصور من الأوسط z-المكدس ترد في 100 X (A) و 63 X (ب) التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: جدارها الممثل كولاي وبروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) التفاعل مع فيتك المسمى BF2 P11A- (أ) إظهار سفيروبلاست كولاي BF2 P11A الترجمة للغشاء. (ب) إظهار سفيروبلاست كولاي BF2 P11A ترانسلوكاتينج عبر الغشاء. (ج) إظهار جبلة مجردة ميجاتيريوم BF2 P11A الترجمة للغشاء. (د) إظهار جبلة مجردة ميجاتيريوم BF2 P11A ترانسلوكاتينج عبر الغشاء. يتم تسمية جدارها كولاي وبروتوبلاستس ميجاتيريوم باء- مع الغشاء علامة دي-8-أنيبس (أحمر) والمسمى فيتك BF2 P11A (أخضر). تظهر الصور من الأوسط z-المكدس في 63 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحليل لأنماط الترجمة الببتيد- (أ) توزيع نسبة كثافة الأسفار داخل الخلايا (ROI 2) للغشاء fluorescence كثافة (ROI 1) بعد الطرح الخلفية ((ROI 2-عائد الاستثمار 3)/(ROI 1-عائد الاستثمار 3)) جدارها كولاي و ب ميجاتيريوم بروتوبلاستس المسمى مع BF2 P11A سفيروبلاست كولاي من (ب) التفاعل مع فيتك المسمى BF2 P11A. التعميم المناطق للفائدة (ROI) 0.3 ميكرومتر في القطر مرسومة على مساحة غشاء (ROI 1) داخل الخلايا (2 العائد على الاستثمار) والخلفية (3 العائد على الاستثمار). كان كمياً كثافة fluorescence الببتيد في كل عائد الاستثمار واستأثرت fluorescence الخلفية عن طريق طرح شدة الأسفار في 3 عائد الاستثمار من شدة الأسفار في 1 العائد على الاستثمار والعائد على الاستثمار 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

سلالة بكتيرية لا. جبلة مجردة أو سفيروبلاست إضفاء الطابع المحلي على غشاء % ترانسلوكاتينج %
كولاي 84 71 29
ب-ميجاتيريوم 70 70 30

الجدول 1: نمط التعريب P11A bf2 التفاعل مع كولاي جدارها و ميجاتيريوم بروتوبلاستس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البروتوكولات المقدمة هنا جعله قابلاً للباحثين للحصول على أحجام العينة أكبر من الصور البكتيرية أكثر سرعة لأن البكتريا الموسع، كروية أسهل بكثير تحديد وتوجيه، وصورة. هذه القدرة المحسنة لجمع البيانات قيمة من نواح عدة. أولاً، أنه يمكن تحليل كمي أكثر منهجية لأنماط التعريب الببتيد. بينما يمكن أن تبين الاتجاهات النوعية من مجموعات أصغر من الصور، فقط مجموعة عينة كبيرة من الصور عالية الجودة تكشف أكثر دقة اتجاهات في أنماط الترجمة، مثل النسبة المئوية للخلايا حيث translocates ببتيد مقابل يموضع غشاء. أيضا، القدرة على تصميم أفضل الأسفار الداخلية من إضفاء الطابع المحلي على غشاء يجعل من الأسهل لأداء وقت دورة دراسات لتقييم مدى سرعة الببتيدات تتفاعل مع الخلايا البكتيرية، وكذلك كيفية تغيير أنماط الترجمة على مر الزمن. كما يسمح هذا القرار تحسين الباحثين للنظر في الاتجاهات في التعريب الببتيد التي ليست ممكنة مع البكتيريا أصغر. على سبيل المثال، تظهر الببتيدات في بعض من جدارها الملاحظة وبروتوبلاستس، إلى ترجمة لأجزاء معينة من الغشاء، أي إشارات الببتيد لا تشكل حلقة كاملة ومتماسكة حول البكتيريا وبدلاً من ذلك تظهر بعض الشروريه وضع العلامات. وفي حالات أخرى، الببتيدات قد لا يتم توزيعها بشكل متساو تماما داخل الغشاء البكتيري، أي إشارات الببتيد لا شغل المساحة الداخلية للبكتيريا تماما. في حين أننا لم متابعة هذه الاتجاهات في تحليلنا الحالي، النظر في مثل هذه الاتجاهات التعريب يصبح ممكناً عند التصوير جدارها وبروتوبلاستس بدلاً من الخلايا البكتيرية القياسية. هذه المزايا تنطبق أيضا على تحديد إضفاء الطابع المحلي على الببتيدات خلاف الامبير، مثل الببتيدات اختراق الخلية. يمكن أيضا الاستفادة من جدارها وبروتوبلاستس المنتجة بهذه النهج للتجارب غير التصوير التي تستفيد من زيادة حجم الخلايا، مثل المشبك تصحيح القياسات الكهربية18،19.

ليزر المسح مجهر [كنفوكل] استخدمت في تطوير أعمالنا البروتوكول التصوير، إلا أنها حاسمة لتحسين معلمات لكل نظام تصوير محددة. وهذا يشمل تحديد مجموعة من المعلمات التي تعظم من الكشف عن الأسفار صبغ الببتيد والغشاء، مع التقليل من خلال تنزف من صبغ الغشاء إلى قناة الببتيد للانبعاثات، ومن الببتيد المسمى فيتك في الغشاء الذي قناة الانبعاثات. التسييل خلال من الببتيد إلى قناة الانبعاثات الغشاء الذي كان تجنبها بتحديد نطاق الطول موجي للانبعاثات القناة الغشاء التي لم تشتمل على أي جزء من طيف انبعاث فيتك. تنزف من خلال من صبغ الغشاء، كان دي-8-أنيبس، إلى قناة الببتيد الانبعاثات أكثر صعوبة لتجنب بسبب الانبعاث الطيف دي-8-أنيبس يتراكب مع غالبية الطيف فيتك للانبعاثات. المحددة في هذا البروتوكول، التسييل خلال من صبغ الغشاء إلى قناة الببتيد الانبعاثات يمكن أن يؤدي وصف الامبير كاذبة كغشاء المترجمة. واحد يمكن تحديد إذا كان يحدث التسييل خلال هذا النوع من التصوير جدارها أو بروتوبلاستس التي وصفت حصرا مع صبغ الغشاء والتحقق لمعرفة ما إذا كانت الأسفار مرئية في قناة الببتيد الانبعاثات. يمكن اختبار معلمات التصوير المختلفة، بما في ذلك نطاق الطول الموجي المستخدمة لتحديد قناة الببتيد الانبعاثات وقيم الإزاحة والكسب، بصورة منتظمة لتحديد مجموعة من المعلمات أن يقلل إلى أدنى حد عن طريق التسييل. حالما يتم إنشاء مجموعة من المعلمات، من المهم لتقييم ما إذا كان تصوير غلة القوى الكشف عن إشارة الأسفار عندما تستخدم جدارها أو بروتوبلاستس المسمى بصبغ الببتيد والغشاء. من خلال هذا النهج، بنجاح إنشاء معلمات التصوير أن التقليل من التأثير خلال التسييل مع تعظيم كشف fluorescence أمبير المسمى فيتك والغشاء صبغ دي-8-أنيبس. على وجه التحديد، وجدنا أن الانبعاثات تنزف من خلال من صبغ الغشاء إلى قناة الببتيد تم تصغير استخدام نطاقات الطول الموجي الانبعاثات 499 – 532 نانومتر (ببتيد) وشمال البحر الأبيض المتوسط 670-745 (غشاء)، وعندما عدل المكسب ليكون دي إيت زيرو زيرو فولت (V) (ببتيد) و تم تعديل دي ناين زيرو زيرو الخامس (غشاء) والإزاحة إلى ≤-10.0% (الببتيد، والغشاء).

على الرغم من أن ركزنا على كولاي وميجاتيريوم باء، البروتوكولات المقدمة يمكن تكييفها وفقا لإنتاج جدارها أو بروتوبلاستس من كثير من السلالات البكتيرية المختلفة. على سبيل المثال، تمكنا من تنتج بنجاح نجحت Bacillus بروتوبلاستس التي كانت 1 – 2 ميكرومتر في القطر باستخدام البروتوكول الواردة في القسم 4، ويمكن أن تقدم التعديلات للبروتوكول إلى مزيد تحسين حجم. القدرة على مراقبة الببتيد أنماط التعريب في بكتيريا سلبية الغرام وإيجابية على حد سواء مفيدة بشكل خاص لدراسة الامبير نظراً للاختلافات في هيكل الخلية جدار بين هاتين الطبقتين من البكتيريا قد تؤثر على كيفية تفاعل الامبير مع الأغشية الخلوية. بيد أن العديد من دراسات التصوير للمكاتب الإقليمية للمرأة حتى الآن ركزت فقط على نموذج كولاي سلالات، وهكذا، قد لا يعكس سلوك الببتيدات مع السلالات البكتيرية إيجابية.

جدارها وبروتوبلاستس تختلف عن البكتيريا العادية، لا سيما في افتقارها إلى الخلية جدار خارجي، ونتيجة لذلك قد لا تكون نماذج جيدة لجميع الأسئلة التجريبية. على سبيل المثال، قد ثبت الغشاء الخارجي للبكتريا سلبية الغرام بمثابة غربال جزيئية ل جزيئات أكبر29. الببتيدات أكبر، لذلك، قد تكون قادراً على ترانسلوكاتي في جدارها عند أنها لن تفعل ذلك في البكتيريا العادية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن إجراء دراسات تفصيلية لتفاعل أمبير مع جدار الخلية البكتيريا والغشاء الخارجي، وغشاء هيولى استخدام جدارها وبروتوبلاستس. على سبيل المثال، استخدمت العمل مؤخرا من مختبر ويسشار بالتصوير لملاحظة مواقف أكثر دقة من الببتيد في آليات عمل30،31CM15 وميليتين. ومع ذلك، نهجنا، كما هو موضح هنا، لا يتطلب تنفيذ ميكروفلويديكس في أجهزة الفحص المجهري بغية تحقيق القرار المطلوب31. على الرغم من أن الأعمال السابقة أظهرت أن جدارها صالحة21،32، مع ذلك يرجح أن لديهم بعض الاختلافات الأيضية والفسيولوجية من البكتيريا "العادية" التي يمكن أن يحتمل أن تغير التفاعلات الغشاء في بعض الحالات. بالإضافة إلى ذلك، نظراً لأننا لم تقييم جدوى السكان سفيروبلاست، واحد لا يميز بين ببتيد بسهولة قادرة على ترانسلوكاتي عبر غشاء الخلية من خلية حية مقابل ببتيد التي يمكن ترانسلوكاتي فقط عبر ميت أو موت الخلية. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، وقد شهدنا أنماط التعريب في جدارها كولاي للعديد من المكاتب الإقليمية للمرأة التي تنسجم مع آليات معروفة للعمل15، والنتائج التي توصلنا إليها BF2 P11A مع بروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) المقدمة هنا ويبدو متسقا مع ملاحظات أخرى لأن الببتيد13،،من2728. التراكيب غشاء جدارها وبروتوبلاستس أيضا التأكيد ذات الصلة أكثر فسيولوجيا من الخلائط النموذجية المستخدمة في نظم نموذجية أخرى، مثل الحويصلات الدهنية. وباختصار، نظراً إلى القرار المحسنة وسهولة التصوير التي يوفرها جدارها وبروتوبلاستس، نعتقد أنها نماذج مفيدة لتصور غشاء فاعلة، مثل المكاتب الإقليمية للمرأة، في مجموعة من السلالات البكتيرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يتم تعريف لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وكان دعم البحوث "المعهد الوطني للحساسية" و "الأمراض المعدية" (المعاهد الوطنية للصحة-نييد) جائزة R15AI079685.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20, (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24, (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19, (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80, (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8, (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4, (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40, (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838, (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29, (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9, (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818, (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39, (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4, (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107, (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25, (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111, (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32, (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39, (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128, (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114, (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819, (1), (1985).
الإنتاج والتصور جدارها البكتيرية وبروتوبلاستس لتميز التعريب الببتيد مضادات الميكروبات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter