Summary
Syntesen af polyamine-baseret peptid amphiphiles (elkøbsaftalerne) er en betydelig udfordring på grund af tilstedeværelsen af flere Amin nitrogens, som kræver fornuftig anvendelse for at beskytte grupper for at maskere disse reaktive funktionaliteter. I dette papir beskriver vi en letkøbt metode til forberedelse af disse nye klasse af selvsamlende molekyler.
Abstract
Polyamine-baserede peptid Amphiphiles (elkøbsaftalerne) er en ny klasse af selvsamlende amphiphilic biomaterialer-relateret til peptid amphiphiles (PAs). Traditionelle PAs besidder opladet aminosyrer som solubilizing grupper (lysin, arginin), som er direkte forbundet til et lipid segment eller kan indeholde en linker region af neutrale aminosyrer. Tuning peptid sekvens af PAs kan give forskellige morfologier. Ligeledes elkøbsaftalerne besidder en hydrofobe segment og neutrale aminosyrer, men også indeholder polyamine molekyler som vand solubilizing (hydrofile) grupper. Som er tilfældet med PAs, kan elkøbsaftalerne Self også samles til forskellige morfologier, herunder små stænger, snoet nano-bånd og sammenvokset nano-sheets, når opløst i vand. Men tilstedeværelsen af både primære og sekundære aminer på en enkelt polyamine molekyle udgør en betydelig udfordring når syntese elkøbsaftalerne. I dette papir viser vi en enkel protokol, baseret på litteratur fortilfælde, at opnå en letkøbt syntese af elkøbsaftalerne ved hjælp af faste fase faststadie peptidsyntese (SPP'ER). Denne protokol kan udvides til syntese af PAs og andre tilsvarende systemer. Vi også illustrere de trin, der er nødvendige for kavalergang fra harpiks, identifikation og rensning.
Introduction
Selvsamlende peptid amphiphiles (PAs) er en klasse af biomaterialer typisk består af følgende segmenter: (a) hydrofile hoved, (b) linker region og c hydrofobe hale. De fleste PAs beskrevet i litteraturen besidder en hydrofil hoved består af ladede eller polar aminosyre rester1,2,3,4. PAs har fundet en bred vifte af applikationer i biomedicin herunder medicinafgivelse, sygdom diagnostik og regenerativ medicin etc.5. Baseret på deres aminosyresekvens, kan PAs danne en bred vifte af nanostrukturer herunder sfæriske micelles og nano-filamenter. Vi har for nylig rapporteret en klasse af hybrid polyamine-baserede peptid amphiphiles, betegnes elkøbsaftalerne6. Morfologier, selvsamlende kinetik og metaboliske nedbrydning af disse biomaterialer, fandtes at være relateret til deres solubilizing hoved gruppe. Derudover udviste PPA nanostrukturer ikke toksicitet mod pattedyrceller (MiaPaCa2 og HeLa celler linjer) på de testede koncentrationer. PPA-baserede nanocarriers er attraktive medicinafgivelse køretøjer fordi: (1) polyamine udbredelse og metabolisme har vist sig at være steget i kræftceller, (2) kationiske nanostrukturer kan opnå endosomal undslippe7,8, hvilket fører til højere omsætning og bopæl inden for en celle, og (3) de skal have en særskilt metaboliske profil sammenlignet med PA; for eksempel, de bliver mere stabile mod proteaser findes i den menneskelige krop (selv om de måske følsomme andre enzymer, som Amin oxidases)9,10. Også, elkøbsaftalerne har vist sig for at have forskellige morfologier, fysisk-kemiske egenskaber, nanopartikel stivhed og forsamling kinetik længde og beregning af individuelle PPA molekyle6. Heri, beskriver vi en detaljeret protokol for syntese, identifikation og rensning af elkøbsaftaler, der også kan anvendes til forberedelse af PAs eller lignende hybrid peptid molekyler.
Fordi polyaminer ikke er almindeligt kommercielt tilgængelige i deres beskyttede former, og fordi at beskytte de primære og sekundære aminer i polyaminer er af allerstørste betydning for de tråddannende dem med aminosyrer og andre molekyler, vi har skitseret den syntetisk skridt til at opnå deres beskyttelse. Det overordnede mål med denne protokol er at give en enkel metode til de tråddannende polyaminer til aminosyrer. Polyaminer mangler en carboxylic gruppe; således, de kan ikke være koblet til Rink akrylamid eller Wang harpiks. I stedet, harpiks såsom 2-chlorotrityl chlorid anbefales syntetisk protokollen. Den største udfordring for PPA syntese er tilstedeværelsen af primær og sekundær Amin funktionelle grupper. Til vores formål beskyttet vi alle de sekundære aminer i polyamine mens du holder den primære amino gruppe på polyamine gratis at give koblingen reaktion. Reaktionen var gjort på en solid støtte efter principperne for faste fase faststadie peptidsyntese (SPP'ER) til at lette det arbejde op efter hver kobling og deprotection trin. Følgende protokol er for både manuel og automatiseret syntese af elkøbsaftalerne (selv om verifikation af nogle trin vil være en udfordring i et automatiseret system). Syntesen af disse molekyler kan også udføres på en automatiseret synthesizer eller ved hjælp af en mikrobølgeovn reaktor (automatiske eller halvautomatiske). Ordningen reaktionen har summeret i figur 1.
Figur 1: (A) A generelle reaktion ordningen for syntese af aftalerne. (B) repræsentative polyaminer, der kan bruges til syntetiseret elkøbsaftalerne beskrevet her. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generel protokol for syntese af aftalerne
- Beregne omfanget af syntese (normalt mmol). Denne skala er baseret på massen af PPA målbeløbet. Holde inde indre at reaktion effektiviteten af SPP'ER aftager gradvist med forhøjelse af aminosyresekvens. Den præcise reaktion effektivitet er derfor vanskeligt at beregne.
- Beregn vægten af harpiks efter indlæsning af harpiks. Lastning er fundet på beholderen eller analyse-protokollen af harpiks og udtrykt i mmol/g. Følgende formel kan bruges til at beregne vægten af harpiks:
- Omhyggeligt afvejes 2-chlorotrityl chlorid harpiks (i vores tilfælde lastning er ~0.85 mmol)
- Placer harpiks i en fritted syntese fartøj med følgende specifikationer: kapaciteten – 50 mL, Fritted Disc – 25 mm, porøsitet-Medium.
- Tilsættes 15 mL dichlormethan (DCM) til harpiks.
- Anbringer syntese fartøj til en variabel hastighed omrøreren (kolbe shaker/omrører), og drej fartøjer til en 45° vinkel (eller vandret) for at maksimere agitation.
- Tillad resin perler til at svulme op i 15 min. hævelse øger udbyttet af reaktion fordi det letter molekylære diffusion og tilgængelighed til det aktive sted, forbedrer effektiviteten af kobling.
- Tilføje 8 ækvivalenter (2 mmol for en 0,25 mmol skala) af den ønskede polyamine (Spermin, Spermidine, Diethyelenetriamine, 1,3-diaminopropane, etc.) til harpiks, og lad det reagere i 5 h.
Bemærk: En mindre reaktion periode vil reducere udbyttet. - En Kaiser gør test (Se Tabel af materialer) for at bekræfte vellykket kobling af polyamine til harpiks. Vellykket kobling af de primære aminer udbytter en violet/blå farve, der svarer til den gratis Amin.
- Beskytte den primære Amin gruppe ved hjælp af 4 ækvivalenter af 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), opløst i vandfri methanol (15 mL), ved at ryste reaktion blanding overnight11.
Bemærk: En mindre reaktionstid reducerer udbyttet. - Udføre en Kaiser test. Fravær af blå farve fra harpiks perle bekræfter vellykket beskyttelse. I tilfælde af forgæves beskyttelse af primære Amin, Gentag det forrige trin.
- Dræn DCM og vaske harpiks to gange med en blanding af DCM og DMF (2:1, 15 mL).
- Opløses 20 ækvivalenter (5 mmol) af di-tert-butyl di-karbonat (Boc) i DCM (20 mL), og reaktionen på Fortsæt til 3 h.
- Gøre en chloranil test (Se Tabel af materialer) for at bekræfte fuldstændig beskyttelse af sekundær Amin. En positiv test (beskyttelse) giver en farveløs eller lys gul farve. Gratis sekundære aminer give en mørk grøn/blå farve, mens primær aminer give en rød farve.
- Dræn opløsningsmiddel blandingen og vaskes to gange med en blanding af DCM og DMF (2:1, 15 mL).
- Tilføje en 2% opløsning af hydrazin i DMF (10 mL) og omrystes i 1 h.
- En Kaiser gør test for at bekræfte vellykket deprotection af primære Amin.
-
Tilføj de ønskede aminosyrer i den omvendte rækkefølge som du ville skrive/tegne dem. Peptider er trukket fra N termini til C termini men er syntetiseret i den modsatte retning, C til N. For eksempel, for en PPA kræver det følgende peptid core - GLFD-, tilføje aspartinsyre (D), efterfulgt af fenylalanin (F), leucin (L), og endelig glycin (G).
Bemærk: For de fleste aminosyrer, den følgende kobling cocktail er passende for udlæg til polyamine indlæst harpiks.- Bland 4 ækvivalenter (1 mmol) af aminosyre Fmoc-beskyttet, 3,95 ækvivalenter af 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) og 15 ækvivalenter af diisopropylethyl Amin (DIPEA).
- Opløse dem i en blanding af DCM og DMF (1:1, 15 mL) og sonikeres cocktail for 2 min (indtil fuldstændig opløsning).
- Vente en yderligere 3-5 min for at sikre, at aktivering af carboxylsyre på aminosyren.
- Tilføje reaktionsblandingen til fartøjet. Udføre reaktion i 2-4 timer ved stuetemperatur.
Bemærk: Vi har fundet følgende som effektive alternativer til HBTU (normalt kræver lavere mængder af aminosyrer og kobling agent): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima. - En Kaiser gør test for at bekræfte vellykket kobling.
- At beskytte Fmoc-gruppe fra aminosyren ved at tilføje en 20% opløsning af 4-methyl Piperidin (10 mL) i DMF. Gøre det to gange, hver gang ryster reaktionsblandingen i 15 min.
Bemærk: Et effektivt alternativ til Fmoc fjernelse er piperazin/DBU12.- Udføre en DCM (15 mL) vask mellem tilføjelser.
- En Kaiser gør test for at bekræfte vellykket nedtrapning beskyttelse af aminosyren.
- Vask harpiks grundigt for at fjerne alle spor af 4-methyl. Vaske harpiks to gange med DMF (10 mL), hver vask, varede i 5 min, og endelig med DCM (10 mL) i 10 min.
- Tilføj alle de øvrige aminosyrer ved successivt gentage koblingen og nedtrapning beskyttelse trin.
-
Endelig, efter kobling alle de nødvendige aminosyrer, konjugerede hydrofobe halen til den sidste aminosyre i polyamine-peptid konstruktion:
- Tilføje 10 ækvivalenter af de ønskede carboxylsyre funktionalitet til 9,5 ækvivalenter af HBTU og 12 ækvivalenter af DIPEA opløst i DCM og DMF blanding (1:1, 20 mL).
Bemærk: Husk på, end nogle haler muligvis en anden del af opløsningsmiddel (normalt en større % af DCM) eller tilsætning eller et andet opløsningsmiddel som N-methylpyrrolidone (NMP). - Der sonikeres cocktail for 5-10 min indtil opløsning (vi har set det tager længere tid for hale opløses fuldstændigt) og tilføje til fartøjet.
Bemærk: For haler indeholder flere reaktive steder, de skal beskyttes inden kobling dem. - Udføre denne reaktion (kobling hydrofobe halen) for mindst 5 h, selv om det er tilrådeligt at foretage natten for det størst mulige udbytte.
- Tilføje 10 ækvivalenter af de ønskede carboxylsyre funktionalitet til 9,5 ækvivalenter af HBTU og 12 ækvivalenter af DIPEA opløst i DCM og DMF blanding (1:1, 20 mL).
2. PPA kavalergang fra Solid støtte
Formålet med dette trin er kløvningen af PPA fra harpiks og fjerne Boc beskytte grupper fra aminosyrer og polyamine rester.
- Vask harpiks med DMF (8 mL for 2 min) og to gange med DCM (8 mL, hver gang i 5 min). Før hver tilsætning, dræne opløsningsmidlet fra fartøjet. Når den sidste vask udføres, tørre harpiks under vakuum i 15 min.
- Forberede kavalergang løsning ved hjælp af følgende blanding forholdet: 28:1:1 trifluoreddikesyre (TFA): H2O: Triisopropyl silan (TIPS). At gøre 15 mL kavalergang cocktail 14 mL TFA, tilsættes til 0,5 mL H2O og 0,5 mL af TIPS.
- Tilføj denne kavalergang løsning til harpiks og ryste i 2-4 timer ved stuetemperatur.
- Indsamle opløsning i en 25 eller 50 mL rund bund kolbe.
- Koncentrere sig i TFA i vakuum til 1-2 mL ved hjælp af en rotationsfordamper ved reduceret tryk samtidig varme blanding ved 40 ° C (ikke overgå 55 ° C for at undgå nedbrydning af PPA).
- Efter fordampning, tilføje den opnåede TFA løsning (dråbevis) til en rund bund kolbe indeholdende vandfri kolde ether (15 mL). Dette vil straks udfælde PPA.
- Derudover tilføje vandfri kolde ether (5 mL) original kolben hvor TFA var koncentreret.
- Der sonikeres denne kolbe for at inddrive yderligere legemer og kombinere med ether løsning fra trin 2.6.
Bemærk: Den overdragende pipette kan vaskes med en lille mængde af DCM. Undgå at indføre DMF under processen, fordi det har en tendens til at danne en gel-lignende stof. - Kolben anbringes (dækket) inde i køleskabet og lad det stå natten over til at maksimere nedbør.
- Indsamle de udfældede materiale af vakuum filtrering ved hjælp af et sintret disc filter tragt. De ideelle pore størrelser er bøde eller medium.
- Bundfaldet to gange med koldt ether (5-10 mL) til at fjerne enhver resterende organics.
3. identifikation af rå produktet ved hjælp af MALDI tørret-slip-metoden
-
Matrix forberedelse til analyse i positiv tilstand:
- For at starte molekylvægt analyse ved hjælp af Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) massespektrometri, tilføje 10-20 mg af α-cyano-4-hydroxycinnamic syre til et microcentrifuge rør.
- Tilføje en opløsning af vand/acetonitril (1:1, 1,0 mL) med 0,1% trifluoreddikesyre (TFA). Blandes grundigt ved vortexing.
Bemærk: Denne matrix skal bruges til positivt ladede peptider. MALDI negative tilstand er lignende, men kræver en matrix, der indeholder 9-aminoacridine med 0,1% ammoniak som opløsningsmiddel tilsætningsstof. - Tilføje 1-2 µL af prøven til rustfrit stål mål plade for MALDI og tør prøve i luften. Tilføje 1-2 µL af matrixen og tørre det igen.
Bemærk: Pladerne har cirkulære markeringer inddelte langs target plade for at finde det pågældende sted.
- Analysere prøverne i MALDI instrument til at bekræfte deres identitet. Electrospray Ionisation (ESI) er et gyldigt alternativ til at bekræfte identiteten af aftalerne.
4. rensning af elkøbsaftalerne ved hjælp af forberedende omvendt-fase højtydende væskekromatografi (HPLC) rensning
-
Bundfaldet PPA oploeses i et minimum af acetonitril og vand.
- Som en tommelfingerregel, 100 mg af tørre rå PPA i mindre end 5 mL acetonitril og vand opløses. Flere hydrofobe elkøbsaftalerne kan kræve en større procentdel af acetonitril til at opløse og kan også kræve en større volumen af opløsningsmiddel i almindelighed, afhængigt af den netto beregning af aftalerne (tabel 1).
- Hvis komplet opløsning ikke finde sted, tilsættes 1% TFA (ACN eller H2O). Det er også muligt at tilføje spormængder af andre kompatible opløsningsmidler, herunder dimethylsulfoxide, methanol eller isopropanol (begrænse deres indhold til 5%).
| Opløsningsmiddel | Positivt ladede elkøbsaftalerne | Negativt ladede elkøbsaftalerne | ||
| 0,1% TFA i vand | 0,1% NH3 i vand | |||
| 0,1% TFA i ACN | 0,1% NH3 i ACN | |||
Tabel 1: opløsningsmiddel systemer. Foreslået opløsningsmiddel system for positivt og negativt opkrævet elkøbsaftalerne.
- Der sonikeres LBPF bruger en horn sonikator i 20 min. på 10 s pulser med Amp1 på 48% eller i 2-3 timer i et ultralydsbad.
-
Derefter filtreres ved hjælp af en 0,45 μm sprøjte filter efterfulgt af filtrering ved hjælp af en 0,20 μm polytetrafluorethylen (PTFE) sprøjte filter. PPA løsningen bør være klar og gratis af alle partikler materialer.
- Hvis filtrering er også vanskeligt, Rens med ultralyd i en længere periode. Det tilrådes stærkt, at PPA løsningen er renset umiddelbart efter sprøjten filtrering, som langvarig opbevaring kan få det til at samle eller gelate, som vil nødvendiggøre re ultralydbehandling og måske re filtrering.
- Under og efter rensning, bruge enten HPLC grade opløsningsmidler eller dem, der er filtreret gennem en 0,25 μm sprøjte filter/membran.
Bemærk: De mest almindelige opløsningsmidler betingelser til at rense elkøbsaftalerne består i et forløb af H2O og ACN. - Brug en standard omvendt-fase HPLC instrument for denne protokol. Det bør omfatte en eluering gradient programmør, en binær opløsningsmiddel levering system, en UV-detektor kan påvise på 220 og 254 nm og en programmerbar brøkdel collector. Den maksimale flow bør være 50 mL/min.
- Brug en C-18 omvendt fase kolonne for adskillelse. Kolonner med følgende dimensioner kan bruges afhængig af massen af solid bliver renset og nettet opkræve af PPA (tabel 2).
| PPA afgift | Partikelstørrelse | Kolonnen størrelse | Massen af rå PPA |
| + ve ladede | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| -ve ladede | 5 μm | 150 x 30 mm | 170 mg |
| + ve ladede | 5 μm | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
| -ve ladede | 5 μm | 150 x 21,2 mm | 90 mg |
Tabel 2: foreslog kolonner: Kolonnedimensioner, partikelstørrelser og den maksimale bæreevne pr. injektion for C18 omvendt fase HPLC søjler
- Injicere PPA med et volumen bestemmes af af kolonnen kapacitet og af mængden af injektion loop af HPLC. Køre metoden HPLC gradient ifølge indstillingerne ses i tabel 3 (eluering tid på 40 min).
| Tid | Opløsningsmiddel (acetonitril) | Opløsningsmiddel B (vand) | Strømningshastighed (mL/min) |
| 0 | 5% | 95% | Strømningshastigheden afhænger kolonne pakning og dens størrelse. |
| 2 | 5% | 95% | |
| 35 | 95% | 5% | |
| 38 | 100% | 0% | |
| 40 | 5% | 95% |
Tabel 3: vejledende forløb: Foreslåede omvendt fase forløb viser den relative sammensætning af vand vs acetonitril over en periode. Strømningshastigheden vil afhænge af kolonne specifikationer.
-
Analysere de brøkdele, der er indsamlet på forskellige reagensglas bruger MALDI og fastslå, hvilke rør (eller rør) indeholder PPA. Dette vurderes ved at undersøge molekylvægt fundet i hver tube.
- Check af fraktioner på en analytisk HPLC renhed. HPLC-gradient systemer udstyret med en UV-detektor indstillet på 220 nm.
- Hvis der er urenheder, gør en yderligere cyklus af rensning af HPLC. Den ovenstående graduering, der benyttes til forberedende HPLC kan skaleres til brug med den analytiske HPLC ved hjælp af kolonnen omformer online software. Hver fraktion være meget ≥95% ren for fysiske karakteristika eller biologisk vurdering.
- Indsamle fraktioner i en stor rundbundet kolbe eller fordampning kolbe og fjerne alle acetonitril og det meste af vandet. Den endelige PPA løsning bør være mere end 10 mL.
- Overføre denne koncentrat til en 50 mL-centrifugerør. Opmærksom på, at elkøbsaftalerne er vaskemiddel-lignende stoffer; således vil blive genereret bobler under fordampning af opløsningsmidlet. Vi har fundet, at tilsætning af landbrugsethanol mindsker boble dannelse.
- Vakuum koncentrat koncentrat. Under vakuum fordampningen, kan en stor mængde af LBPF overholde væggene i beholderen. Genoprette dette ved gentagne gange skylning kolbens væg med HPLC vand. Den kombinerede mængde af koncentreret PPA og den rinsate bør ikke mere end 30 mL.
- Placer den vandige opløsning inde i en 50 mL tube.
-
Flash fryse denne PPA løsning i flydende kvælstof:
Bemærk: Flash indefrysning resultater i mindre iskrystaller, som vil sublime hurtigere i lyophilizer. Desuden kan langsommere frysning tillade dannelsen af selvsamlede Supramolekylær strukturer. En anden alternativ (men mindre ønskværdige) er gradvist fryse i et-80 ° C fryser eller at fryse ved hjælp af en tøris + acetone blanding- Før du placerer centrifugeglasset i lyophilizer, perforere eller løsne hætten af rør til at tillade fugt at undslippe prøven og få indsamlet i køleanlægget. Indstille ingot enheden indstillet til-54 ° C og 0,016 mbar.
Bemærk: En anden mulighed er at fjerne hætten og placere en tørre (med en elastik) oven på åbningen. Også, har vi fundet at frysning prøver i en vinkel eller bryde isen i små portioner giver mulighed for en hurtigere og bedre ingot skyldes en stigning i areal. - Hvis fast begynder at smelte, kan dette angive spor af et organisk opløsningsmiddel (Normalt acetonitril) er til stede. Gentag trinnet frysning og vurdere tilstanden af ingot.
- Hvis den smeltende fortsætter, er der to mulige løsninger:
- Split prøven i to portioner (til at være placeret i rør), fortyndes med vand, og fryse igen. Brug ikke denne løsning ofte, fordi store mængder organiske opløsningsmidler kan beskadige udstyr.
- Alternativt, prøven anbringes i en kolbe og yderligere fordampe de organisk opløsningsmiddel under vakuum. Lyophilizing en stikprøve, der er i flydende form som regel fører til bumpe og tab af PPA sammensatte.
- Før du placerer centrifugeglasset i lyophilizer, perforere eller løsne hætten af rør til at tillade fugt at undslippe prøven og få indsamlet i køleanlægget. Indstille ingot enheden indstillet til-54 ° C og 0,016 mbar.
5. opbevaring af aftalerne
- Gemme aftalerne i en-20 ° C med caps strammes og forseglet med Parafilm på et rør med en passende etiket.
- Før brug, bringe PPA tilbage til stuetemperatur i en vakuumkammer til at undgå kondensation af vanddamp på aftalerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter syntese og rensning og før fysisk-kemiske eller biologiske vurdering anbefales masserne af aftalerne er igen kontrolleret og renheden opgøres ved hjælp af analytisk HPLC. For materiale karakterisering eller biologisk vurdering, elkøbsaftalerne skal have en renhed af > 95%. Figur 2 viser HPLC trace (øverst) og MALDI spektre (nederst) bekræfter tilstedeværelsen af produktet. HPLC analytiske systemer vil integrere arealet under kurven (AUC) og en AUC > 95% kan være relateret til produktets renhed. I UV-baserede HPLC systemer, forvente at se en enkelt, skarpe toppe. MALDI spectra skal svarer til den beregnede molekylvægt af PPA inden for ±1 Da (afhængigt af tilstanden af analyse af MALDI).
Den samlesæt PPA'ernes ophør kan visualiseres og analyseres ved hjælp af utallige teknikker, herunder transmissions elektronmikroskopi (TEM) (figur 3A, B), Atomic Force mikroskopi (AFM) (figur 3 c, D), lille vinkel X-ray Spredning (SAXSA), Scanning elektronmikroskopi (SEM) og dynamisk lys spredning (DLS). Vellykket vil samlesæt resultere i veldefinerede nanostrukturer i både AFM og TEM. Manglende selv samle vil enten resultere i dannelsen af uregelmæssige aggregater, der er flere hundrede nanometer i størrelse.
Figur 2: Repræsentant analytisk HPLC kromatogrammet (øverst) og MALDI spektrum (bund) af PPA C16V2en2Spermin. Dette tal er blevet ændret fra Samad et al. 20176; genbrugt med tilladelse af John Wiley & Sons, 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant transmissions-elektronmikroskop (TEM) Mikrograf. (A) TEM billede viser dannelsen af nanofiber og sammenvoksede nanosheets, (B) Magnified inset viser dannelsen af bundtet nano-sheets, (C) Atomic force mikroskopi (AFM) Mikrograf, (D) og højde kort stammer fra den Mikrograf for C16V2en2KDiethyelenetriamine. (D) X og Y akser repræsenterer nano-ark bredde og nano-ark højde henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Samad et al. 20176; genbrugt med tilladelse af John Wiley & Sons, 2018. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoller er beskrevet her kan bruges til at syntetisere elkøbsaftalerne, som brønde som PAs og relateret peptid-baserede molekyler (såsom hybrid PA-peptoids). Selv om syntesen af peptider ved hjælp af SPP'ER er en enkel procedure, kan syntesen af peptider der indeholder biologiske homing molekyler være særligt udfordrende. Polyaminer som Spermin, spermidine, diethyelenetriamine, osv., kan fungere som målsøgende molekyler til at målrette kræft celler13. Aftalerne kan selv samle til nanostrukturer med forskellige morfologier6. Deres positive ladning kan også støtte med længere omsætning tid (på grund af endosomal flugt) og en anden metabolisk profil (sammenlignet med traditionelle PA). Dog kan syntese elkøbsaftalerne og deres analoger være en særlig udfordring på grund af tilstedeværelsen af primære og sekundære aminer. Den præsenteres syntetiske strategi overvinder denne udfordring af rationel anvendelse af ortogonale beskytte gruppe. DDE-molekyle gennemgår selektivt reaktion kun med primære aminer11. BOC, på den anden side reagerer ukritisk med både primære og sekundære aminer, og derfor kan kun tilføjes efter den primære Amin er beskyttet. Vi vil gerne nævne, at andre at beskytte grupper kan bruges i stedet for Boc. For eksempel, vil reaktion med eddikesyreanhydrid permanent acetylate de sekundære aminer (denne gruppe ikke vil blive fjernet under kavalergang). Ligeledes vil brugen af trifluoacetic eddikesyreanhydrid give en base-følsomme beskyttelse, mens benzylcarbamate vil give en gruppe, der kan fjernes af H2/Ni14. Når polyaminer er beskyttet efter behov, kan syntesen af LBPF fortsætte ved hjælp af standard SPP'ER. Koblingen hydrofobe halen til resten af polyamine-peptid konstruktion ikke kun tager længere tid at par, men også kræver kindtand dobbelte af aminosyrer. Nogle af de hydrofobe haler kan ikke opløses godt ved stuetemperatur i nogle traditionelle opløsningsmidler eller kan udfældes selv efter oprindelige opløsning. Sådanne reaktioner er bedst udføres under mild varme (40 ° C) ved at overføre alle reaktanter for at afrunde bunden kolbe. Alternativt, en dobbeltvægget synthesizer fartøj kan bruges til at holde reaktanter varme i hele reaktionen. Hvis det er tilgængeligt, kan en mikrobølgeovn synthesizer støtte med kobling15.
Selvom mange former for masse spektroskopi er tilgængelige til at bestemme massen af elkøbsaftaler, brugte vi MALDI spektroskopi med henblik på vores identifikation. Vi har fundet MALDI for at være mere effektiv i at producere molekylarionen toppe, minimere fragmentering og addukt dannelse. MALDI skal programmeres til at generere en ion, der svarer til den mest sandsynlige ionisering stat i LBPF. Udover enhedsinstrument til at producere ion af en særlig afgift, nødt vi også til at kombinere prøverne med den relevante matrix, der er egnet til den tilstand, vi vil bruge.
PAs har ofte en tendens til at danne salt adukter på MALDI plade. Dette problem ses oftere med negativt ladede molekyler. De mest almindelige salte er dem af natrium (Na+ = 23 Da) og kalium (K+ = 39 Da). Disse adukter maj være undertrykt ved at tilføje 1-2 µL af eddikesyre. Aftalerne giver normalt H+ addukt. Det anbefales kun at bruge nanopore vand eller HPLC vand hele syntetiske og rensningsproces for at undgå indførelsen af yderligere ioner. Borsilikatglas containere og reaktion fartøjer kan indeholde betydelige mængder af natriumioner, der vil sive ned i det endelige produkt. Skyl glasvarer omhyggeligt ved hjælp af nanopurewater for den sidste vask.
At identificere molekylarionen toppe bliver også svært, hvis matrix løsning ikke er fuldt mættet med solid matrix. For at sikre mætning, bør der altid være en lille mængde af solidt matrix ikke har solubilized.
Som en sidste bemærkning, kan du overveje at nogle elkøbsaftalerne eller PAs ikke kan danne nogen bundfaldet ved tilsætning af æter. Dette blev hovedsagelig observeret i de mere hydrofile elkøbsaftalerne. I sådanne arrangementer, vil vi først fordampe alle ether, neutralisere den overskydende TFA med NH4OH og tilsæt vand og acetonitril (med 0,1% TFA eller NH4OH) for at fuldt ud solubilize det og derefter gå videre til at rense som sædvanlig.
Protokollen beskrevet her kan bruges til at syntetisere meget ren varianter af selvstændige montage polyamine baseret peptid amphiphiles (elkøbsaftalerne) og også PAs. Fremgangsmà ¥ den ortogonale beskyttelse/deprotection kan bruges i andre situationer, der kræver selektiv maskering af primære og sekundære amine grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har nogen interessekonflikt at erklære
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret ved University of Nebraska Medical Center (opstart midler, MC-S); NIH-COBRE, 5P20GM103480 (T. Bronich) og American Chemical Society, PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R.
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , Springer. 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A. Jr, Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. Protection for the Amino Group. In Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. , John Wiley &, Sons, Inc. 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
