Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

Spectrometrie van de massa van de spray blad is een directe analyse van de chemische techniek die minimaliseert de bereiding van de monsters en elimineert chromatografie, rekening houdend met de snelle detectie van kleine moleculen uit plantaardige weefsels.

Abstract

Planten produceren duizenden kleine moleculen die divers in hun chemische eigenschappen zijn. De Spectrometrie van de massa (MS) is een krachtige techniek voor het analyseren van plant metabolieten omdat het molecuulgewicht met hoge gevoeligheid en specificiteit biedt. Blad spray MS is een ambient ionisatie techniek waar plant weefsel wordt gebruikt voor directe chemische analyse via electrospray, elimineren van chromatografie van het proces. Deze benadering van bemonstering van metabolieten zorgt voor een breed scala van chemische klassen gelijktijdig uit intact plantaardige weefsels, minimaliseren van de hoeveelheid van de bereiding van de monsters die nodig zijn worden gedetecteerd. Bij gebruik in combinatie met een hoge resolutie, nauwkeurige massa MS, vergemakkelijkt blad spray MS de snelle detectie van metabolieten van belang. Het is ook mogelijk om versnippering van de tandem massa gegevens met deze techniek om een samengestelde identificatie te vergemakkelijken te verzamelen. De combinatie van nauwkeurige metingen van de massa en versnippering is nuttig bij de bevestiging van de samengestelde identiteiten. Het blad spray MS techniek vereist slechts kleine wijzigingen aan een nanospray ionisatie bron en is een nuttig instrument om de mogelijkheden van een massaspectrometer verder uitbreiden. Hier, wordt vers blad weefsel van Sceletium tortuosum (Portulacaceae), een traditionele medicinale plant uit Zuid-Afrika, geanalyseerd; talrijke mesembrine-alkaloïden worden gedetecteerd met blad spray MS.

Introduction

Planten bevatten een breed scala van kleine moleculen met uiteenlopende chemische eigenschappen. MS is een krachtige techniek voor het analyseren van plantenstoffen omdat het elementaire composities met een hoge gevoeligheid en specificiteit voor de detectie en de identificatie van metabolieten1 bieden kan. MS is meestal uitgevoerd op oplosmiddel-geëxtraheerde monsters, die worden gescheiden door chromatografie vóór de MS analyse1. Echter, het gebruik van vloeistofchromatografie (LC) vereist lange analyse keer en wordt vaak geassocieerd met een uitgebreide sample voorbereiding1. In tegenstelling, is directe chemische analyse van intacte weefsels die chromatografie omzeilt een zeer snelle techniek, minimal steekproef voorbereiding2vereisen. Dus, in gevallen waar de chromatografische stappen kunnen worden afstand, een directe chemische analyse kan nuttig zeer.

LC-MS (normaal) voor natuurlijke producten en metabolomica onderzoek berust op lange bulk extracties van gedroogde of diepgevroren plantaardig materiaal met meerdere weefsels en cel typen3. Anderzijds kan directe chemische analyse, zoals de MS detectie van metabolieten van plant weefsel, isoleren celtypes en voorbereiding artefacten4voorkomen. Blad spray MS, ook wel aangeduid als weefsel-spray5,6, is een directe ambient ionisatie MS-techniek, die in wezen geen monster voorbereiding5,7vereist. Blad spray die MS is nauw verwant aan papier spray MS, een ambient ionisatie-techniek met kenmerken van electrospray ionisatie die het mogelijk maakt voor de detectie van analyten dat zijn neergelegd op papier7. Ondanks de naam, blad spray MS is van toepassing op verschillende soorten plantaardige weefsels niet alleen bladeren en is aangetoond op fruit, zaden, wortels, bloemen weefsels en knollen, o.a.6,8,9, 10,11,12. De techniek vergemakkelijkt de ionisatie van endogene fytochemicaliën rechtstreeks vanuit het plantaardig materiaal in de massaspectrometer voor de detectie van8. Blad spray MS kan ook informatie bevatten over de ruimtelijke spreiding van chemische stoffen in verschillende weefseltypes (HLA) in planten13. Blad spray MS is in vergelijking met solvent extractie en LC-MS, suggereren de resultaten blad spray die MS voor de snelle detectie van oppervlakte metabolieten van unieke celtypes zoals plantenharen13 zorgt. Figuur 1 illustreert het blad spray MS experimentele opstelling. Directe electrospray ionisatie optreedt na slechts kleine bron wijzigingen. Een hoge spanning wordt toegepast op de plant weefsel via een metalen klem, produceren een spray van zeer geladen druppels vormen een Taylor-kegel die de ionen bij de inlaat van de ion van het MS. Electrospray draagt ionisatie optreedt vanaf de natuurlijke vloeistof van de plant of het oplosmiddel appl IED op het oppervlak van de plant. Een puntige tip op het weefsel vergemakkelijkt de electrospray en kan natuurlijk voorkomende of gemaakt door te snijden.

Blad spray MS is een snelle methode voor de kwalitatieve en semi-kwantitatieve analyse van intacte plantaardige weefsels die nut hebben gevonden voor een breed scala aan toepassingen. Bijvoorbeeld, is de techniek gebruikt om op te sporen van endogene stoffen te onderscheiden van verwante soorten, en zelfs om te evalueren van de wijzigingen in de dezelfde soort gegroeid onder verschillende omstandigheden. Eerdere studies hebben deze aanpak aangetoond door het meten van metabolieten in beautyberry (Callicarpa L.) 12 en Amerikaanse ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. in het laatste voorbeeld, ginsenosides, amino zuren en oligosachariden na bevochtiging van ruwe ginseng weefsel kon worden opgespoord. Wilde en gekweekte Amerikaans ginseng werden onderscheiden van Knol segmenten6. Ginseng Knol integriteit werd volgende blad spray MS, waardoor voor een latere morfologische en microscopische inspectie6bewaard. Exogene stoffen op plant monsters kunnen bovendien ook worden gedetecteerd. Een aantal pesticiden (acetamiprid, difenylamine imazalil, linuron en thiabendazool) zijn op peel of pulp van fruit en groenten9ontdekt. Hoewel deze studies en vele anderen hebben het nut van blad spray MS aangetoond voor verschillende specifieke doeleinden, is een gedetailleerd protocol niet eerder gemeld.

De beschrijving van het protocol zal hier niet ingaan op de optimalisering van de methode voor een specifieke weefsel of samengestelde. Eerder, de detectie van mesembrine alkaloïden van Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br (IJskruidfamilie) wordt gebruikt als een voorbeeld te bespreken van de nodige optimalisatie maatregelen die moeten worden genomen bij het opzetten van een blad spray MS experiment voor een soort, weefsel, of verbinding(en) voor de eerste keer. S. tortuosum is een succulente endemisch aan de semi-aride regio van het Karroo van Zuid-Afrika. Een traditionele geneeskunde van het San en de Khoi Khoi volkeren, het werd gebruikt voor de eetlust en dorst onderdrukking alsook wat betreft de psychotrope en pijnstillende effecten14,15. Momenteel, worden gestandaardiseerde extracten gebruikt voor de behandeling van neuropsychiatrische en neuropsychologische stoornissen16,17. De primaire verbindingen van belang bevatten het alkaloïde mesembrine en derivaten daarvan, waarvan vele ook in verwante Sceletium soorten15 gevonden zijn. Zowel wilde als gecultiveerde bevolkingsgroepen van S. tortuosum hebben variabele concentraties van mesembrine-alkaloïden, dus presenteren een kwaliteitscontrole uitdaging18. Een methode voor de snelle detectie van mesembrine-alkaloïden, zoals blad spray MS, kan zinvol zijn bij het toezicht op Sceletium producten. Omdat eerder, was er geen gedetailleerde visuele experimentele protocol voor het blad spray MS techniek, zullen we illustreren de methode met behulp van het voorbeeld van S. tortuosum, en het volgende wordt beschreven: de wijziging van de bron van een nanospray, de selectie en voorbereiding van de plantaardige weefsels, het verwerven van de data, de interpretatie van de resultaten, en het optimaliseren van de parameters van MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. wijzigingen in Nanospray bron voor blad spuiten MS

  1. Gebruik een gemodificeerde nanospray bron voor blad spray MS. Geen fluidic onderdelen die nodig zijn om blad spray MS, de gegevensbron wijzigen door het verwijderen van de LC-sonde van de bron.
  2. Monteer de blad spray MS draad die de spanning wordt toegepast op het weefsel van de plant met de juiste pin voor inpluggen in de bron. Soldeer de pin aan het ene uiteinde van een geïsoleerde draad; soldeer een klem aan het andere uiteinde van de draad.
    Opmerking: De klem (alligator clip type) kan of kan geen tanden. Voor kleine weefsel heeft een zadelpenklem zonder tanden de voorkeur. Een optionele flex arm met een klem kan worden toegevoegd aan de bron van de nanospray om te helpen bij de positionering van het weefsel van de plant. Opmerking dat dit protocol uitdrukkelijk wordt beschreven hoe u van blad spray MS op een massale analyzer voor hybride vierpolige ion trap MS systeem (Zie de Tabel van materialen); andere systemen van MS kunnen echter worden gewijzigd voor het uitvoeren van deze techniek6. Koppeling blad spray kan MS met een draagbare massaspectrometer real-time chemische analyse worden on-site uitgevoerd zonder de noodzaak voor het vervoer van het plantmateriaal aan het laboratorium19,20.
  3. Plaats een anti-statische vloer mat op de vloer onder de bron om de elektrische ontlading die uit de bron optreden kan bij het gebruik van hoge spanningen.

2. voorbereiding van het systeem van de MS blad Spray MS

  1. Als het systeem is onlangs in gebruik, laat het afkoelen tot de aanraking en verwijder eventuele alternatieve bron en de sweep-kegel. Bevestig de nanospray blad spray MS bron.
  2. Maak een melodie-bestand met de juiste ionisatie parameters als volgt instellen: schede, assistent en sweep gas aan 0; de spanning van de spray voor 2-5 kV; de capillaire temperatuur tot 150-250 ° C; en de S-lens RF-niveau tot 50. Sla het tune-bestand met de gewenste parameters8,13. Optimaliseren van de spanning en de temperatuur voor de beste ionisatie van het weefsel en verbinding(en) van belang.
    Opmerking: Goede beginpunten zijn 4 kV en 200 ° C.
  3. Maak een bestand van de methode met inbegrip van het blad spray MS tune bestand met: positieve en negatieve volledige MS; een resolutie van 70.000; een AGC doelwit van 1 x 106; een maximum van 200 ms; en de gewenste scan bereik m/z. Alternatief, gebruik slechts 1 polariteit.

3. bereiding van het Instrument, oplosmiddelen en Plant weefsel

Opmerking: Altijd Draag handschoenen en gebruik geen plant weefsel dat is behandeld met blote handen. Anders zal hun gehalte aan verontreinigingen ionen zoals polyethyleenglycol domineren de spectra.

  1. Breng de plantaardige weefsels voor dezelfde kamer als de MS-systeem te voorzien in een snelle bemonstering de analyse.
  2. Voor plant weefsel dat niet een natuurlijk puntige tip hoeft, gebruik een scheermesje op een glasplaatje te snijden een taps toelopende punt (Figuur 2). Bepalen van de hoeveelheid weefsel die nodig zijn voor de analyse op basis van de gevoeligheid van het instrument, weefseltype en verbinding(en) van belang (b.v., een jonge S. tortuosum blad dat ~ 5 mm in lengte).
    1. Gesneden S. tortuosum vertrekt om 10 weken na ontkieming in dunne reepjes, elk met een taps toelopende daartoe vormen een punt.
  3. Pincet gebruiken om voorzichtig de plant weefsel aan het einde, die zal worden geklemd. Houd het weefsel met een tang en zorgvuldig overbrengen naar de klem.
    Let op: Raak niet de bron van het instrument als de spanning op.
  4. Aanpassen van de flexibele arm en de draad met de klem het weefsel in overeenstemming met de inlaat van de MS positie, zodat de afstand tussen het weefsel van de plant en de inlaat van de ion van het MS 5-10 mm voor de triple vierpolige (bijvoorbeeldTSQ is) en lineaire val vierpolige (LTQ) en 10 -50 mm voor de ion trap massa analyzer (bijvoorbeeld, orbitrap)8.
    1. Sluit het andere uiteinde van de draad aan op de bron. Als de eerste pogingen een laag signaal intensiteit produceren, verplaatst u de plant weefsel dichter bij de inlaat van de ion (Zie de discussie voor optimalisatie).
  5. Laad het bestand methode; naam van het gegevensbestand en stel de locatie van de opslag van het bestand. Vervolgens de MS-systeem inschakelen door te klikken op spelen en klik op starten om te beginnen het verwerven van gegevens.
  6. Toepassing van een oplosmiddel (b.v., methanol) met behulp van een pipet met een gel-laden tip om te maximaliseren van de afstand tussen de handen en de hoge spanning om de gebruiker te beschermen.
    Opmerking: Het oplosmiddel volume nodig is hangt af van de grootte, droogheid en textuur van het weefsel, meestal ~ 2-20 µL. S. tortuosum bladeren hoeven niet elk oplosmiddel worden toegevoegd. Zorgvuldig toepassen van het oplosmiddel en raak niet de bron van het instrument wanneer de spanning ingeschakeld is. Gebruik LC-MS rang oplosmiddelen en glaswerk dat is zuur gewassen en is vrij van detergentia. In sommige weefsels, kan een signaal worden waargenomen zonder de toevoeging van een oplosmiddel als gevolg van het natuurlijke vochtgehalte van het weefsel van de plant. Een grotere signaalsterkte en verminderde S/N wordt echter meestal bereikt door toepassing van een oplosmiddel op het weefsel.
  7. Verwerven van gegevens zolang het signaal blijft of totdat het voldoende spectra zijn verzameld, meestal 30-60 s. Indien nodig, gelden extra oplosmiddel te handhaven van een hoog signaal intensiteit voor een langere tijd. De data-acquisitie stoppen en onderbreken van het MS-systeem.
  8. Verwijder het weefsel en wassen van de klem met 100% methanol en een pluisvrij doekje. Reinig de inlaat van de MS-ion na ongeveer 1-2 h van de overname door blad spray MS volgens specificaties van de leverancier. Ook, schoon de MS ion inham tussen analyses van verschillende weefseltypes (HLA).

4. gegevens kwaliteitsbeoordeling

  1. Open het gegevensbestand en de hoofdpiek massa chronogram visueel te inspecteren. Controleer of de intensiteit van het signaal ~1.0 x 10,7 tot en met 5.0 x 10 is8. Als het signaal lager is, verplaatst u het weefsel dichter bij de inlaat van de ion. Als de front-end van het systeem van MS hoger, vuil wordt, dus het weefsel te bewegen verder van de inlaat van de ion.
  2. Op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van de ionen van belang in de massaspectra geproduceerd, veranderen de parameters.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

5. tandem massa fragmentatie

  1. Beslissen wat ionen zijn van belang voor de tandem massa-fragmentatie (MS/MS); een signaal van de massaspectra thats > 1.0 x 105 is voldoende voor de selectie van ionen voor MS/MS.
  2. Maak een nieuwe methode-bestand met een lijst van de opneming van m/z uit tot op 4 decimalen. Klik op globale lijsten en integratie. Selecteer onder Eigenschappen van PRM, de fragmentatie energie [bijvoorbeeld, genormaliseerde botsing energie (NCE) van 30-50 is een goede spreiding te beginnen] en andere MS/MS-parameters.
    1. MS/MS om gegevens te verkrijgen voor mesembrine alkaloïden, fragment de volgende ionen, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zen 292.1897 m/z, op nvu 35.
      Opmerking: De data-acquisitie voor MS/MS kan worden uitgevoerd onmiddellijk na de MS of op een later tijdstip. De dezelfde weefsel kan vaak geklemd blijven na een volledige MS en kan worden gebruikt voor het verkrijgen van gegevens van de MS/MS. Echter, als een respraying niet in een voldoende signaal voorziet gebruikt een nieuw weefsel.
  3. Het bestand MS/MS methode en een benoemde gegevensbestand laden. Hiermee zet u de MS system en start het verwerven van gegevens, het toevoegen van een oplosmiddel, indien nodig. Wanneer voldoende spectra zijn verzameld, meestal na 30-60-s, stoppen met de overname.
  4. Verzamelen fragmentatie bij veel verschillende energieën bij het toewijzen van fragment ionen.
    Opmerking: Aangezien blad spray MS een chromatografische scheiding ontbreekt, de fragmentatie spectra waarschijnlijk veel ionen bevatten, en fragmenteren bij verschillende energieën zullen helpen duidelijkheid.

6. de vermeende identificaties door nauwkeurige massa en Tandem massa-fragmentatie

  1. Vermeende identificaties maken door te verwijzen naar nauwkeurige metingen van de massa uit openbaar beschikbare metaboliet databases zoals menselijke Metabolome Database22, massa Bank23, Metlin21, lipide kaarten24, National Institute of Normen en technologie MS zoeken25, ReSpect voor fytochemicaliën26of27van de BNP.
  2. Aangezien deze databases niet uitputtende, voeren een aanvullende literatuuronderzoek op de plantensoorten die chemisch gekarakteriseerd als dit nodig is.
  3. Wedstrijd fragmentatie ionen uit blad spuiten MS/MS tot de bovengenoemde databases wanneer MS/MS informatie beschikbaar is, of tot de literatuur. U kunt ook een handmatige interpretatie van MS/MS fragment ionen of een versnippering van een authentiek standaard uitgevoerd door de directe inspuiting of LC-MS/MS te gebruiken.

7. de gegevensanalyse

  1. De MS raw-bestanden converteren naar mzXML bestanden met het hulpprogramma msConvert uit de Proteowizard28.
  2. Gebruik het XCMS softwarepakket geïmplementeerd in R voor piek plukken. Een directe infusie verwerkingsmethode voor de blad spray MS analyse gebruik.
    Opmerking: De goed geannoteerde scripts die worden gebruikt voor de verwerking van gegevens kunnen worden gevonden op https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. Om op te halen semi-kwantitatieve normaliseren metingen, administratieve verwerking van de experimentele variabiliteit, de intensiteit van elk metaboliet door de totale huidige ion (TIC), als de blad spray MS signaal intensiteit variëren kan, gedeeltelijk als gevolg van de lichte variaties in de positionering van het blad in de bron en de verschillen in bladvorm en grootte.
  4. Ook leverancier geleverde software voor de data-analyse of MZmine2 te gebruiken (te vinden op http://mzmine.github.io/)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Op 10 weken die na ontkieming, vers verzameld serre gekweekte S. tortuosum verlaat werden geanalyseerd door blad spray MS. De experimentele workflow voor het opsporen van metabolieten van S. tortuosum laat met behulp van blad spray die MS wordt geïllustreerd in Figuur 2. Een blad was geselecteerd, snijd in een smalle strook met een taps toelopende daartoe vormen een punt en geklemd met het blad spray MS draad klem apparaat. De plant weefsel was gepositioneerd ~ 30 mm van de ion-inlaat en in overeenstemming met de x- en y-axes. Bij de inleiding van de blad-spray die MS van de S. tortuosum verlaat, werden de ionen gedetecteerd zonder oplosmiddel toevoer. Planten uit de familie Sceletium zijn vetplanten met dikke bladeren met een hoog watergehalte waarmee electrospray ionisatie door blad spray MS zonder externe toepassing van een oplosmiddel. Echter, meestal, plantaardige weefsels vergt een oplosmiddel toepassing te detecteren ionen.

Een massale chronogram en massaspectra zwaar gevuld met ionen werden geproduceerd na 30 s van acquisitie in positieve ionisatie modus (Figuur 3). De chronogram vertegenwoordigt een succesvolle blad spray MS experimenteren waar een stabiel signaal voor de volledige duur van de overname werd gehandhaafd. In deze studie, een totaal van negen mesembrine alkaloïden werden ontdekt door blad spray MS en vermeende identificaties werden gemaakt van de exacte massa van de geprotoneerd ionen van eerder gekenmerkt verbindingen (tabel 1)30. Is het voordelig om te voeren blad spray MS op een hoge resolutie, nauwkeurige-mass (HRAM) massaspectrometer, waardoor het mogelijk is om op te lossen iets verschillende massa's. Bijvoorbeeld, de m/z op 262.1794 vermoedelijk kon worden geïdentificeerd als dihydrojoubertiamine in plaats van als mesembrenone-M (demethyl - dihydro-), die zouden zijn geweest bij m/z 262.1443.

Het blad weefsel bleef geklemd voor een tandem massa (MS/MS) versnippering van een paar ionen van belang (tabel 1). Figuur 4 ziet u drie voorbeelden van MS/MS fragmentatie spectra van blad spray MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zen 292.1897 m/z. Vermeende identiteiten werden gecontroleerd door massafragmenten en bevestigd met eerder geïdentificeerde fragmenten30. De geprotoneerd deliberalisering van 276.1583 m/z werd geïdentificeerd als twee verschillende isomeren van mesembrine-M (demethyl) en een ander twee isomeren van mesembrenone-M, dankzij de aanwezigheid van diagnostische fragmenten voor elke isomeer (tabel 1).

Zowel mesembrine als mesembrine-M (dihydro-) werden gedetecteerd door blad spray MS en vermeende geïdentificeerd door exacte massa en massa-fragmentatie. De geprotoneerd deliberalisering van mesembrine op 290.1742 m/z is één van de overvloedigste ionen in het spectrum; het kan dus een waarschijnlijke kandidaat als een biomarker voor toekomstige studies. De twee belangrijkste alkaloïden van S. tortuosum zijn mesembrine en mesembrenone, die beide gemakkelijk gedetecteerd door blad spray MS. Verscheidene van de bestanddelen gedetecteerd door blad spray die MS kunnen nuttig zijn bij de controle van plantaardig materiaal van Sceletium en afgeleide producten.

Figure 1
Figuur 1: blad spray MS diagram van set-up. Blad spray MS is een metaboliet profilering van de methode die het mogelijk voor de snelle bemonstering van intact plant weefsel maakt. Het diagram toont een blad spray MS met kV hoge spanning toegepast met een klem en de mogelijkheid om de toepassing van een oplosmiddel op het weefsel van de plant. Blad spray MS vergemakkelijkt electrospray ionisatie rechtstreeks vanuit de fabriek weefsel in de inlaat van de MS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Workflow van blad spray MS experimenteren. Geselecteerde plant weefsel, een Sceletium tortuosum blad, was knippen en vervolgens overgedragen met een tang worden geklemd, en vervolgens gepositioneerd voor de inlaat van de ion voorafgaand aan de data-acquisitie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Metaboliet profilering van Sceletium tortuosum door blad spray MS met positieve ionisatie. (A) dit paneel toont een blad spray MS totale ion graaf (TIC) massa chronogram. Voor elke piek, het hoogste getal is de tijd (min) en de bodem is de m/z. (B) dit paneel toont de blad spray MS metaboliet Profiel van een Sceletium tortuosum positieve massaspectrum. De inzet toont 260-295 m/z. Nauwkeurige massa's worden gerapporteerd uit tot op 4 decimalen met een fout < 6 ppm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Blad spray MS positieve ionisatie tandem massaspectra van Sceletium tortuosum gesneden blad. Deze panelen Toon tandem massaspectra (MS/MS) verzameld in positieve ionisatie modus met blad spray MS. Putative identificaties van alkaloïden zijn gemaakt van de nauwkeurige massa en de versnippering van de massa voor het volgende: (A) mesembrine-M en mesembrenone-M isomeren, (B) mesembrine en (C) mesembrine-M (dihydro-). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Samengestelde Molecuulformule Gemeten exacte massa m/z [M + H] ppm fout Fragmenten
Dihydrojoubertiamine C16H232 262.1794 5.0 N/B
Mesembrenone-M (O - demethyl-) C16H193 274.1431 4.5 N/B
Mesembrine-M (O - demethyl-) C16H213 276.1583 5.9 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258
Mesembrine-M (N - demethyl-) C16H213 276.1583 5.9 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247
Mesembrenone-M (O-demethyl - dihydro-) C16H213 276.1583 5.9 124, 205, 218, 227, 245
Mesembrenone-M (N-demethyl - dihydro-) C16H213 276.1583 5.9 120, 151, 210, 229, 241
Mesembrenone C17H213 288.1587 4.3 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270
Mesembrine C17H233 290.1742 4.9 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272
Mesembrine-M (dihydro-) C17H253 292.1897 5.2 151 177, 201, 217, 243, 259, 274

Tabel 1: vermeende identificaties van Sceletium tortuosum Mesembrine alkaloïden door blad spray MS. Deze tabel verslagen over positieve ionisatie nauwkeurige massa's en fragment ionen voor Sceletium tortuosum mesembrine alkaloïden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het succesvolle gebruik van dit protocol, is afhankelijk van de optimalisering van de verschillende stappen voor de plantensoorten, weefseltype en doel verbinding(en) van belang. De parameters die worden beschreven in het protocol vormen een goed uitgangspunt. De volgende experimentele beslissingen moeten worden gemaakt en getest: wel of niet gebruik (1) knippen of Onbesneden weefsel en (2) oplosmiddel of geen oplosmiddel, (3) welke oplosmiddel te gebruiken en in welke omvang, (4) wat de afstand van weefsel van de inlaat van de ion moet , en (5) de amplitude van de spanning. Het doel van optimalisatie is het vinden van de voorwaarden die het produceren van een continu signaal dat bewaard voor ten minste 30 blijft s tot enkele minuten. De voorwaarden dient een adequate en reproduceerbare signaal intensiteit, die nodig is voor het uitvoeren van exacte massa en MS/MS-metingen. Hoge signaalsterkte wordt bereikt via een succesvolle en betrouwbare spray van ionen uit het weefsel. De kwaliteit van de spray is afhankelijk van de scherpte van het puntje van het weefsel wijzen naar de inlaat van de ion, de afstand tussen het uiteinde van de weefsel- en ion inlaat, en de elektrische spanning toegepast. Een succesvolle spray is sterk afhankelijk van de scherpte van het punt van de tip van weefsel en, in sommige gevallen, het weefsel moet worden gesneden om te vormen van een puntige tip. In het bijzonder lichte veranderingen in de scherpte van de hoek van de taps toelopende vorm op het puntje van het gesneden weefsel significante effecten hebben op de uiteindelijke kwaliteit van ionisatie en dus de signaalsterkte7geproduceerd. In gevallen waar de weefsels zijn al aangegeven, betekent is geen snijden noodzakelijk, zoals het geval met gras bladen of lancet-vormige bladeren5,13.

Een ion-signaal kan worden onderdrukt en unstable wanneer plasma kwijting van het weefsel ten gevolge van zijn plaatsvindt geplaatst te dicht aan de inlaat van de ion of de elektrische spanning te hoog wordt. Een goede positionering van het weefsel en een selectie van de elektrische spanning zijn verplicht te zorgen voor een stabiele en consistente spray tussen de monsters. De afstand van het weefsel van de inlaat van de MS-ion beïnvloedt ook de kwaliteit en kwantiteit van signaal geproduceerd. In het algemeen moet een kleinere weefsel steekproef worden geplaatst dichter bij de inlaat, hoewel kleine weefsel niet in een lage signaal intensiteit resulteren als de tip is zeer wees of de verbindingen sterk geconcentreerd zijn. De intensiteit en de consistentie van spectra moeten empirisch worden geoptimaliseerd door het vergelijken van verschillende plaatsing posities langs de z-as. Het is essentieel voor een geschikte ionisatie dat het weefsel van de plant wordt uitgelijnd met de inlaat van de MS-ion in zowel de x- en y-axes. Echter, als de plant weefsel onredelijk dicht bij de inlaat van de ion is, kan hiervoor een vaker worden gereinigd van de ion-optica en de front-end van het systeem van de MS.

De hoeveelheid oplosmiddel toegepast op de top van het weefsel kan variëren van 0 - 50µL afhankelijk van het vochtgehalte en de grootte van de steekproef van het weefsel. In gevallen waarin het weefsel extreem hoge in vochtgehalte en wordt gesneden, zoals in het geval van de sappige Sceletium, kan geen oplosmiddel worden toegevoegd. Het is echter meer typisch te gebruiken ten minste 5-10 µL van oplosmiddel voor ten minste één toepassing. De toevoeging van een oplosmiddel is nodig bij het gebruik van een weefsel van gedroogde of verse weefsel met een laag vochtgehalte ter vergemakkelijking van de spray. Als een kleine hoeveelheid oplosmiddel wordt gebruikt op een groot vel van plantaardig materiaal, zal het waarschijnlijk zonder produceren een voldoende spray worden geabsorbeerd. Omgekeerd, als een te hoog volume wordt gebruikt, verbindingen kunnen worden verdund of goede desolvation zal niet gemakkelijk en efficiënt gebeuren. Een alternatieve optie om handmatig pipetteren oplosmiddel is voortdurend aan het weefsel via een spuitpomp oplosmiddel toepassen, zodat het waargenomen signaal vervalt als een functie van de tijd als de compound is uitgeput van het plant materiaal10. Verschillende soorten oplosmiddelen moeten worden berecht, en de resulterende spectra vergeleken om te controleren of geen verbetering van de hoeveelheid en consistentie van de ion(s) voor de verbinding(en) van belang. De toevoeging van een oplosmiddel niet alleen produceert spray, maar bieden ook een selectiviteit voor de extractie van verschillende stoffen. Organische oplosmiddelen met verschillende polariteiten (methanol, dichloormethaan, hexanes, acetonitril, chloroform en aceton) zijn vergeleken en leiden tot aanzienlijk verschillende ionen aanwezig in de spectra van een pinda zaad8. Methanol is in het algemeen, een goede eerste keuze voor het oplosmiddel zijn, als het blijkt goed te werken voor veel plantaardige weefsels en een breed scala van fytochemicaliën, met inbegrip van aminozuren, alkaloïden, flavonols, koolhydraten, organische zuren, vetzuren en fosfolipiden8. De toepassing van 100% water op Onbesneden plantaardige weefsels meestal werkt niet goed, maar kan worden verbeterd met de toevoeging van zouten10. In veel gevallen naast geprotoneerd ionen van een omheind gebied, andere overvloedige adducten worden gedetecteerd zoals natrium en kalium adducten. De aanwezigheid van deze zout adducten is zelfs vaker als zout wordt toegevoegd aan het oplosmiddel kan nuttig zijn. Bijvoorbeeld, werden een verhoogde gevoeligheid en selectiviteit van fenolische glycosiden van Populus soorten waargenomen met de toevoeging van natrium en kalium ionen naar de toegepaste oplosmiddel10.

Twee belangrijke beperkingen van het blad spray MS techniek zijn (1) de lage dynamisch bereik en (2) uitdagingen met kwantificatie. Doorgaans worden alleen de meest voorkomende verbindingen geïoniseerd en gedetecteerd door de techniek. Afname van de efficiëntie van de ionisatie als gevolg van de onderdrukking van de ion dat dramatisch in de afwezigheid van de gaschromatografische scheiding optreedt zijn minder een probleem met overvloedige metabolieten. Om deze beperking te omzeilen, kan het scanbereik te richten op alleen de m/z concentratiebereik worden aangepast. Echter laag-overvloed verbindingen nog steeds niet herkend zonder de scheiding en concentratie geboden door chromatografie. In tegenstelling tot de typische kwantificatie van stoffen uit een uittreksel, interne standaarden kunnen niet goed gemengd worden in het plantmateriaal vóór blad spray MS. Semi-quantitative metingen en relatieve concentraties zijn verkregen door het plaatsen van een bekende concentratie van een standaardoplossing op het oppervlak van het weefsel en dan het toestaan van het drogen voordat een blad spray MS analyse8,9,31. Bijvoorbeeld, werd de kwantificatie standaardadditiemethode gebruikt voor de berekening van de verhouding tussen de representatieve ion voor de interne standaard aan het ion van belang zijn voor het bepalen van de relatieve hoeveelheden32. Een kalibratiekromme werd gebruikt om de relatieve concentratie te schatten. Met behulp van deze methode, was het mogelijk om de verhouding van de verschillende glycosiden aan een interne standaard, rebaudioside D vergelijken, en de relatieve concentratie van specifieke glycosiden kan vervolgens worden berekend binnen de Stevia bladeren33. U kunt ook is een nauwkeuriger kwantificatie mogelijk met een ionenpaar gelabelde standaard van de stof van belang, hoewel commerciële beschikbaarheid kan een uitdaging zijn. Het gebruik van metabolisch gelabelde plant weefsel kan ook de kwantificatie met deze methode34verbeteren.

Gezien het feit dat conventionele LC-MS/MS een uitgebreide monstervoorbereiding en de gaschromatografische scheiding vereist zijn, worden andere methoden voor analyse zijn vaak gewenst. Blad spray MS is een directe analyse van de chemische techniek die gemakkelijk kan worden toegepast en biedt eenvoud, precisie, nauwkeurigheid en snelle metaboliet detectie en semi-kwantificatie. Om deze reden onderzochten we de geschiktheid van blad spray MS om te controleren de chemische inhoud van S. tortuosum, die de basis voor chemotaxonomic tools om te onderscheiden soorten van het geslacht van de Sceletium gebaseerd op biochemische verschaffen handtekeningen. Verschillende anatomische eigenschappen van deze plant maken het een ideale monster voor blad spray MS. Het is een sappig, met grote hoeveelheden water, dat gunstig is als de spray kan worden gegenereerd zonder de toepassing van een oplosmiddel. Sceletium blad bevat15 idioblasts (blaas-achtige cellen), die dienen als opslag reserves waar gespecialiseerde metabolieten kunnen zich ophopen. Blad spray MS is een in vivo analysetechniek te karakteriseren plant weefsel op een snelle manier. De algemene techniek geldt voor vele plantensoorten weefseltypes (HLA) en klassen van samenstellingen. Technieken die het vastleggen van informatie over plantenstoffen zijn van groot belang voor het begrijpen van de plant primaire en gespecialiseerde metabolisme voor menselijk gebruik van gezondheid, voeding, landbouw en energie35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de NSF fabriek Genome Research Program grant IOS-1238812 en de postdoctorale Fellowship in biologie IOS-1400818. Het werk werd ook gefinancierd door een Monsanto Graduate Student Fellowship aan Katherine A. Sammons. Het Fulbright Afrikaanse onderzoeker geleerden programma (2017-2018) is bedankte voor financiering toegekend aan Nokwanda P. Makunga. We waarderen de donatie van de bron van de nanospray van Jessica Prenni en de proteomica en metabolomica faciliteit in Colorado State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
  22. Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
  23. Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
  24. Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
  25. National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
  26. ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
  27. GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
  28. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  31. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  32. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  33. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  34. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  35. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 136 Leaf spray MS massaspectrometrie electrospray ionisatie ambient ionisatie Sceletium tortuosum mesembrine-alkaloïden natuurlijke producten planten metabolieten kleine moleculen
Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freund, D. M., Sammons, K. A.,… More

Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter