Summary
Espectrometría de masas en aerosol foliar es una técnica de análisis químico directo que reduce al mínimo la preparación de la muestra y elimina la cromatografía, permitiendo la detección rápida de pequeñas moléculas de los tejidos vegetales.
Abstract
Las plantas producen miles de moléculas pequeñas que son diversas en sus propiedades químicas. Espectrometría de masas (MS) es una técnica poderosa para el análisis de metabolitos de la planta porque proporciona pesos moleculares con alta sensibilidad y especificidad. Hojas spray MS es una técnica de ionización ambiental donde el tejido de la planta se utiliza para análisis químico directo mediante electrospray, eliminación de cromatografía de proceso. Este enfoque de muestreo metabolitos permite una amplia gama de clases de químicos para detectar simultáneamente de tejidos de la planta intacta, minimizando la cantidad de preparación de la muestra necesitada. Cuando se utiliza con una alta resolución, precisa em masa, spray de hoja em facilita la detección rápida de metabolitos de interés. También es posible recopilar datos de tándem masas fragmentación con esta técnica para facilitar la identificación de una compuesto. La combinación de la fragmentación de las medidas exactas de masas es beneficiosa en confirmar identidades compuestas. La hoja técnica de MS requiere sólo pequeñas modificaciones a una fuente de ionización nanospray y es una herramienta útil para ampliar la capacidad de un espectrómetro de masas. Aquí, se analiza el tejido foliar fresco de Sceletium tortuosum (Aizoaceae), una planta medicinal tradicional de Sudáfrica, se detectan numerosos alcaloides mesembrine con spray de hoja em.
Introduction
Las plantas contienen una amplia gama de pequeñas moléculas con diferentes propiedades químicas. MS es una técnica poderosa para el análisis de compuestos de la planta porque puede proporcionar composiciones elementales con una alta sensibilidad y especificidad para la detección e identificación de metabolitos1. Comúnmente, MS se realiza en muestras extraídos por solvente, que se separan por cromatografía de antes de la MS análisis1. Sin embargo, el uso de la cromatografía líquida (LC) requiere tiempos de análisis muy largo y suele estar asociado con una muestra extensa preparación1. En contraste, el análisis químico directo de tejidos intactos que elude la cromatografía es una técnica muy rápida, que requiere la preparación de la muestra mínimo2. Así, en casos donde pasos cromatográficos pueden ser pérdidas, un análisis químico directo puede altamente ventajoso.
Típica LC-MS para la investigación de productos y metabolómica natural se basa en extracciones de largo a granel de materiales vegetales secos o congelados que contienen múltiples tejidos y células tipo3. Alternativamente, el análisis químico directo, como el MS la detección de metabolitos de tejido vegetal, puede aislar tipos celulares y evitar artefactos de preparación4. Spray de hoja em, también conocida como tejido en spray5,6, es una técnica de ionización ambiental directa MS, lo que requiere esencialmente no muestra preparación5,7. Spray de hoja EM se relaciona estrechamente con spray papel MS, una técnica de ionización ambiental con características de ionización de electrospray que permite la detección de analitos que se depositan sobre papel7. A pesar del nombre, hoja aerosol MS es aplicable a varios tipos de tejidos de la planta, no sólo las hojas y ha sido demostrado en fruta, semillas, raíces, tejidos florales y tubérculos, entre otros6,8,9, 10,11,12. La técnica facilita la ionización de fitoquímicos endógena de las materias vegetales en el espectrómetro de masas para la detección de8. Aerosol de hoja em también puede proporcionar información sobre la distribución espacial de sustancias químicas en los tipos de tejidos diferentes en las plantas13. Aerosol de hoja em es comparación con extracción por solventes y LC-MS, los resultados sugieren spray hoja que MS permite la detección rápida de metabolitos superficie de tipos de la célula única como tricomas13. La figura 1 ilustra el montaje experimental de hoja aerosol MS. Ionización por electrospray directa se produce después de solamente modificaciones de menor importancia fuente. Un alto voltaje se aplica a los tejidos de la planta mediante una abrazadera metálica, produciendo un spray de gotas muy cargados formando un cono de Taylor que lleva los iones a la entrada de iones de la Sra. Electrospray ionización se produce desde el líquido natural de la planta o desde el solvente appl IED a la superficie de la planta. Una punta en el tejido facilita el electrospray y puede naturalmente que ocurren o creado por corte.
Hojas spray MS es un método rápido para el análisis cualitativo y semicuantitativo de tejidos vegetales intactos que han encontrado utilidad para una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la técnica se ha utilizado para detectar compuestos endógenos para distinguir especies relacionadas e incluso a evaluar los cambios en las mismas especies cultivadas bajo diferentes condiciones. Estudios anteriores han demostrado este enfoque mediante la medición de metabolitos en Misisipí (Callicarpa L.) 12 y ginseng americano (Panax quinquefolium L.) 6. en el último ejemplo, ginsenósidos, aminoácidos y oligosacáridos podrían detectarse después de mojar el tejido ginseng crudo. Ginseng americano silvestre y cultivado se diferenciaron del tubérculo rebanadas6. Integridad del tubérculo de ginseng fue preservado sucesivas spray de hoja em, que permitió una inspección morfológica y microscópica posterior6. Además, se pueden detectar compuestos exógenos en las muestras de la planta. Un número de pesticidas (acetamiprid, Difenilamina, imazalil, linurón y tiabendazol) se han detectado en la cáscara o pulpa de frutas y hortalizas9. Mientras que estos estudios y muchos otros han demostrado la utilidad de la pulverización de hojas MS para los varios propósitos específicos, un protocolo detallado no se ha divulgado previamente.
Aquí, la descripción del Protocolo no se centrará en la optimización del método de un tejido específico o compuesto. Por el contrario, la detección de alcaloides mesembrine de N.E.Br Sceletium tortuosum (L.). (Aizoaceae) se utiliza como ejemplo para discutir las medidas de optimización necesarias que deben tomarse cuando se configura un experimento de MS hoja aerosol para una especie, tejido, o establecidos por primera vez. S. tortuosum es una suculenta endémica de la región semiárida de Karroo de Sudáfrica. Una medicina tradicional de la San y Khoi Khoi gente, era utilizada para la supresión del apetito y sed, así como por sus efectos analgésicos y psicotrópicos14,15. Actualmente, se utilizan extractos estandarizados para el tratamiento de los trastornos neuropsicológicos y neuropsiquiátricos16,17. Los compuestos primarios de interés son el alcaloide mesembrine y sus derivados, muchos de los cuales también se encuentran en relacionados con Sceletium especies15. Poblaciones silvestres y cultivadas de S. tortuosum tienen concentraciones variables de alcaloides mesembrine, presentando así un reto de control de calidad18. Un método para la detección rápida de mesembrine alcaloides, tales como spray de hoja em, puede ser útil en el seguimiento de productos Sceletium . Ya anteriormente, no había habido ningún protocolo experimental visual detallado para el aerosol de la hoja técnica de MS, ilustramos el método utilizando el ejemplo de S. tortuosum, se describe lo siguiente: la modificación de una fuente nanospray, el selección y preparación de los tejidos de la planta, la adquisición de los datos, la interpretación de los resultados y la optimización de los parámetros de MS.
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Protocol
1. modificaciones a fuente Nanospray hoja aerosol MS
- Use una fuente nanospray modificado para el aerosol de hoja em. Como no componentes fluídicos necesarios para pulverización foliar MS, modificar la fuente retirando la sonda de LC de la fuente.
- Montar el alambre de MS hoja aerosol que se aplicará la tensión en el tejido de la planta con el pasador adecuado para enchufar en la fuente. Soldar el pin a un extremo de un cable aislado; una abrazadera en el extremo opuesto del alambre de la soldadura.
Nota: La abrazadera (Cocodrilo clip tipo) puede o no tener dientes. Para pequeños de tejido, se prefiere una pinza sin dientes. Un brazo flexible opcional con una pinza se puede añadir a la fuente nanospray para ayudar en la colocación del tejido de la planta. Nota que este protocolo describe específicamente cómo realizar rociado de hojas MS en un híbrido cuadrupolo ion trap masa analizador de sistema MS (véase la Tabla de materiales); sin embargo, otros sistemas MS pueden ser modificados para realizar esta técnica6. Pulverización foliar de acoplamiento MS con un análisis químico en tiempo real del espectrómetro de masas portátil puede realizarse in situ sin necesidad de transportar el material de planta al laboratorio19,20. - Coloque una alfombrilla antiestática en el piso debajo de la fuente para reducir la descarga eléctrica que puede ocurrir desde el origen cuando se utiliza altos voltajes.
2. preparación del sistema MS hoja aerosol MS
- Si el sistema ha sido recientemente utilizado, deje que se enfríe al tacto y eliminar cualquier fuente alternativa y el cono de barrido. Conecte la fuente de MS nanospray hoja aerosol.
- Crear un archivo de canción con los parámetros apropiados de ionización como sigue: vaina, auxiliar y gas de barrido a 0; la tensión de aerosol a 2-5 kV; la temperatura capilar a 150-250 ° C; y el nivel de RF S-lente a 50. Guarde el archivo de sintonía con los parámetros deseados8,13. Optimiza el voltaje y la temperatura para la mejor ionización del tejido y del interés establecidos.
Nota: Puntos de partida son 4 kV y 200 ° C. - Hacer un archivo método incluyendo el archivo de tune hoja aerosol MS con: MS completa positivas y negativas; una resolución de 70.000; un objetivo AGC de 1 x 106; un máximo de 200 ms; y la exploración deseada gama de m/z. Como alternativa, utilice sólo 1 polaridad.
3. elaboración de instrumento, solventes y tejido vegetal
Nota: Siempre use guantes y no utilizar tejido de la planta que se ha manejado con las manos desnudas. De lo contrario, los iones contaminantes tales como polietilenglicol dominará los espectros.
- Traer los tejidos de la planta para el análisis de la misma habitación que el sistema de MS para permitir un muestreo rápido.
- Para el tejido de la planta que no tenga una punta natural, utilice una cuchilla de afeitar en un portaobjetos de vidrio para cortar un punto cónico (figura 2). Determinar la cantidad de tejido necesario para el análisis basado en la sensibilidad del instrumento, tipo de tejido y del interés establecidos (p. ej., un joven S. tortuosum es ~ 5 m m en longitud de la hoja).
- Corte S. tortuosum sale a 10 semanas después de la germinación en tiras finas, cada una con un extremo cónico para formar un punto.
- Utilice pinzas para seleccionar con cuidado el tejido de la planta en el extremo que se sujeta. Sostiene el tejido con pinzas, cuidadosamente transferirlo a la abrazadera.
PRECAUCIÓN: No toque la fuente de instrumento si el voltaje está en. - Ajusta el brazo flexible y el alambre con la pinza para colocar el tejido en consonancia con la entrada de MS para que la distancia entre el tejido de la planta y la entrada de iones de la MS es de 5-10 mm para el triple cuadrupolo (p. ej., TSQ) y lineal de la trampa quadrupole (LTQ) y 10 -50 mm para la trampa del ion analizador de masa(por ejemplo, el orbitrap)8.
- Enchufe el extremo opuesto del cable en la fuente. Si los primeros intentos de producen una intensidad de señal baja, mover el tejido de la planta más cercana a la entrada de iones (véase la discusión para optimización).
- Cargar el fichero; nombre del archivo de datos y configurar la ubicación de almacenamiento de archivo. Luego encienda el sistema de MS haciendo clic en jugar y haz clic en iniciar para comenzar a adquirir datos.
- Aplicar un solvente (por ejemplo, metanol) utilizando una pipeta con una punta de carga de gel para maximizar la distancia entre las manos y el alto voltaje para proteger al usuario.
Nota: El volumen de solvente requerido depende del tamaño, secado y textura del tejido, típicamente ~ 2-20 μl. S. tortuosum hojas no requieren ningún tipo de disolvente a añadir. Aplique cuidadosamente el solvente y no toque la fuente del instrumento cuando el voltaje es en. Utilizar disolventes de grado LC-MS y cristalería que ha sido lavado ácido y es libre de detergentes. En algunos tejidos, se puede observar una señal sin la adición de un disolvente debido al contenido natural de agua de los tejidos de la planta. Sin embargo, una mayor intensidad de la señal y menor S/N por lo general se logra mediante la aplicación de un solvente al tejido. - Adquirir datos como la señal persiste o hasta que se han recopilado los espectros adecuados, normalmente 30-60 s. Si es necesario, aplique solvente adicional para mantener una intensidad de señal de alto para un período más largo de tiempo. Detener la adquisición de datos y el sistema de MS de pausa.
- Retire el tejido y lave la abrazadera con metanol al 100% y un trapo sin pelusa. Limpiar la entrada de iones MS después de aproximadamente 1-2 h de la adquisición por el aerosol de hoja em según especificaciones del proveedor. También, limpie la entrada de iones de MS entre el análisis de los tipos de tejido diferentes.
4. evaluación de la calidad de datos
- Abra el archivo de datos y visualmente el cronograma total de pico base. Compruebe que la intensidad de señal es ~1.0 x 107 a 5.0 x 108. Si la señal es inferior, mueva el tejido más cercano a la entrada de iones. Si, el extremo delantero del sistema MS a ser sucio, así que mueva el tejido más lejos de la entrada de iones.
- Basado en la presencia o ausencia de los iones de interés en los espectros de masas producido, alterar los parámetros.
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
5. tándem masas fragmentación
- Decidir cuáles son los iones de interés para la fragmentación de masas tándem (MS/MS); una señal de espectros de masas que es > 1.0 x 105 es suficiente para la selección de iones para MS/MS.
- Hacer un nuevo archivo de método con una lista de inclusión de m/z hacia fuera con 4 decimales. Haga clic en lista Global y la inclusión. En propiedades de PRM, active la energía de fragmentación [por ejemplo, energía de la colisión normalizado (NCE) de 30-50 es un buen rango para empezar] y otros parámetros de MS/MS.
- Para obtener datos de la MS/MS para mesembrine alcaloides, fragmento de los siguientes iones, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zy 292.1897 m/z, NCE 35.
Nota: La adquisición de datos de MS/MS puede realizarse inmediatamente después de la MS o más tarde. El mismo tejido a menudo puede permanecer sujeta a un MS completo y puede ser reutilizado para adquirir MS/MS datos. Sin embargo, si una matrícula no presenta una señal suficiente, utilice un nuevo tejido.
- Para obtener datos de la MS/MS para mesembrine alcaloides, fragmento de los siguientes iones, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zy 292.1897 m/z, NCE 35.
- Carga el fichero MS/MS y un archivo de datos llamado. En el sistema de MS y adquisición de datos, agregando un solvente si es necesario. Cuando espectros adecuados han sido recogidos, típicamente después de 30-60 s, detener la adquisición.
- Recoger la fragmentación en muchos diferentes energías al asignar los iones fragmento.
Nota: Puesto que el aerosol de hoja MS carece una separación cromatográfica, los espectros de fragmentación son probables contener muchos iones y fragmentando en diferentes energías ayudará a traer claridad.
6. supuestas identificaciones por fragmentación masa masa exacta y tándem
- Hacer supuestas identificaciones por hacer referencia a las medidas exactas de masas desde bases de datos públicamente disponibles del metabolito como Metlin21, base de datos de Metabolome humano22, Banco de masa23, mapas de lípidos24, Instituto Nacional de Normas y tecnología MS búsqueda25, respeto de fitoquímicos26o27de PNB.
- Como estas bases de datos no son exhaustivos, realizar una revisión de la literatura adicional sobre las especies de plantas químicamente caracterizadas según sea necesario.
- Iones de fragmentación partido de hoja aerosol MS/MS a las mencionadas bases de datos cuando se dispone de información de MS/MS, o a la literatura. Como alternativa, utilizar una interpretación manual de iones fragmento de MS/MS o una fragmentación de una auténtica norma realizada por la inyección directa o LC-MS/MS.
7. Análisis de datos
- Convertir los archivos raws de MS mzXML archivos con la herramienta de msConvert de Proteowizard28.
- Utilice el paquete de software XCMS implementado en R para picking de picos. Utilizar una infusión directa método para el aerosol de hoja em análisis de proceso.
Nota: Los scripts bien anotados utilizados para procesamiento de datos pueden encontrarse en https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code. - Para obtener medidas semi cuantitativas, representa la variabilidad experimental, normalizar la intensidad de cada metabolito por el actual total del ion (TIC), como el rociado de hojas MS intensidad de la señal puede variar, en parte debido a ligeras variaciones en el posicionamiento de la hoja en la fuente y las diferencias en tamaño y forma de la hoja.
- Como alternativa, utilizar suministradas por el proveedor de software para el análisis de los datos o MZmine2 (que se encuentra en http://mzmine.github.io/)29.
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Representative Results
En 10 semanas efecto invernadero aumentado después de la germinación, recién recogidos S. tortuosum deja se analizaron mediante pulverización foliar MS. El flujo de trabajo experimental para la detección de metabolitos de S. tortuosum hojas hoja aerosol que MS se ilustra en la figura 2. Una hoja fue seleccionada, cortar una tira delgada con un extremo cónico para formar un punto y afianzado con abrazadera con el aerosol de hoja em alambre abrazadera aparato. El tejido de la planta se coloca ~ 30 m m de la entrada de iones y en consonancia con los ejes x y y. Sobre la iniciación de la pulverización de la hoja que deja MS de S. tortuosum , se detectaron iones sin el uso de cualquier solvente. Las plantas de la familia Sceletium son suculentas con hojas gruesas con un alto contenido de agua que permite la ionización por electrospray por pulverización de hojas MS sin la aplicación externa de un solvente. Sin embargo, más generalmente, los tejidos vegetales requieren una aplicación de solvente para detectar iones.
Un cronograma total y densamente poblados con iones de espectros de masas fueron producidos después de 30 s de adquisición en modo de ionización positivo (figura 3). El cronograma representa un spray foliar exitosa MS experimento donde una señal estable se mantuvo para la duración completa de la adquisición. En este estudio, un total de nueve mesembrine alcaloides fueron detectados por el aerosol de hoja EM y supuestas identificaciones fueron hechas de la masa exacta de los iones protonada de previamente caracterizado compuestos (tabla 1)30. Es ventajoso realizar rociado de hojas MS en un alta resolución, precisa masa (HRAM) Espectrómetro de masas, que permite resolver las masas ligeramente diferentes. Por ejemplo, m/z en 262.1794 podría ser identificado supuestamente como dihydrojoubertiamine en vez de mesembrenone-m (demethyl - dihidro-), que habría sido en el m/z 262.1443.
El tejido de la hoja seguía siendo sujeta de una fragmentación de (MS/MS) masa tándem de algunos iones de interés (tabla 1). La figura 4 muestra tres ejemplos de espectros de fragmentación MS/MS de aerosol de hoja em, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zy 292.1897 m/z. Supuestas identidades fueron verificadas por fragmentos de masa y confirmadas con fragmentos previamente identificado30. El ion protonado de 276.1583 m/z fue identificado como dos isómeros diferentes de mesembrine M (demethyl) y otro dos isómeros del mesembrenone-M debido a la presencia de fragmentos de diagnóstico para cada isómero (tabla 1).
Mesembrine y mesembrine-M (dihidro-) fueron detectados por el aerosol de hoja EM y supuestamente identificados por masa exacta, así como por la fragmentación de masas. El ion protonado de mesembrine en 290.1742 m/z es uno de los iones más abundantes en el espectro; por lo tanto, puede ser un posible candidato como un biomarcador para futuros estudios. Los dos alcaloides principales de S. tortuosum son mesembrine y mesembrenone, que fueron fácilmente detectados por spray de hoja em. Varios de los compuestos detectados por el aerosol de hoja que em puede ser útil en el seguimiento de materiales vegetales de Sceletium y productos derivados.
Figura 1: Diagrama de aerosol MS hoja de configuración. Hoja aerosol MS es un metabolito perfiles método que permite la rápida toma de muestras de tejido de la planta intacta. El diagrama muestra un aerosol foliar MS con kV alto voltaje aplicado con una abrazadera y la opción de aplicar un disolvente para el tejido de la planta. Aerosol de hoja em facilita la ionización por electrospray directamente en el tejido de la planta en la entrada de MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: flujo de trabajo de pulverización foliar MS experimento. Tejido de la planta seleccionada, una hoja Sceletium tortuosum , fue corta, después transferido con pinzas sujeta, y luego colocado al frente de la entrada de iones antes de la adquisición de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfil de metabolito de Sceletium tortuosum por spray de hoja em con ionización positiva. (A) este panel muestra un spray de hoja em masa cronograma de ion total count (TIC). Para cada pico, el número superior es el tiempo (min) y la parte inferior es m/z. (B) este panel muestra el spray de hoja perfil metabolito de espectro de masa positivo Sceletium tortuosum . El recuadro muestra 260-295 m/z. Informan masas precisas 4 decimales con un error < 6 ppm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Hoja aerosol MS ionización positiva tandem espectrometría de masas de Sceletium tortuosum corta hoja. Estos paneles muestran los espectros masa tándem (MS/MS) en modo de ionización positivo con spray de hoja MS. Putative identificación de alcaloides se hace de la masa exacta y fragmentación masiva para los siguientes: (A) mesembrine-M y mesembrenone M isómeros, mesembrine (B) y (C) mesembrine-M (dihidro-). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Compuesto | Fórmula molecular | Masa de Monoisotopic medido m/z [M + H] | error de ppm | Fragmentos de |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23NO2 | 262.1794 | 5.0 | N / A |
| Mesembrenone-M (O - demethyl-) | C16H19NO3 | 274.1431 | 4.5 | N / A |
| Mesembrine-M (O - demethyl-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Mesembrine M (N - demethyl-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone-M (O-demethyl - dihidro-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 124, 205, 218, 227, 245 |
| Mesembrenone-M (N-demethyl - dihidro-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 120, 151, 210, 229, 241 |
| Mesembrenone | C17H21NO3 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Mesembrine | C17H23NO3 | 290.1742 | 4.9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Mesembrine-M (dihidro-) | C17H25NO3 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
Tabla 1: identificación supuesta de Sceletium tortuosum mesembrine alcaloides por aerosol hoja MS. Esta tabla informa sobre las masas exactas de ionización positiva y los iones fragmento para Sceletium tortuosum mesembrine alcaloides.
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Discussion
El uso acertado de este protocolo se basa en la optimización de varios pasos de especies de plantas, tipo de tejido y establecidos de objetivo de interés. Los parámetros descritos en el protocolo proporcionan un buen punto de partida. Las siguientes decisiones experimentales tienen que ser hecho y probado: si o no al uso (1) corte o sin cortar tejido y (2) solvente o no solvente, (3) qué disolvente utilizar y en qué volumen, (4) lo que la distancia del tejido a partir de la entrada de iones debe ser y (5) la amplitud de la tensión. El objetivo de optimización es encontrar las condiciones que producen una señal continua que persiste por al menos 30 s unos minutos. Las condiciones deben proporcionar una intensidad de señal adecuada y reproducible, que es necesario realizar mediciones de MS/MS y masa exacta. Intensidad alta de la señal se obtiene mediante un aerosol exitoso y confiable de los iones del tejido. La calidad del aerosol depende de la agudeza de la punta del tejido mirando hacia la entrada de iones, la distancia entre la punta de la entrada del tejido y ion y la tensión eléctrica aplicada. Un spray de éxito es altamente dependiente de la agudeza del punto de la punta del tejido y, en algunos casos, se debe cortar el tejido para formar una punta. En particular, ligeras alteraciones en la agudeza del ángulo de la forma cónica en la punta del tejido cortado tienen efectos significativos sobre la calidad resultante de la ionización y por lo tanto la intensidad produce7. En casos donde los tejidos se señalan ya, entonces no hay corte es necesario, como es el caso con las hojas de hierba y hojas en forma de lanceta5,13.
Una señal de iones puede ser suprimida e inestable cuando ocurre la descarga de plasma de los tejidos como resultado de ser colocado demasiado cerca a la entrada de iones o la tensión es demasiado alta. Un posicionamiento adecuado del tejido y una selección de la tensión eléctrica se requieren para garantizar una pulverización estable y consistente entre las muestras. La distancia del tejido de la entrada de iones MS también afecta a la calidad y cantidad de señal producida. En general, una muestra de tejido más pequeñas debe colocarse más cerca de la entrada, aunque tejido de pequeño tamaño podría no resultar en una intensidad baja de la señal si la punta es muy acentuada o los compuestos son altamente concentrados. La intensidad y la consistencia de los espectros deben optimizarse empíricamente comparando varias posiciones de colocación a lo largo del eje z. Es fundamental para una adecuada ionización que el tejido vegetal está alineado con la entrada de iones de la MS en tanto los ejes x y. Sin embargo, si el tejido de la planta es excesivamente cerca de la entrada de iones, esto puede requerir una limpieza más frecuente de la óptica del ion y el extremo delantero del sistema MS.
El volumen de solvente aplicado en la parte superior del tejido puede variar desde 0 - 50μl dependiendo el contenido de agua y el tamaño de la muestra de tejido. En los casos donde el tejido es extremadamente alto en contenido de agua y se corta, como en el caso de las suculentas Sceletium, no puede añadirse ningún solvente. Sin embargo, es más típico para utilizar al menos 5-10 μl del solvente para por lo menos una aplicación. La adición de un solvente es necesaria cuando se utiliza un tejido seco o tejido fresco con un contenido de agua baja para facilitar el rociado. Si se utiliza una pequeña cantidad de solvente en un pedazo grande de material vegetal, probablemente será absorbido sin producir un rocío suficiente. Por el contrario, si se utiliza un volumen demasiado alto, compuestos pueden diluirse o desolvation correcta no se producirá fácilmente y eficientemente. Una opción alternativa para pipeteo manual solvente es aplicar continuamente solvente al tejido por medio de una bomba de la jeringuilla para que se agote el decae la señal observada en función del tiempo que el compuesto del material de planta10. Varios tipos de solventes deben ser juzgados, y los espectros resultantes compararon para verificar cualquier mejora de la cantidad y consistencia de la ion(s) para del interés, establecidos. La adición de un solvente no sólo produce aerosol pero también puede proporcionar una selectividad para la extracción de compuestos diferentes. Orgánicos solventes con diferentes polaridades (metanol, diclorometano, hexanes, acetonitrilo, cloroformo y acetona) se han comparado y resultan significativamente diferentes iones presentes en los espectros de una semilla de maní8. En general, el metanol es una buena primera opción solvente, como se ha demostrado que funciona bien para muchos tejidos de plantas y una amplia gama de fitoquímicos, incluyendo los aminoácidos, alcaloides, flavonoides, carbohidratos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y fosfolípidos8. La aplicación del 100% de agua en los tejidos de la planta sin cortar no normalmente funciona bien pero puede mejorarse con la adición de sales10. En muchos casos, además de iones protonada de un compuesto, otros abundante aductos son detectados como sodio y potasio aductos. La presencia de estos sal aductos es incluso más frecuente cuando la sal se añade al disolvente y puede ser ventajoso. Por ejemplo, un aumento de la sensibilidad y selectividad de glucósidos fenólicos de Populus especie se observaron con la adición de iones sodio y potasio a la solvente aplicado10.
Dos limitaciones principales de la pulverización de la hoja técnica de MS son (1) (2) desafíos cuantificación y rango dinámico bajo. Normalmente, sólo los compuestos más abundantes son ionizados y detectados por la técnica. Disminuciones en la eficiencia de ionización debido a la supresión de iones que ocurre significativamente en la ausencia de separación cromatográfica están a menos de una edición con abundantes metabolitos. Para evitar esta limitación, se puede ajustar el rango de exploración centrarse en solamente la gama de m/z de interés. Sin embargo, compuestos de baja abundancia todavía no puedan ser detectados sin la separación y concentración por cromatografía. A diferencia de la típica cuantificación de compuestos a partir de un extracto, estándares internos no ser correctamente mezclados en el material vegetal antes de la pulverización de la hoja medidas MS. Semi-Quantitative y concentraciones relativas han sido obtenidas mediante la colocación de un conocido concentración de una solución estándar en la superficie del tejido y luego dejándola secar antes de un aerosol de hoja MS análisis8,9,31. Por ejemplo, el método de adición estándar de cuantificación se utilizó para calcular la proporción del ion del representante para el estándar interno a los iones de interés para determinar las cantidades relativas de32. Una curva de calibración se utilizó para estimar la concentración relativa. Usando este método, fue posible comparar la proporción de los diferentes glucósidos a un interno rebaudioside estándar, D, y la concentración relativa de glicósidos específicos podría calcularse entonces dentro de Stevia hojas33. Alternativamente, una cuantificación más precisa es posible con un isotópicamente etiquetado estándar del compuesto de interés, aunque la disponibilidad comercial puede ser un desafío. El uso de tejido vegetal metabólicamente etiquetado también puede mejorar la cuantificación con este método34.
Dado que LC-MS/MS convencional requiere una amplia preparación y separación cromatográfica, otros métodos de análisis se desean a menudo. Hojas spray MS es una técnica de análisis químico directo que puede aplicarse fácilmente y ofrece simplicidad, precisión, exactitud y detección rápida de metabolitos y la cuantificación. Por esta razón, se investigó la conveniencia de spray hoja MS para controlar el contenido químico de S. tortuosum, que puede proporcionar la base para herramientas chemotaxonomic diferenciar las especies del género Sceletium basado en Bioquímica firmas. Varias propiedades anatómicas de esta planta hacen un espécimen de prueba ideal para el aerosol de hoja em. Es una suculenta, que contienen altas cantidades de agua, lo cual es ventajoso ya que el spray puede generarse sin el uso de un solvente. Sceletium hoja contiene idioblastos (vejiga-como las células)15 que sirven como reservas de almacenamiento de información donde pueden acumularse metabolitos especializados. Hojas spray MS es una técnica de análisis en vivo para caracterizar tejido vegetal de forma rápida. La técnica general es aplicable a muchas especies de plantas, tipos de tejido y clases de compuestos. Técnicas que capturan información sobre los compuestos de la planta son de gran interés para comprender el metabolismo de la planta primaria y especializada para los usos humanos de salud, nutrición, agricultura y energía35.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la beca del programa de investigación de genoma de planta NSF IOS 1238812 y la Beca Postdoctoral en biología IOS-1400818. El trabajo también fue financiado por una beca de estudiante de postgrado de Monsanto para Katherine A. Sammons. Se agradeció a africanos investigador becarios programa Fulbright (2017-2018) financiamiento otorgado a Nokwanda P. Makunga. Agradecemos la donación de una fuente nanospray de Jessica Prenni y el servicio de proteómica y metabolómica en Colorado State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
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| Plant of interest - S. tortousum |
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