Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Produktion og visualisering af bakterielle Spheroplasts og Protoplasts til at karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering

doi: 10.3791/57904 Published: August 11, 2018

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at producere gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts at visualisere, klart og hurtigt karakterisere peptid-bakterier interaktioner. Dette giver en systematisk metode til at definere membran lokalisering og translocating peptider.

Abstract

Konfokal mikroskopi anvendes som en metode til at vurdere peptid lokalisering mønstre inden for bakterier er almindeligvis hæmmet af opløsning grænserne for konventionelle lys mikroskoper. Som opløsning for en given mikroskop ikke kan være let forbedret, præsenterer vi protokoller for at omdanne små stavformet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) i større, let afbildet sfæriske formularer kaldes spheroplasts eller protoplasts. Denne transformation tillader observatører til hurtigt og klart fastslå, om peptider indgive sig ind i den bakterielle membran (dvs, membranen lokalisering) eller krydse membran for at komme ind i cellen (dvs. translocating). Med denne tilgang fremlægge vi også en systematisk metode til at karakterisere peptider som membran lokalisering eller translocating. Mens denne metode kan bruges til en bred vifte af membran-aktive peptider og bakteriestammer, vi påvise nytten af denne protokol ved at observere samspillet mellem Buforin II P11A (BF2 P11A), et antimikrobielt peptid (AMP), med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antimikrobielle peptider (AMP'er) har fået opmærksomhed på grund af deres potentielle anvendelse som alternativer til konventionel antibiotika1,2,3,4,5. Ampere dræbe bakterier ved enten translocating over cellemembranen og interagere med intracellulære komponenter såsom nukleinsyrer eller af permeabilizing membranen forårsager lækage af celle indhold6. Ud over deres anvendelse som antibiotika, kan translocating ampere tilpasses for drug delivery ansøgninger fordi de kan ikke-båndstationer krydser uigennemtrængelige cellemembranen7,8. Derfor søger vi, at forstå grundlæggende AMP virkningsmekanismer at lægge fundamentet for deres anvendelse i stof design.

Konfokal mikroskopi tilbyder en måde at vurdere lokalisering mønstre af fluorescently mærket ampere i bakterieceller giver indsigt i deres mekanisme af aktion9,10,11,12, 13 , 14. ved mærkning membranen af bakterier, kan man bestemme, hvis en fluorescently mærket peptid lokaliserer membranen eller det intracellulære rum for en bakteriel celle. Dog, denne teknik er begrænset af den lille størrelse og stang form af bakterier, som kan gøre imaging udfordrende på grund af resolution grænserne for konventionelle lys mikroskoper og den variable orientering af bakterier på slide15.

Målet med metoden præsenteres er at aktivere udvidet visualisering af fluorescently mærket peptid lokalisering mønstre ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Visualisering er forbedret ved at dreje på små, tynde, stavformet gram-negative Escherichia coli (E. coli) og gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) bakterier i udvidet, sfæriske formularer omtales som spheroplasts (for gram-negative stammer) og protoplasts (for gram-positive stammer)16,17,18,19,20,21. Spheroplasts og protoplasts er nemmere at billedet på grund af deres større størrelse og deres symmetriske form, hvilket gør orientering af en bakterie på et dias irrelevant for dens billeddannelse. Derudover præsenterer vi en systematisk metode til at analysere kvantitativt konfokalmikroskopi data for at karakterisere ampere som enten membran lokalisering eller translocating. Disse metoder gør det lettere at skelne fluorescently mærket peptid lokalisering mønstre. Protokollerne præsenteres her kan bruges til at vurdere lokalisering af en bred vifte af membran-aktive agenter end ampere, herunder celle-gennemtrængende peptider.

En klar fordel af denne teknik er, at det giver et indblik i virkningsmekanismen af ampere på en enkelt celle niveau, som kan afsløre celle til celle heterogenitet15, i modsætning til andre fluorescens assays almindeligt anvendt til at identificere de virkningsmekanismer ampere, som kun giver bulk skøn9,22,23,24,25. Brug af spheroplasts og protoplasts for at vurdere AMP celleindtastning er særlig nyttige26 , fordi de er mere fysiologisk relevante15 end andre modeller, der anvendes til at vurdere celleindtastning som lipid vesikler24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. løsning forberedelse

Bemærk: Forberede løsninger beskrives i trin 1.1-1.9 og 1,8-1.11 for at producere E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts, henholdsvis.

  1. Forberede 1 M Tris-Cl, pH 7,8 ved at opløse 10.34 g Tris HCl og 4,17 g af Tris OH i 50 mL af dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved stuetemperatur.
  2. Forberede løsning A 20 mM MgCl2, 0,7 M saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8, ved at opløse 0,10 g MgCl2 (95.2 g/mol) og 11.98 g saccharose (342.3 g/mol) i 25 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Tilsættes 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) og justere lydstyrken til 50 mL. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved stuetemperatur.
  3. Forberede løsning B (10 mM MgCl2, 0,8 M saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) ved at opløse 0,05 g MgCl2 (95.2 g/mol) og 13.69 g saccharose (342.3 g/mol) i 25 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Tilsættes 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) og justere lydstyrken til 50 mL. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved stuetemperatur.
  4. Forbered 0,8 M saccharose ved at opløse 13.69 g saccharose (342.3 g/mol) i 50 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved stuetemperatur.
  5. Forberede 5 mg/mL deoxyribonuclease jeg (DNase jeg) ved at opløse 0,015 g DNase jeg i 3 mL af dH2O i en 50 mL målekolbe. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran. Alikvot løsning i mikrofuge rør og opbevares ved-20 ° C.
  6. Forberede 0,125 M ethylendiamintetra syre (EDTA), pH 8,0 ved at opløse 0.698 g EDTA dinatrium dehydrere (372.2 g/mol) i 15 mL dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved stuetemperatur.
  7. Forberede 600 µg/mL cephalexin ved at opløse 0,03 g af cephalexin hydrat (365.404 g/mol) i 50 mL af dH2O i en 125 mL kolbe. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved 4 ° C.
  8. Forberede 5 mg/mL lysozym ved at opløse 0,015 g lysozym i 3 mL af dH2O i en 50 mL målekolbe. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran. Alikvot løsning i mikrofuge rør og opbevares ved-20 ° C.
  9. Forbered 3% w/v Trypticase soja bouillon (TSB) ved at opløse 30 g af TSB i 1 L dH2O i en 2 L kolbe. Alikvot løsning i målekolber 25 mL indeholdende 100 mL TSB skal anvendes ved udarbejdelsen af E. coli spheroplasts eller B. megaterium protoplasts, henholdsvis. Autoklave kolber til at sterilisere den flydende medium. Sterile TSB kan opbevares ved stuetemperatur eller 4 ° C.
  10. Forberede løsning C (1 M saccharose, 0,04 M maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) ved at opløse 34.23 g saccharose (342.3 g/mol), 0,46 g maleinsyre (116.07 g/mol), og 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) i 100 mL af dH2O i en 250 mL kolbe. Juster pH-værdien til 6,5. Sterilisere ved filtrering gennem et 25 mm sprøjte filter med en 0,2 µm membran og gemme i en konisk slange ved stuetemperatur.
  11. Forberede 200 mL protoplast medium ved blanding af 100 mL 3% w/v TSB og 100 mL opløsning C i 1 L glasflaske. Autoklave til at sterilisere løsningen og opbevares ved stuetemperatur.

2. forberedelse af Overnight kultur

Bemærk: Udføre sektioner 2-4 ved hjælp af passende steril teknik. Hvis det ønskes, kan en bakteriel stamme indeholder et plasmid for antibiotikaresistens at reducere den potentielle forurening. Hvis bruger en stamme med antibiotikaresistens, tilføje de nødvendige antibiotika i trin 2.1, 3.1-3.2 og 4.1-4.4.

  1. Forberede en overnight kultur ved at vælge en enkelt koloni af bakterier ved hjælp af en steril pipette tip og placere det i en 14 mL kultur rør indeholdende 2-3 mL 3% w/v TSB. Der inkuberes ved 37 ° C, mens ryste for 16 – 21 h.

3. forberedelse af Gram-negative E. coli Spheroplasts

  1. I en 250 mL målekolbe fortyndes den overnight kultur 1: 100 i 25 mL volumen af 3% w/v TSB og Inkuber den bakterielle løsning ved 37 ° C, mens ryste ca 2.5 timer, indtil løsningen har nået en optisk tæthed af 0,5-0,8 på 600 nm. Måling af ekstinktionen bruger et spektrofotometer.
  2. I en 250 mL målekolbe fortyndes denne kultur 1:10 i 30 mL 3% w/v TSB og inkuberes ved 37 ° C, mens ryste for 2,5 h i overværelse af 60 µg/mL cephalexin (347.4 g/mol) til at producere enkelt celle filamenter af omkring 50-150 µm i længden , som er observerbare under 1.000 X forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop (figur 1B).
  3. Høst af filamenter af centrifugering bakteriel løsningen på 1.500 x g, 4 ° C i 4 min. Decant og supernatanten, reservere pelleten.
  4. Vask af filamenter af forsigtigt tilsætning af 1 mL af 0,8 M saccharose, være omhyggelig med ikke at forstyrre pelleten. Inkuber i 1 min og derefter supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  5. Tilsæt 150 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL af 5 mg/mL Lysozym, 30 µL af 5 mg/mL DNase jeg, og 120 µL af 0,125 M EDTA i deres respektive for at pellet og inkuberes løsning ved stuetemperatur i 10 min.
  6. Tilsæt 1 mL af opløsning A gradvist over 1 min til opløsningen tilberedes på 3,5 med en mikropipette, mens blidt hvirvlende løsningen i hånden. Inkuber løsning i 4 min ved stuetemperatur.
  7. Sat 7 mL 4 ° C løsning B i to 15 mL konisk rør. Tilføj lige store mængder af en opløsning fremstillet i 3.6 til hver af disse to rør. Der centrifugeres løsning på 1.500 x g, 4 ° C i 4 min.
  8. Ved hjælp af en serologisk pipette, forsigtigt fjerne alle undtagen 1-2 mL af supernatanten uden at forstyrre pelleten. Resuspenderes af forsigtigt pipettering op og ned ved hjælp af en P1000 mikropipette. Visuelt kontrollere for at se spheroplasts dannelse ved at observere prøven ved 1000 X forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop (figur 1 c).
  9. Opbevar spheroplasts ved-20 ° C i op til en uge, eller indtil de har været igennem 3 fryse-tø cykler.

4. forberedelse af Gram-positive B. megaterium Protoplasts

  1. I en 250 mL målekolbe fortyndes den overnight kultur 1:1,000 i 100 mL 3% w/v TSB og Inkuber den bakterielle løsning ved 37 ° C, mens ryste for ca 4,5 h indtil løsningen har nået en optisk tæthed på 0,9-1,0 på 600 nm. Måling af ekstinktionen bruger et spektrofotometer.
  2. Hæld den flydende kultur i to 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 2.000 x g, 4 ° C i 10 min.
  3. Ved hjælp af en serologisk pipette, supernatanten fra både koniske rør. Resuspend hver pellet i 2,5 mL protoplast medium og kombinere de resuspenderede løsninger i en enkelt koniske rør. Tilsæt den kombinerede resuspenderede løsning i en 125 mL kolbe.
  4. Der tilsættes 1 mL af 5 mg/mL lysozym og Inkuber i 1 time ved 37 ° C, mens ryste.
  5. Overvåge vækst af protoplasts under 1.000 x forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop, konstaterer uregelmæssigheder, såsom bakterier, der vises som hævede stænger i stedet for kugler (figur 2). Ved hjælp af en serologisk pipette, overføre løsningen til en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 2.000 x g, 4 ° C i 10 min.
  6. Den dekanteres og genopslæmmes pellet i 5 mL protoplast medier. Opbevar protoplasts ved-20 ° C i op til en uge, eller indtil de har været igennem 3 fryse-tø cykler.

5. forberedelse af peptid løsning og membran farvestof til billedbehandling

  1. Peptid løsning
    1. I et mikrofuge rør i aluminiumsfolie, opløses 2 mg af FITC mærket BF2 P11A i 800 µL dH2O. Brug et peptid, der indeholder mindst én tryptophan restkoncentrationer med henblik på protein koncentration målinger.
    2. Spektrofotometrisk, absorbansen af peptid løsning på 280 nm i tre eksemplarer. Beregne peptid koncentrationen ved hjælp af molær ekstinktion koefficient for tryptophan (5700/Mcm).
    3. Fortyndet koncentrationen af peptid i dH2O til en endelig koncentration på 100-200 µM. butik i et mikrofuge rør ved-20 ° C indpakkede i alufolie til at beskytte mod lys.
  2. Membran farvestof
    1. I et mikrofuge rør, skal du forberede en 10 mM bestand af di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) ved at opløse 5 mg af di-8-ANEPPS i 843.3 µL af DMSO. Opbevares ved 4 ° C i aluminiumsfolie til at beskytte mod lys.
    2. I et mikrofuge rør, forberede 1 mL af 0,03 mM di-8-ANEPPS ved at tilføje 3 µL af 10 mM di-8-ANEPPS til 997 µL DMSO. Opbevares i et mikrofuge rør ved 4 ° C i aluminiumsfolie til at beskytte mod lys.

6. visualisering af E. coli Spheroplasts og B. megaterium Protoplasts ved hjælp af konfokalmikroskopi

  1. Der afpipetteres 5 µL af spheroplasts eller protoplasts på en poly-L-lysin coatede glas dias. Tilføj 2 µL af FITC mærket AMP (100-200 µM) til diaset og Inkuber i 3 min beskyttet mod lys.
  2. Tilføj 1 µL af membran farvestof di-8-ANEPPS (0,03 mM) til diaset og Inkuber i 3 min beskyttet mod lys. Dække med et glas coverslip og forsegle med neglelak.
  3. Tænde Konfokal mikroskop og argon laser. Justere argon laser til 20% effekt og 20% transmission.
  4. Indstille emission bølgelængde intervaller af 499-532 nm og 670-745 nm for FITC-mærket peptid emission kanal og di-8-ANEPPS-mærket membran farvestof emission kanal, henholdsvis.
  5. Billede protoplasts eller spheroplasts (figur 1 og figur 2) med en 63 X mål. Bruge billedbehandling software til at få 8-bit, 512 x 512 sammensatte z-stak billeder består af 0,5 µm skiver af helhed af spheroplast eller protoplast.
    Bemærk: Tage nøje overvejelse at reducere emission gennemblødning mens imaging spheroplasts og protoplasts. Se diskussion for detaljer.

7. karakterisering af AMP lokalisering

  1. Åbn det sammensatte z-stakken billede i imaging software. Find centrum-de fleste skive af spheroplast eller protoplast og placere en cirkulær Region af interesse (ROI) (0,3 µm i diameter) på membran (ROI 1), en i midten af spheroplast eller protoplast (ROI 2), og en fra spheroplast eller protoplast til at måle baggrund fluorescens (ROI 3) (figur 5). Undgå optagelse af mættede pixels. Fluorescens-intensiteten i hver ROI kan beregnes af imaging software.
    Bemærk: I tilfælde når peptid ikke lokalisere til helhed af membranen, tegne ROI 1 på et område af membranen, hvor peptid er lokaliseret.
  2. Brug følgende formel til at bestemme forholdet mellem intracellulære peptid fluorescens intensitet til membran peptid fluorescens intensitet:
    Equation
    Bemærk: Fluorescens-intensiteten i ROI 3 trækkes fra fluorescens intensiteter i ROI 2 og ROI 1 for at tage højde for baggrunden fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved udvidelse af bakterier og gør dem sfæriske, kan vi nemt skelne om peptider lokalisere til den bakterielle membran eller let translocate på tværs af den bakterielle membran. Opløsning grænserne for konventionelle lys mikroskoper gøre det udfordrende for at skelne om peptid signaler opstår fra membran eller intracellulære rum i normale bakterier fordi signaler er lokaliseret til membranen vises overlapper med den intracellulære rum (figur 3A). I modsætning hertil er resulterer den udvidede størrelse af spheroplasts (2-5 µm) og protoplasts (2-3 µm) i forhold til normale bakterier, der typisk kun er 1 µm i diameter, i klar beslutning mellem membran markør og det intracellulære rum gør det lettere at skelne peptid lokalisering (figur 3B).

Her, bruges spheroplasts og protoplasts til at vise lokalisering mønster af den N-terminale FITC mærket AMP BF2 P11A. Vi observerer FITC mærket BF2 P11A for at både lokalisere til membranen og translocate på tværs af cellemembranen af E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts (figur 4). Mens vildtype BF2 er blevet observeret for at translocate på tværs af E. coli og lipid vesikel membraner, er P11A mutation kendt for at reducere denne translokation13,27,28. Vi udnyttede en ikke-antibiotika-resistente B. megaterium og ampicillin resistente Top 10 E. coli (pET45B) i data præsenteret. Den ampicillin resistent E. coli blev dyrket i overværelse af ampicillin (349.4 g/mol) i en endelig koncentration i opløsning på 25 µg/mL. For billeddannelse, var efter den systematiske tilgang skitseret i afsnit 7, ROIs trukket på membranen, intracellulære rum og baggrunden (figur 5B). Forholdet mellem intracellulære peptid fluorescens intensitet til peptid fluorescens intensitet på membranen blev beregnet for hver spheroplast eller protoplast interagere med BF2 P11A ved hjælp af ligningen, der er beskrevet i afsnit 7.2. Fig. 5A viser fordelingen af dette forhold for alle spheroplasts og protoplast scorede. Spheroplasts og protoplasts scorede i vid udstrækning faldt i to grupper, med fleste af spheroplasts eller protoplasts at have et forhold på mindre end 0,3 eller større end 1.

I betragtning af de forskellige grupper, at forholdet falder ind under, defineret vi peptid lokalisering som translocating da forholdet beregnes i afsnit 7.2 var større end eller lig med 1. Omvendt blev peptid lokalisering defineret som membran lokalisering når forholdet er beskrevet i afsnit 7.2 var mindre end 1. Efter denne metode til scoring, konstaterede vi en lignende lokalisering mønster for BF2 P11A i E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts med BF2 P11A lokalisering til membranen i 71% og 70% af tilfældene for E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts, henholdsvis (tabel 1).

Figure 1
Figur 1: Repræsentative billeder af E. coli. (A) E. coli bakterier (B) E. coli slange og (C) E. coli spheroplast. Billeder blev taget på 100 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af B. megaterium. (A) B. megaterium bakterier og (B) B. megaterium protoplast. Billeder blev taget på 100 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentant billeder af B. megaterium. (A) B. megaterium bakteriel celle og (B) B. megaterium protoplast mærket med membran markør di-8-ANEPPS. Billeder fra den midterste z-stakken er vist på 100 X a og 63 X (B) forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentant E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts interagere med FITC mærket BF2 P11A. (A) E. coli spheroplast viser BF2 P11A lokalisering til membranen. (B) E. coli spheroplast viser BF2 P11A translocating på tværs af membranen. (C) B. megaterium protoplast viser BF2 P11A lokalisering til membranen. (D) B. megaterium protoplast viser BF2 P11A translocating på tværs af membranen. E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts er mærket med membran markør di-8-ANEPPS (rød) og FITC mærket BF2 P11A (grøn). Billeder fra den midterste z-stakken er vist på 63 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: analyse af peptid lokalisering mønstre. (A) Distribution af forholdet mellem intracellulære fluorescens intensitet (ROI 2) til membran fluorescens intensitet (ROI 1) efter baggrund subtraktion ((ROI 2-ROI 3) / (ROI 1-ROI 3)) for E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts mærket med BF2 P11A (B) E. coli spheroplast interagere med FITC mærket BF2 P11A. Cirkulære områder af interesse (ROI) 0,3 µm i diameter trukket på membran (ROI 1) intracellulære rum (ROI 2) og baggrund (ROI 3). Fluorescens-intensiteten af peptid blev kvantificeret i hver ROI og baggrunden fluorescens blev regnet ved at fratrække fluorescens-intensiteten i ROI 3 fra fluorescens-intensiteten i ROI 1 og ROI 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Bakteriel stamme Lol spheroplast eller protoplast % Membran lokalisering % Translocating
E. coli 84 71 29
B. megaterium 70 70 30

Tabel 1: lokalisering mønster BF2 P11A interagere med E. coli spheroplasts og B. megaterium protoplasts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollerne præsenteres her gøre det muligt for forskere at hurtigere få større stikprøvestørrelser af bakteriel billeder fordi de udvidede, kugleformede bakterier er meget lettere at finde, orientere og image. Denne udvidede evne til at indsamle data er værdifulde i flere henseender. Først, det giver mulighed for en mere systematisk kvantitativ analyse af peptid lokalisering mønstre. Mens kvalitative tendenser kan godtgøres fra mindre sæt af billeder, kun stor stikprøve sæt af billeder i høj kvalitet afsløre mere nuanceret tendenser i lokalisering mønstre, som procentdelen af celler hvor en peptid translocates versus lokaliserer til den membran. Evnen til at bedre løse den interne fluorescens fra membran lokalisering gør det også lettere at udføre gang kursus undersøgelser for at vurdere, hvordan hurtigt peptider interagere med bakterieceller samt, hvordan lokalisering mønstre ændrer sig med tiden. Den forbedrede opløsning giver også mulighed for forskere at Overvej trends i peptid lokalisering, der ikke er muligt med mindre bakterier. For eksempel, i nogle af vores observerede spheroplasts og protoplasts synes peptider at lokalisere til bestemte sektioner af membranen, dvs peptid signaler ikke danner en komplet, sammenhængende ring omkring bakterier og i stedet vise nogle punktformet mærkning. I andre tilfælde, peptider kan ikke fordeles helt jævnt inde i den bakterielle membran, dvs., peptid signaler, ikke helt fylde det indre rum af bakterier. Mens vi ikke har fulgt disse tendenser i vores aktuelle analyse, bliver i betragtning af sådanne lokalisering tendenser muligt når imaging spheroplasts og protoplasts i stedet for standard bakterieceller. Disse fordele vil også gælde for bestemmelse af lokalisering af peptider end ampere, såsom celle-gennemtrængende peptider. Spheroplasts og protoplasts fremstillet med disse metoder kan også udnyttes til ikke-imaging eksperimenter, der drager fordel af øget cellulær størrelse, såsom patch-clamp Elektrofysiologi målinger18,19.

En laser scanning Konfokal mikroskop blev udnyttet i udviklingen af vores imaging protokol, men det er afgørende at optimere parametre for hver specifik billedbehandlingssystem. Dette omfatter at vælge et sæt af parametre, Maksimer påvisning af peptid og membran farvestof fluorescens, samtidig minimere gennemblødning fra membran farvestof i de peptid emission kanal, og fra den FITC-mærket peptid i membranen emission kanal. Gennemblødning fra peptid i den membran emission kanal blev undgået ved at vælge en bølgelængdeområdet for den membran emission kanal, som ikke indeholder nogen del af FITC'S emission spektrum. Gennemblødning fra membran dye, di-8-ANEPPS i den peptid emission kanal var vanskeligere at undgå fordi di-8-ANEPPS' emission spektrum overlapper med fleste af FITC'S emission spektrum. Specifikt for denne protokol, gennemblødning fra membran farvestof i de peptid emission kanal kan resultere i falske karakterisering af ampere som membran lokaliseret. Man kan bestemme hvis gennemblødning af denne art forekommer ved imaging spheroplasts eller protoplasts, der udelukkende er mærket med membran farvestof og kontrollere for at se, om Fluorescens er synlige i den peptid emission kanal. Forskellige imaging parametre, herunder bølgelængdeområdet bruges til at definere den peptid emission kanal og gevinst og offset-værdier, kan testes systematisk for at fastslå en række parametre, der minimerer gennemblødning. Når et sæt af parametre, der er etableret, er det kritisk at vurdere, om billedbehandling giver stærke afsløring af fluorescens signal når spheroplasts eller protoplasts mærket med både peptid og membran farvestof er udnyttet. Gennem denne tilgang etableret vi med succes imaging parametre, der minimeret effekten af gennemblødning mens maksimering fluorescens påvisning af FITC-mærket AMP og membranen farvestof di-8-ANEPPS. Specifikt, vi fandt, at bløder-gennem emission fra membran farvestof i peptid kanal blev minimeret ved hjælp af emission bølgelængde intervaller af 499-532 nm (peptid) og 670-745 nm (membran), og når gevinsten blev justeret til at være ≤800 volt (V) (peptid) og ≤900 V (membran) og forskydningen blev justeret til ≤-10.0% (peptid, membran).

Selvom vi fokuserer på E. coli og B. megaterium, kunne de præsenterede protokoller tilpasses producere spheroplasts eller protoplasts fra mange forskellige bakteriestammer. For eksempel, vi har været i stand til med held producere Bacillus subtilis protoplasts, der var 1-2 µm i diameter ved hjælp af den protokol, der er skitseret i afsnit 4, og tilpasninger af protokollen kunne gøres for at optimere yderligere størrelse. Evnen til at iagttage peptid lokalisering mønstre i både gram-negative og gram-positive bakterier er særlig nyttig for studiet af ampere, fordi forskelle i strukturen cellevæg mellem disse to klasser af bakterier kan påvirke, hvordan ampere interagerer med cellemembranerne. Men mange imaging studier af ampere til dato har udelukkende fokuseret på model E. coli stammer, og dermed, kan ikke afspejle opførsel af peptider med gram-positive bakteriestammer.

Spheroplasts og protoplasts afviger fra normale bakterier, især i deres mangel på en ydre cellevæg, og derfor kan ikke være gode modeller for alle eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, har den ydre membran af gram-negative bakterier vist sig at fungere som en molekylær si for større molekyler29. Større peptider, derfor kan være i stand til translocate i spheroplasts, når de ikke ville gøre det i normale bakterier. Derudover ikke kan detaljerede undersøgelser af interaktionen mellem AMP med bakterier cellevæg, ydre membran og cytoplasmatisk membran udføres ved hjælp af spheroplasts og protoplasts. For eksempel, har de seneste arbejde fra Weisshaar Lab udnyttet imaging for at bemærke peptid mere præcise holdninger i CM15 og melittin mekanismerne i aktion30,31. Men vores tilgang, som beskrevet her, kræver ikke implementering af mikrofluidik til mikroskopi instrumentering for at opnå den nødvendige opløsning31. Selv om tidligere arbejde har vist, at spheroplasts er levedygtige21,32, har de ikke desto mindre sandsynligt nogle metaboliske og fysiologiske forskelle fra "normal" bakterier, der potentielt kan ændre membran interaktioner i nogle tilfælde. Desuden, fordi vi ikke har vurderet levedygtigheden af spheroplast populationer, kan man skelne mellem et peptid, der let kan translocate på tværs af cellemembranen af en levende celle versus et peptid, der kan kun translocate på tværs af et dødt eller døende celle. Trods disse forskelle, har vi set lokalisering mønstre i E. coli spheroplasts for mange ampere, som er i overensstemmelse med kendte mekanismer i aktion15, og vores resultater for BF2 P11A med B. megaterium protoplasts præsenteres her synes konsekvent med andre observationer for at peptid13,27,28. Membran kompositioner af spheroplasts og protoplasts er også helt sikkert mere fysiologisk relevante end de typiske blandinger anvendes i andre modelsystemer som lipid vesikler. I Resumé, får forbedret opløsning og lethed af imaging som spheroplasts og protoplasts, tror vi, de er nyttige modeller til at visualisere membran overfladeaktive stoffer, såsom ampere, i en række af bakteriestammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter er erklæret.

Acknowledgments

Forskning blev støttet af National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIH-NIAID) award R15AI079685.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl) Sigma T3253
Trizma base (Tris OH) Sigma T1503
Magnesium chloride Sigma M8266
Sucrose Sigma S7903
Lysozyme Sigma L6876
Deoxyribonuclease I Sigma D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma 106361 Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate Sigma C4895
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
BBL Trypticase soy broth Fisher Scientific B11768
BF2 P11A FITC NeoScientific Custom ordered
di-8-ANEPPS Biotium 61012
DMSO Sigma 34869 Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid Sigma M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane Pall Corporation 4192
Laser scanning confocal microscope Leica Microsystems TCS SP5 II For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Leica Microsystems For image processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20, (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24, (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19, (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80, (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8, (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4, (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40, (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838, (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29, (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9, (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818, (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60, (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39, (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4, (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107, (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25, (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111, (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32, (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39, (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128, (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114, (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819, (1), (1985).
Produktion og visualisering af bakterielle Spheroplasts og Protoplasts til at karakterisere antimikrobielle peptid lokalisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).More

Figueroa, D. M., Wade, H. M., Montales, K. P., Elmore, D. E., Darling, L. E. O. Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization. J. Vis. Exp. (138), e57904, doi:10.3791/57904 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter