Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

En Microphysiologic plattform for menneskelig fett: klemt hvit fettvev

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Hvit fettvev (WAT) har kritiske mangler i sin nåværende primære kultur modeller, hindre farmakologiske utvikling og metabolske studier. Her presenterer vi en protokoll for å produsere en adipose microphysiological system av sandwiching WAT mellom ark stromal celler. Denne konstruksjonen gir en stabil og tilpasses plattform for primære WAT kultur.

Abstract

Hvit fettvev (WAT) spiller en avgjørende rolle i å regulere vekt og daglig helse. Likevel er det betydelige begrensninger i tilgjengelige primære kultur modeller, som ikke har trofast recapitulate adipose microenvironment eller utvide WAT levedyktighet utover to uker. Mangelen på pålitelige primære kultur modell hindrer alvorlig WAT metabolisme og narkotika utvikling. Dette har vi benyttet NIHS standarder for et microphysiologic system for å utvikle en ny plattform for WAT primære kultur kalt "SWAT" (klemt hvit fettvev). Vi overvinne naturlig oppdriften i adipocytter av sandwiching hakket WAT klynger mellom ark av liggende under adipose-avledet stromal celler. I denne konstruksjonen er WAT prøvene levedyktig over åtte uker i kultur. SWAT opprettholder den intakt ECM, celle-til-celle kontakter og fysiske presset i vivo WAT forhold; i tillegg opprettholder SWAT en robust transcriptional profil, følsomhet for eksogene kjemiske signalene, og hele funksjon. SWAT representerer en enkel, reproduserbare og effektiv metode for primær adipose kultur. Muligens er det en bredt aktuelt plattform for forskning i WAT fysiologi, patofysiologi, metabolisme og farmasøytisk utvikling.

Introduction

Fettvev er den primære orgelet av fedme, som bærer direkte årlige medisinsk koster mellom $147 milliarder og $210 milliarder i US1. Akkumulering av fettvev bidrar også til andre vanlige dødsårsaker som hjertesykdom, type II diabetes og visse typer kreft2. In vitro kultur modeller er avgjørende for metabolske studier og narkotika utvikling, men dagens forskning modeller av fettvev har større mangler. Adipocytter er skjøre, spenstig, og uhelbredelig differensierte celler som ikke vil følge til celle kultur plast, og derfor kan ikke bli kultivert med konvensjonelle celle kultur metoder. Siden 1970 har flere metoder brukt i forsøk på å overvinne disse barrierene, inkludert bruk av glass coverslips, taket kultur, suspensjon kultur og ekstracellulære matriser3,4,5, 6 , 7. men disse metodene har vært preget av celledød og dedifferentiation, og de brukes vanligvis for ikke mer enn en to-ukers studie periode. Videre forsøk ikke disse modellene recapitulate den opprinnelige adipose microenvironment som de ikke holder intakt ECM, samspillet mellom adipocytter og stromal støtte celler, eller kontraktile styrker cellene øve på hverandre i i vivo WAT.

I fravær av en gull-standard primære adipose kultur metode, adipose forskning har støttet seg hovedsakelig på differensiert pre adipocytter (diffAds). DiffAds er multilocular, tilhenger og metabolically aktiv. Derimot primære hvit adipocytter er unilocular, nonadherent, og demonstrerer relativt lav metabolisme. Manglende gjeldende adipose kultur modeller recapitulate fysiologi av sunn modne fettvev er trolig en viktig faktor i fravær av FDA-godkjente som direkte mot adipocytter. Faktisk er mangel på fysiologiske i vitro orgel modeller et stort problem på de fleste organer og sykdom.

I sin posisjon papir annonsere opprettelsen av Microphysiological Systems (MPS) programmet, rapporterte National Institutes of Health (NIH) at 2013 suksessraten over alle farmasøytiske kliniske studier var bare 18% for fase II og 50% for fase III kliniske studier8. MPS-programmet er utviklet til direkte adresse russernes i vitro monokultur til modell menneskelige fysiologi. NIH definerer MPSs som kultur systemer består av menneskelig primær eller stamceller i flercellet 3D konstruksjoner som recapitulate orgel fungerer. I motsetning til reduksjonistiske modeller av homogen, udødeliggjort cellekulturer, bør MPSs nøyaktig modell celle-celle, narkotika-celle, stoff-stoff og orgel-narkotika interaksjoner9. I motsetning til kortsiktige primære kultur metoder tilsier NIH standarder MPS bærekraft over 4 uker i kultur8. Ytterligere detaljer om MPS programmet finnes på NIHS RFA (#RFA-TR-18-001)10.

Vi har utviklet en enkel, roman, tilpasningsdyktige, og billig adipose MPS kalt "klemt hvit fettvev" (SWAT)11. Vi overvinne naturlig oppdriften i adipocytter av "sandwiching" hakket primære fettvev mellom ark av liggende under adipose-avledet stromal celler (ADSCs) (figur 1). Den resulterende 3D konstruere viser celle-celle kontakten og den opprinnelige adipose microenvironment ved omgir moden adipocytter med en naturlig adipocyte støtte celle befolkning. SWAT er validert ved å demonstrere 8 ukers levedyktighet, svar på eksogene signalering, adipokine sekresjon og engraftment i en dyremodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle aktiviteter ble utført i overholdelse protokoller #8759 og #9189, som er godkjent av IRB Office av LSUHSC-NO. Alle dyr arbeidet ble utført i etterlevelse protokollen #3285 godkjent av IACUC kontoret i LSUHSC-nr.

1. såing av Sandwiching celle ark

Merk: Se figur 1.

  1. Frø ADSCs på ca 80% confluency i vev kultur plater (6 cm eller 6-vel plater). For hver brønn av SWAT ønsket, frø 1 konvensjonelle vev kultur godt og 1 godt av tilsvarende størrelse på poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-belagt vev kultur plast plate.
    Merk: Følgelig en 6-vel plate av SWAT krever seeding celler i en 6-og standard vev kultur plate (bakgrunnslaget) og en 6-og pNIPAAm-belagt vev kultur plate (øverste lag). pNIPAAm-belagte plater kan kjøpes kommersielt eller produsert i-lab12,13,14.
  2. Opprettholde ADSCs på 37 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS og 1 x Penicillin/Streptomycin. Endre media hver 2 dager.
  3. Tillate at celler koaliserer inntil de blir 100% confluent og ta på et striated mønster (ca 6-8 dager).
    Merk: Disse cellene må fungere som et intakt enkeltcelle ark for å stabilisere spenstig fettvev. Utilstrekkelig confluent celler vil fragmentere på frø med WAT.

2. forberedelse av SWAT forsyninger

  1. Forbered flere 10 mL dele av 1 x Hanks balansert Salt løsning (HBSS); forberede nok for ønsket antall plater med volum til overs.
  2. Forberede stempelet apparatet SWAT seeding. Konstruere stempelet bruker enkel akryl plast, består av en stamme som er knyttet til en runde disk. Sikre at den passer til omkretsen av vev kultur (diameter: < 6 cm for 6 cm rett, < 3,5 cm for 6-vel tallerken, omtrentlig masse: 6,7 g for en 6 cm rett, 5.1 g for en 6-vel plate).
    1. Forberede ekstra stempler å sikre at prosedyren vil kjøre glatt i tilfelle det er et problem med noen personlige stempelet.
    2. Vikle lab tape rundt kanten av stempelet disken, minst 2 x, å forhindre lekkasje av gelatin løsning.
    3. Spray biosikkerhet regjering (BSC) med 70% EtOH. Spray ned en 15 mL konisk tube rack inne BSC med tom, uncapped 15 mL konisk rør; rør vil beskytte plasseringen av gelatin stempler.
    4. Spray hver tape-innpakket stempelet grundig med 70% EtOH og Legg inn en 15mL konisk rør på stativet. Spray metall skiver (omtrentlig massen 6,3 g) og plassere dem på brettet med et par hekta pinsetter; skivene vil legge vekt på stempler under SWAT seeding.
    5. Lukk BSC sash og slå på UV lys å lette tørking og sterilisering.
      Merk: Ideelt utføre dette trinnet 24 timer før SWAT seeding. Eventuelt gjennomføre prosessen ved vev samling/SWAT frø; i dette tilfellet kan imidlertid 15 – 45 min for UV tørking/sterilisering.

3. forberedelse av Gelatin stempler-programmet til cellen øverst ark

  1. Varme et vannbad til 75 ° C.
  2. Forberede gelatin løsningen ved å legge til 0,75 g gelatin pulver 10 mL lager av 1 x HBSS. Under avtrekksvifte legge 100 µL av 1 M NaOH å balansere pH av løsningen.
    1. Legge til 10 mL aksjer i vannbad og rist kraftig hver 5 min til pulveret oppløses i løsningen. Mål å oppløse gelatin pulverisert snart etter å legge til oppvarmet vannbad.
    2. Slå på BSC blåser, slå av UV-lyset og øke rammen. Spray BSC overflaten og forberede filteret forsyninger (5 mL engangssprøyter med luer-lock og 0,2 µm sprøyte filtre). Forbered flere filtre å effektivt stamme tilstrekkelig mengder gelatin gjelder for stempler.
  3. Når gelatin løsningen når en homogen konsistens, filtrere løsningen og bruke det til stemplene. Legg i sprøyten med gelatin. Bruke gelatin plast stempler gjennom sprøyte filteret (~2.5 mL for en 6-vel plate, ~4.5 mL for en 6 cm rett) og la stivne (~ 20 min).
  4. Når gelatin er solid, pakke tapen fra kanten av stemplene. Med hekta pinsetter, fjerne gelatin fra ytterkanten av stempelet (dvs. de opphøyde kantene av meniscus). Kontroller at gjenværende gelatin i midten av stempelet er helt nivå å maksimere kontakt med ADSC ark.
  5. Når overflødige gelatin er fjernet, forsiktig gjelde gelatin stempler for pNIPAAm-belagt ADSC platene. Bruke metall skivene for å veie ned stempelet. Ikke skråstille celle ark mens du bruker stemplene.
  6. La stemplene på cellen arkene 1.5 h ved romtemperatur. Inkuber plater/stempler i en isen vannbad for 1,5 t å fullføre av cellen arket fra pNIPAAm-belagt tallerken overflaten.
    1. Forsiktig mens incubating inne isbadet; Tillat ikke isbadet forurense cellen media under inkubasjon.
    2. Etter inkubasjon, rengjøre bunnen av pNIPAAm-belagt plater å fjerne ikke-sterilt vann.

4. hvit fettvev behandling

  1. Når menneskelige fettvev fra operasjonsstuen, holde alle prøvene i sterilt beholder det er på isen til SWAT er å bli sådd. Legge til sterilt vedlikehold medier, for eksempel fosfat-bufret saltvann (PBS), fettvev beholder for vev stabilitet.
  2. Legge til kalde celle kultur medium til 1,5 mL microcentrifuge rør for hver brønn/rett skal seeded (100 µL for en 6-vel plate, 200 µL for en 6 cm rett).
  3. Hakke fettvev.
    1. For solid fettvev segmenter, gjør du som følger.
      1. Vask store deler av fettvev 3 x i sterilt PBS og fjerne PBS så mye som mulig.
      2. Grovt hakke vev med tang og sterile knivskarpe og fjerne så mye blodkar og konseptet som mulig (se diskusjon for flere detaljer).
      3. Fint hakke fett med barberhøvel hakket vev tar på tykke, flytende konsistens.
        Merk: Ideelt vev vises homogen med ingen synlige individuelle segmenter av WAT selv om dette ikke er alltid mulig.
    2. Behandle lipoaspirate som følger.
      1. Under BSC, tape sterilt gasbind over toppen av et beger og plassere denne kanne i en større kanne samle overflødig væske.
      2. Bruker en 25 mL serologisk pipette, trekke så mye lipoaspirate etter behov og bruke det på overflaten av sterilt gasbind. Bruke PBS direkte på denne overflaten til å vaske lipoaspirated fett og fjerne overflødig blod og lipid rester.
      3. Bruk tang til å gjenopprette drenert vev, overføre det til en steril hakking overflate og hakke på lipoaspirate.
  4. Bruk en steril barberhøvel for å kutte distale p1000 pipette-spisser overføre hakket vev; Dette vil minimere skjæring stress som kan føre til adipocyte lyse. Når en riktig vev konsistens er nådd overføre det ønskede volumet av hakket vev til hver 1,5 mL tube (300-400 µL for 6-vel tallerken, 500-600 µL for 6 cm rett). Bland hakket WAT og media kort i rørene.
  5. Ta base ADSC platene og Dekanter/leveringstanken media. Erstatte media med WAT/media blanding fra hver 1,5 mL tube.
    1. Forsiktig fjerne gelatin stempler fra pNIPAAm-belagt plater og bruke dem på WAT blandingen på base ADSC plater. Undersøk monolayer av pNIPAAm-belagt platene under et mikroskop for å bekrefte mobilnettet avdeling.
  6. Angi en varme blokk ca 37-40 ° C under BSC. Med stempler fortsatt på plass, kan du flytte platene varme blokkens overflaten. Legge til 2-3 mL varmet kultur medier å ruge cellene og tilrettelegge gelatin smelter.
  7. Etter ~ 30 min, Fjern stemplene fra tallerken overflaten. Erstatte lokkene av base vev kultur platene og flytter til en celle kultur inkubator. Når gelatin har helt flytende på 37 ° C, Sug opp og erstatte celle kultur medier.
  8. Opprettholde SWAT på 37 ° C og 5% CO2 i fenol red-fri M199 medium med 7 µM insulin, 30 µM deksametason, 1 x Penicillin/Streptomycin. Opprettholde i ca 2 mL medier for 6-vel plater og 3 mL for 6 cm retter. Endre media hver 2 dager.

5. SWAT Harvest

  1. Forberede collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM adenosin, i PBS) dele i 15 mL konisk rør (omtrentlig volum på 10 mL). Fryse rør og lagre dem på 20 ° C.
  2. Sug opp noen kultur medium fra celler, vaske 1 x med PBS og deretter Sug opp PBS. Prep collagenase dele av tiner dem i et 37 ° C vannbad.
    Merk: Ideelt collagenase løsningen vil nå 37 ° C; umiddelbart etterpå, legge til vev.
  3. Legge til alle vev fra SWAT platen i de personlige dele. Høste SWAT bruker en steril celle scrapper og overføre den til collagenase dele med cut-off p1000 pipette tips. Legge til vev direkte til 15 mL konisk rør som inneholder collagenase løsning.
    1. Alternativt ruge vev/collagenase blandingen i en 50 mL konisk rør; økt arealet vil ytterligere forenkle enzymatisk fordøyelsen.
  4. Plasser prøven rør i en inkubert orbital shaker i 45° vinkel. Ruge på 200 rpm, på 37 ° C i 30-60 minutter.
  5. Sted en 250 µm mikromaskefilteret inn i et nytt 15 mL konisk rør for samlingen. Hell fordøyd adipocyte løsningen gjennom filteret.
    Merk: Dette vil tillate alle celler passerer mens du filtrere ut fibrøst vev.
  6. Tillate gjennomflytsenhet å sitte i 5 minutter ved romtemperatur å tillate fase separasjon.
    Merk: Adipocytter flyter til toppen av løsningen mens adipose stromal cellene (ASCs) vil bosette seg i de lavere fasene. Sentrifugering i 5 min på 500 x g kan også maksimere celle separasjon eller innhøstingen rundt ADSCs i pellet.
  7. Bruke et cut-off p1000 pipette tips, overføre adipocytter (den flytende lag på toppen av collagenase løsning) til en 1,5 mL microcentrifuge samling rør. Tar ~ 250 µL samtidig, Pipetter sakte langs kanten av røret for å samle adipocytter.
    1. Rotere røret sakte mens samle adipocytter for å maksimere utvinningen av celler følge innsiden. Holde tegne flere celler til 1,5 mL microcentrifuge røret er full.
  8. Fjerne overflødig væske fra de isolerte adipocytter bruker en sprøyte som er knyttet til en nål (~ 21 G). Senk nålen under flytende adipocyte laget. Agitere nålen kort for å fjerne celler følge nål akselen, og deretter vente på forskyves adipocytter flyte til toppen.
  9. Sakte trekke overflødig væske, forsiktige for å unngå utilsiktet fjerning av adipocytter. Bruke microcentrifuge tube eksamener konsekvent isolere eksempel volumer (f.eks. 0,1 mL for hver prøve).
  10. Bruke isolert cellene for DNA/RNA utvinning, glukose opptaksanalyse, lipolyse analysen, osv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Levedyktigheten til SWAT ble først vurdert av føljetong brightfield tenkelig av enkelte WAT klynger (n = 12) omtrent 7,6 ukene. Klynger forble sikret på plass på monolayer gjennom hele denne perioden. Små morfologiske endringer ble observert med personlige adipocytter fordreining litt eller skiftende posisjoner. Imidlertid adipocytter bli verken multilocular over tid, som indikerer en mangel på dedifferentiation, eller gjorde de viser synlige celledød som mobilnettet blebbing, lyse eller fragmentering (figur 2). Adipocyte identiteten til klynger ble bekreftet på to uke gamle SWAT med lipid flekken Nilen rød (NR). Klart NR farging av unilocular adipocyte klynger indikerte at disse var faktisk adipocytter intakt membraner, snarere enn gjenstand, cyster eller død adipocytter. Fravær av NR flekker i omkringliggende ADSC arket angir at disse cellene ikke er akkumuleres lipid og derfor ikke skille mot en adipogenic avstamning seg (figur 3a). Propidium iodide flekker ble utført på 53 dager gamle SWAT. Utelukkelse av flekken i adipocyte klynger på Avansert timepoints demonstrerer en mangel på celledød (figur 3b). Olje-rød-O (ORO) flekken ble utført på 51 dager gamle SWAT med lipid flekken lokalisere innen fast adipocyte klynger, indikerer at SWAT adipocytter opprettholder viability med intakt adipocytter selv på Avansert timepoints (Figur 3 c).

Immunocytochemistry (ICC) ble utført for å vise forventede protein uttrykk og lokalisering av eldre adipocyte markører i SWAT. Intakt SWAT platene var farget med antistoffer mot perilipin (ab3526, 1:200 fortynning), PPARγ2 (sc-166731, 1: 100 fortynning), og FABP4 (ab92501, 1:1,000 fortynning). AC confocal bilder av 12 dager gamle SWAT vist forventet lokalisering av perilipin rundt lipid slippverktøy overflate (figur 4a). Fluorescens mikroskopi av 3 dager gamle SWAT med lipid counter flekken BODIPY demonstrert FABP4 lokalisering i cytoplasma (figur 4b) og overlappende signalet fra PPARG og DAPI flekker vist PPARG lokalisering til kjernen ( Figur 4 c).

SWAT transcriptional profil ble evaluert i vev seeded fra flere fag (n = 4 givere). På samling gjelder en del av fettvev en baseline RNA utvinning (d0), mens resten brukte frø SWAT plater. Disse platene ble deretter høstet på 24 h, 14 dager og 28 dager i SWAT kultur. Ett-trinns kvantitative omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR) ble utført for å finne transkripsjonstjenester nivåer. Seks viktige adipocyte gener ble undersøkt: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL og ADIPOQ (figur 5). ACTB ble brukt som en intern kontroll og transcriptional nivåer ble uttrykt som en prosent av emne-matchet planlagte (d0) uttrykk. Alle gener vist robust transkripsjon i SWAT, selv om nivåene trend nedover over tid. Vi tror at observert transcriptional profiler kan forbedres med ytterligere medier optimalisering som vi utdype under diskusjon.

Basal endocrine funksjon ble vurdert på samme kulturer brukes for transcriptional profilen. Nedbryting ble Hentet fra SWAT plater og leptin nivåer ble målt utnytte enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) (ab100581). SWAT vises basale leptin sekresjon dager 1, 14 og 28 (figur 6a). ADSC ark ble opprettholdt parallelt med SWAT plater som en kontroll (dvs. ADSC ark uten klemt WAT). Utskilles leptin registreres ikke i disse kontrollene (data ikke vist).

For å fastslå om SWAT kunne opprettholde kapasitet for et induserbart svar over tid, lipolyse ble undersøkt (n = 4). For å evaluere induserbart lipolytic kapasitet, en del av fersk samlet WAT (d0) var hakket og adipocytter var enzymatisk isolert (ligner på SWAT harvest i protokollen seksjon 5), mens resten brukte å frø SWAT plater. Isolerte adipocytter ble inkubert for 3t på 37 ° C i 300 µL av 2% fettstoffer-syre-fri bovin serum albumin i HBSS 100 µM forskolin, 1 µM adrenalin, eller kontroll-bufferen. Glyserol nivåer i samlet media ble målt med gratis glyserol reagens. SWAT ble deretter høstet dager 1 og 5 og lipolytic ble vurdert på samme måte. Kjemisk stimulering økt glyserol utgivelsen betydelig i alle tre timepoints (figur 6b): glyserol utgivelsen av behandlet adipocytter ble økt i d0 WAT med 82 ± 46% (p = 0,01), 1-dag SWAT med 577 ± 387% (p = 0,02), og fem-dagers SWAT med 348 ± 343% (p = 0,03). mener glyserol nivåer i stimulert adipocytter var svært like over alle tre timepoints: primære WAT 5.2 ± 0,8, 1-dag SWAT 4.4 ± 1,9 og 5 dagers SWAT 4.8 ± 1.8 µg glyserol/mg totale protein. Mener glyserol nivåer i kontroll (dvs. basale lipolyse) var relativt høy i fersk samlet WAT (d0) sammenlignet med SWAT-høstet celler. Dette kan skyldes økt stress til WAT vev på d0 under kirurgisk excision, transport til lab og hakking. Men viser disse eksperimentene ingen diminishment i lipolytic kapasitet i SWAT enten 1 eller 5 dager i forhold til fersk samlet WAT.

SWAT ble demonstrert i stand til transplantasjon og gjenoppretting i en musemodell (n = 4) som en demonstrasjon av komplekse, hele funksjon. Det er også en mulig anvendelse av plattformen bør en forsker ønsker å utnytte SWAT for å manipulere WAT i vitro før transplanting vev i en dyremodell. SWAT ble kultivert 10 dager og høstet utnytte standardprotokollen; isolerte adipocytter fra SWAT platene ble deretter lastet inn en 1 mL sprøyte (uten en nål). Et snitt ble gjort under huden på dorsal side en immunsupprimerte eGFP-uttrykke mus (NIKKER. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Dette skapte en liten dorsal subkutan lomme som SWAT-kulturperler adipocytter ble injisert med sprøyten og lommen deretter sydd stengt. Etter 10 dager etter transplantasjon, ble mus ofret. Transplantasjon var tydelig og lett gjenopprettet (figur 7a). Både gjenopprettede transplantasjon og en mus kontralateral fett depot er løst, parafin innebygd, og delt. Immunohistochemistry ble utført på de valgte lysbildene med primære antistoffer mot GFP (A10262, 1: 100 fortynning) og menneskelige PLIN (sc-390169, 1: 100 fortynning). Valgte anti-PLIN antistoffer ble eksperimentelt validert til stain menneskelige PLIN men ikke mus. Adipocytter fra den gjenopprettede transplantasjonen var ca 50-120 µm i størrelse, som er det forventede området for menneskelig adipocytter, og var helt negativ for GFP (figur 7b). Men var ca 31% av adipocytter positivt for menneskelig PLIN, indikerer vellykket engraftment til verten. Adipocytter i musen fett depoter var størrelse 20-40 µm, slik som samsvarer med musen adipocytter, mens flekker helt positive for GFP og helt negativ for menneskelig PLIN (figur 7 c). ADSC ark (med ingen klemt WAT) var scraping fra celle kultur retter og transplantert inn i mus som kontroll. Imidlertid dette ikke gir noen utvinnbare vev (data ikke vist). Dette indikerte at de gjenopprettede adipocytter var fra den eldre kulturperler SWAT, og ikke et resultat av ulike menneskelige ADSCs.

Figure 1
Figur 1: The SWAT metoden. (en) skjematisk av SWAT på viser av arket eGFP-merket ASCs fra en pNIPAAm-belagt vev kultur rett til et sekund, umerket ark av ASCs dyrket på en standard vev kultur parabol. Hakket, primære menneskelige WAT er klemt mellom 2 ASCs ark. (b) fluorescens mikroskopi demonstrere Brightfield, GFP og flettede kanaler med en SWAT opprettet av teknikken er beskrevet i (a). Skala bar = 100 µm. (c) Digital fotografi av en representant, 5 dager gamle SWAT kultivert i en standard 6-vel-plate. Det store volumet av WAT sikres stabilt til bunnen av brønnen. Figur endres fra Lau et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SWAT fortsatt levedyktig 8 uker i kultur. Føljetong brightfield imaging av en enkelt SWAT klynge over 55 dager viser ingen morfologiske endringer samsvar med celledød. Skalere barer = 100 µm. figur er endret fra Lau et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: SWAT fortsatt levedyktig på større enn 50 dager. (en) Nilen røde flekker demonstrerer flekker begrensning SWAT kultivert for 15 dager, indikerer live levedyktig adipocytter. Rundt stromal celler ikke flekker. Figur er på 40 X forstørrelse og skala bar = 100 µm. (b) Propidium iodide (PI) flekker av SWAT kultivert for 53 dager avslører fullføre PI eksklusjon, som angir ingen adipocyte død; Skala bar = 100 µm. (c) olje-rød-O farging av en 51 dager gamle SWAT demonstrerer begrensning av nøytrale lipider til adipocytter, som indikerer langsiktig stabilitet av adipocyte celle membraner. Figur endres fra Lau et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Immunocytochemistry viser at SWAT flekker positivt for eldre adipocyte celle markører med forventet lokalisering. (en) Confocal mikroskopi av 2 uke gamle SWAT avslørte menneskelige PLIN + unilocular celler med lokalisering lipid slippverktøy overflaten. Skala bar = 100 µm. (b) fluorescerende mikroskopi av 3 dager gamle SWAT avslørt menneskelige FABP4 + celler med lokalisering til cytoplasma og (c) PPARγ + cellene med lokalisering til cellekjernen. Skala bar = 100 µm. figur er endret fra Lau et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: SWAT opprettholder nøkkel adipocyte identitet genuttrykk. SWAT klynger var collagenase fordøyd etter 1, 14, og 28 dager i kultur og gene uttrykk bestemmes av RT-qPCR. RT-qPCR viser at 1 dager gamle og 14 dager gamle SWAT bevare høye nivåer av (en) PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL og (f) ADIPOQ. ACTB ble brukt som referanse genet. Feilfelt = standardfeil. Figur endres fra Lau et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: SWAT basally utskiller endotelial og reagerer fysiologisk katekolaminer stimulering. (en) ELISA kvantifisering av 24 h basale leptin sekresjon viser ingen betydelig endring etter 28 dager i kultur. (b) adrenerge stimulering med adrenalin og forskolin genererer et betydelig glycolytic svar i nylig høstet primære WAT (1,7 x) og emne-matchet SWAT 1 og 5 dager i kultur. Dag 1 SWAT svart katekolaminer stimulans med en 6.3-fold økning over basale Glykolysen mens dag 5 SWAT vist en 3.3-fold økning over basale Glykolysen. Stimulert Glykolysen var ikke signifikant forskjellig i SWAT sammenlignet med matchet frisk WAT (p = 0.53, n = 4). Feilfelt = standardfeil. Figuren er endret Lau et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: SWAT kan være reimplanted i vivo, demonstrere bevart hele funksjon. (en) SWAT var lett visualisert 10 dager etter transplantasjon i en immunsupprimerte mus (stjerne). Ikke hadde SWAT implantert, 10 dager ville nekrotisk SWAT har vært flytende. (b) deler av gjenopprettede SWAT vist stor, unilocular adipocytter (diameter 50 til 120 µm) som var eGFP. 31.3% av adipocytter var menneskelig PLIN +. De menneskelige PLIN + adipocytter tendens til å være mindre, som ville passe med kliniske observasjoner av fett pode hos mennesker der mindre adipocytter er mer sannsynlig å overleve overføringen. Skala bar = 100 µm, 200 X forstørrelse. (c) kontralateral fett pads tatt fra samme mus vist mye mindre adipocytter (20-40 µm) og var menneskelig PLIN-. Skala bar = 100 µm, 200 X forstørrelse. Figur endres fra Lau et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen detaljer bruk av ADSCs til sandwich menneskelige hvit fettvev; menneskelige ADSC linjer kan isoleres via veletablerte protokoller15. Systemet kan imidlertid være tilpasset individualisert forskning krav (for eksempel ved hjelp av 3T3L-1 celler sandwich musen WAT). Denne prosessen innebærer håndtering primære menneskelig vev. Standard forholdsregler bør brukes; håndtere menneskelig vev som BSL-2 patogener (f.eks HIV, HepC). Bare håndtere vev direkte under en BSC. Ha alle aktuelle PPE som diktert av institusjonelle sikkerhetsstandarder, doble hansker er sterkt anbefalt. Desinfiser riktig alle forsyninger og avfall med 10% bleike løsning eller 70% etanol løsning før gjenbruk eller disposisjon.

Det første kritiske trinnet i SWAT kultur er anskaffe og vedlikeholde pNIPAAm-belagt vev kultur plater. Slike plater er kommersielt tilgjengelige, eller de kan produseres til etablerte metoder12,13,14. Disse platene er temperatur-responsive celle kultur overflater. Over kritisk temperatur (~ 32 ° C), er hydrofobe og celler vil følge, ligner andre behandlet plast for vev kultur. Men under denne kritisk temperatur, overflaten blir hydrofile og cellene vil dissociate fra plast overflaten16. As a Result, bekymre burde være tatt å etablere: 1) hvor raskt en gitt celle type vil dissociate fra monolayer før full confluency (dvs. under vanlige medier endringer) og 2) nødvendig tid for å senke temperaturen med gelatin stempelet på pNIPPAm-belagt platen, slik at hele cellen arket dissociates. Media endringer bør utføres med media varmet til 37 ° C; Hvis celler er utsatt for rask dissosiasjon, utføre media endringer på en blokk på varme 37 ° c under BSC.

Det andre kritiske trinnet behandler fettvev forberede SWAT seeding. Vi spilte vår karakterisering av hakking WAT sterilisert tang og sterilisert barberhøvler. Men kan ikke menneskelige fascia deles lett med en barberhøvel. Maksimere adipocyte til fascia forholdet er viktig å beholde så mye fettvev i SWAT som mulig over lang tid. Store deler av intakt fascia at celle-celle kontakt mellom ADSCs og adipocytter, som er avgjørende for å holde SWAT sammen. Store mengder fascia kan også ha en "trekke på en tråd" effekt. Mens en enkelt WAT klynge kan dissociate fra en plate uten å påvirke den nærliggende klynger, kan flere klynger forbundet med fascia trekke nok klynger av en monolayer å gjøre en SWAT også ubrukelig. Fettsuging innebærer mekanisert hakking av WAT, kan omgå dette problemet som fascia er fint hakket under operasjonen. Men under fettsuging, er pasienter rutinemessig behandlet med høye doser av adrenalin; mulige konsekvenser av denne behandlingen på vev (og senere eksperimenter) må regnskapsføres i en studie.

Siste kritiske trinn i SWAT kultur er å velge en eksperimentell kultur medier. Vi spilte vår første karakterisering eksperimenter bruker standard celle kultur formulering (10% FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin i DMEM). Men basert på tilgjengelig litteratur om maksimere adipocyte transkripsjon, vi brukte en spesialisert formulering (7 µM insulin, 30 µM deksametason, 1 x Penicillin/Streptomycin i M199 media)17. Denne formuleringen forbedret de tidlige nivåene transkripsjon, men nivåer reduseres over tid. Vi tror dette er fordi i kroppen, adipocytter er utsatt for en rekke kjemiske signaler, ofte sykling mellom matet og sultet i løpet av en dag. Dermed bør det være mulig å forbedre observert transcriptional profilen over tid ved ytterligere optimalisering kosttilskudd til vår celle kultur medier.

SWAT harvest (protokoll, seksjon 5) isolerer adipocytter fra kulturen, reduserer eksempel volumet og fjerner støy fra omkringliggende ADSC arkene. Dette kan komme før adipocyte homogenisering (som er nødvendig for protein eller nukleinsyre isolasjon) eller funksjonelle søk på intakt adipocytter (for eksempel Glykolysen eller glukose opptak analyser). Alternativt kan intakt SWAT platen høstes for immunocytochemical flekker, som tillater ADSC arkene å sikre WAT klynger til monolayer gjennom farging prosessen. I dette tilfellet Sug opp kultur media og fikse hele kultur via standardprotokoller. Vi anbefaler imidlertid å legge et glass dekkglassvæske før å flate 3D adipocyte klynger og forbedre den resulterende bildekvaliteten.

Vi tror SWAT har stort potensial som en narkotikarelaterte screening plattform. Teknikken er enkelt, reproduserbare, og utnytter konvensjonelle vev kultur plater. Derfor er stoffet screening eksperimenter kjørbare ved å legge en farmakologisk aktive forbindelsen til kultur medium. Adipocytter kan da høstes for å undersøke effekten av sammensatte på genuttrykk epigenetic profil insulinfølsomhet, etc. tillegg av miljøgifter til kultur medium kan på samme måte brukes til å undersøke deres effekter på adipocytter. Fordi SWAT tillater forskeren til å spore individuelle adipocyte klynger over tid, er det unikt tilpasset å vurdere en behandling som gjør synlig fenotypiske endringer adipocytter. Et godt eksempel vil være menneskelig adipocyte "browning", hvor en hvit, lipid-lagring adipocyte blir "brunet" eller lignende til en thermogenic, multilocular brune adipocyte18. Dette er et fenomen av potensielt store kliniske relevans som er vist i musen modeller, men aldri i et menneske. Co kulturperler variasjoner på SWAT også holde enorm forskning potensial. SWAT er et naturlig co kultur system som benytter standard celle kultur brønner. Derfor kan en opprettholde adipocytter blant andre klinisk relevante celletyper ved å endre sandwiching cellene, eller ved å benytte vev kultur membran setter. For eksempel kan hepatocytter fungere som øvre sandwiching celle arket til skjermen et stoff som filtreres gjennom leveren før fettvev. Likeledes kan kreftceller dyrkes på en membran setter over SWAT undersøke hvordan adipocytter bidra til kreft patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne institusjonelle støtte fra LSU Health Sciences Center, som finansierte prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
  2. Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
  3. Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
  4. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
  5. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
  6. Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
  7. Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
  8. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
  9. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  10. National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
  11. Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
  12. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
  13. Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  14. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  15. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  16. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
  18. Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).

Tags

Atferd problemet 138 fettvev adipocytter fedme microphysiological systemer organer på chips narkotikarelaterte screening narkotika utvikling miljømessige toksisitet primære kultur diabetes metabolisme
En Microphysiologic plattform for menneskelig fett: klemt hvit fettvev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. … More

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter