叶片喷雾质谱是一种直接化学分析技术，可最大限度减少样品前处理并省去色谱步骤，从而实现对植物组织中小分子的快速检测。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
植物会产生数千种化学性质各异的小分子。质谱法（MS）是分析植物代谢物的一种强大技术，因其能够以高灵敏度和高特异性提供分子量信息。叶喷雾质谱法是一种常温电离技术，通过电喷雾直接利用植物组织进行化学分析，无需色谱分离步骤。这种代谢物取样方法可同时检测完整植物组织中的多种化学类别，显著减少样品前处理的工作量。当与高分辨率、精确质量的质谱仪联用时，叶喷雾质谱法可实现对目标代谢物的快速检测。该技术还可采集串联质谱碎裂数据，有助于化合物的鉴定。精确质量测定与碎裂图谱相结合，有利于确认化合物的身份。叶喷雾质谱技术仅需对纳米电喷雾电离源进行少量改装，即可成为进一步拓展质谱仪功能的实用工具。本文中，对来自南非的传统药用植物 Sceletium tortuosum（番杏科）的新鲜叶片组织进行了分析；通过叶喷雾质谱法检测到多种美沙明类生物碱。
引言
植物含有多种具有不同化学性质的小分子。质谱法（MS）是一种用于分析植物化合物的强大技术，因其能够以高灵敏度和高特异性提供元素组成，从而实现对代谢物的检测与鉴定1。通常情况下，质谱分析采用溶剂提取的样品，并在质谱分析前通过色谱法进行分离1。然而，液相色谱（LC）的使用往往需要较长的分析时间，且通常伴随复杂的样品前处理过程1。相比之下，无需色谱分离、直接对完整组织进行化学分析的技术具有极高的速度，且样品前处理步骤极少2。因此，在可省略色谱步骤的情况下，直接化学分析具有显著优势。
传统的天然产物与代谢组学研究通常依赖于对干燥或冷冻植物材料进行耗时较长的整体提取，这些材料包含多种组织和细胞类型3。另一种方法是直接化学分析，例如对植物组织中的代谢物进行质谱检测，该方法可实现特定细胞类型的分离，并避免样品制备过程中引入的人为假象4。叶片喷雾质谱（leaf spray MS），也称为组织喷雾（tissue-spray）5,6，是一种直接环境电离质谱技术，几乎无需样品前处理
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 叶片喷雾质谱中纳米喷雾源的改造
- 使用改良的纳米喷雾源进行叶片喷雾质谱分析。由于叶片喷雾质谱无需任何流体组件，可通过从源中移除液相色谱探针来改装该源。
- 组装叶片喷雾质谱导线，该导线将通过合适的插针连接至源，用于向植物组织施加电压。将插针焊接到绝缘导线的一端，另一端焊接一个夹子。
注意：夹子（鳄鱼夹型）可带齿或不带齿。对于较小的组织，建议使用无齿夹子。可选择性地在纳米喷雾源上加装带夹子的柔性臂，以辅助定位植物组织。需注意，本方案具体描述的是如何在混合型四极杆离子阱质谱分析系统上进行叶片喷雾质谱（参见材料表）；然而，其他质谱系统也可经改造后用于该技术6。将叶片喷雾质谱与便携式质谱仪联用，可对植物样品进行现场实时化学分析，无需将其运送至实验室19,20。 - 在源下方的地面上放置防静电地垫，以减少使用高电压时源可能产生的电放电现象。
2. 叶片喷雾质谱分析前质谱系统的准备
- 如果系统最近已使用过，请等待其冷却至可触摸温度，并移除任何其他离子源和扫气锥。安装纳米喷雾叶喷雾质谱离子源。
- 创建一个调谐文件，设置适当的电离参数如下：鞘气、辅助气和扫气均设为 0；....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
萌发后10周时，采集温室栽培的 S. tortuosum 新鲜叶片，采用叶片喷雾质谱法（leaf spray MS）进行分析。利用叶片喷雾质谱法检测 S. tortuosum 叶片中代谢物的实验流程如图2所示。选取一片叶片，用剪刀切成一端逐渐变细的细条，形成尖端，并用叶片喷雾质谱专用的金属夹具夹住。将植物组织置于距离离子入口约30 mm处，并与x轴和y轴对齐。启动对 S. tortuosum 叶片的叶片喷雾质谱分析后，在未施加任何溶剂的情况下即检测到离子信号。Sceletium 属植物为多肉植物，叶片厚实且含水量高，其自身水分足以支持在无外加溶剂条件下通过叶片喷雾实现电喷雾电离。然而，大多数植物组织通常需要施加溶剂才能检测到离子信号。
在正离子化模式下采集30秒后，生成了包含大量离子的质谱总离子流图和质谱图（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
成功应用本方案依赖于针对特定植物种类、组织类型及目标化合物对各个步骤进行优化。方案中描述的参数可作为良好的起始点。以下实验条件需要确定并进行测试：（1）使用切割或未切割的组织；（2）是否使用溶剂；（3）选择何种溶剂及其使用体积；（4）组织与离子入口之间的距离；以及（5）电压幅度。优化的目标是找到能够产生持续至少30秒至数分钟连续信号的条件。这些条件应提供足够且可重复的信号强度，以进行精确质量测定和串联质谱（MS/MS）分析。高信号强度依赖于组织中离子喷雾的成功且稳定地产生。喷雾质量取决于指向离子入口的组织尖端的锐利程度、组织尖端与离子入口之间的距离以及所施加的电场电压。成功的喷雾高度依赖于组织尖端的尖锐程度，在某些情况下，需对组织进行切割以形成尖锐的顶端。特别是，切割后组织尖端锥形角度的微小变化，都会显著影响电离效果及所产生的信号强度7。对于本身已具尖端形态的组织，则无需切割，例如禾本科植物叶片或披针形叶片即属此类情况5,13。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国家科学基金会植物基因组研究计划项目 IOS-1238812 和生物学博士后奖学金项目 IOS-1400818 资助。凯瑟琳·A·萨蒙斯获得了孟山都公司研究生奖学金资助。感谢富布赖特非洲研究学者计划（2017–2018）为诺克万达·P·马孔加提供的资助。我们非常感谢杰西卡·普雷尼及科罗拉多州立大学蛋白质组学与代谢组学平台捐赠的纳米喷雾电离源。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 连接针 | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | 针将插入赛默飞世尔科技的源中以提供电压 |
| 小型夹子 | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | 微型铜质鳄鱼夹，5A |
| 大型夹子 | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | 窄型镍质鳄鱼夹，5A |
| 热缩管 | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | 用于覆盖焊接接头 |
| NSI 源 纳米喷雾电离源 | Thermo scientific | NA | 如果您不使用赛默飞世尔科技的仪器，则可使用其他品牌 |
| Q Exactive-混合四极杆Orbitrap | Thermo scientific | NA | 如果您不使用赛默飞世尔科技的仪器，则可使用其他品牌 |
| Tune 软件 | Thermo scientific | 如果您不使用赛默飞世尔科技的仪器，则可使用其他品牌 | |
| Xcalibur 软件 | Thermo scientific | ||
| 目标植物 - S. tortousum |
参考文献
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass s....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
