Summary
Leaf spray masspektrometri är en direkt kemisk analys teknik som minimerar provpreparering och eliminerar kromatografi, vilket möjliggör snabb påvisande av små molekyler från växt vävnader.
Abstract
Växter producerar tusentals små molekyler som är olika i deras kemiska egenskaper. Masspektrometri (MS) är en kraftfull teknik för att analysera växt metaboliter eftersom det ger molekylvikter med hög känslighet och specificitet. Leaf spray MS är en omgivande jonisering teknik där växtvävnad används för direkt kemisk analys via elektrospray, eliminera kromatografi från processen. Detta förhållningssätt till provtagning metaboliter möjliggör ett brett spektrum av kemiska klasser att upptäckas samtidigt från intakt växt vävnader, minimera mängden provberedning krävs. När den används med en hög upplösning, exakt samlas MS, underlättar leaf spray MS snabb upptäckt av metaboliter av intresse. Det är också möjligt att samla in tandem mass fragmentering data med denna teknik för att underlätta en sammansatt identifiering. Kombinationen av noggranna massa mätningar och fragmentering är fördelaktigt i bekräftar sammansatta identiteter. Leaf spray MS teknik kräver endast mindre ändringar av en nanospray jonisering källa och är ett användbart verktyg för att ytterligare utöka funktionerna i en masspektrometer. Här, analyseras färska bladvävnad från Sceletium tortuosum (isörtsväxter), en traditionell medicinalväxt från Sydafrika, talrika mesembrine alkaloider upptäcks med leaf spray MS.
Introduction
Växter innehåller ett brett utbud av små molekyler med olika kemiska egenskaper. MS är en kraftfull teknik för att analysera växt föreningar eftersom det kan ge elementär kompositioner med hög känslighet och specificitet för detektering och identifiering av metaboliter1. Vanligast, utförs MS på lösningsmedel-extraherade prover, som skiljs åt genom kromatografi innan MS analys1. Dock användningen av vätskekromatografi (LC) kräver långa analys gånger och förknippas ofta med ett omfattande prov förberedelse1. Däremot direkt kemisk analys av intakta vävnader som kringgår kromatografi är en mycket snabb teknik, som kräver minimal prov förberedelse2. Således, i fall där kromatografiska steg kan vara efterskänks, en direkt kemisk analys kan vara mycket fördelaktigt.
Typiska LC-MS för naturliga produkter och metabolomik forskning bygger på långa bulk extraktioner av torkad eller fryst växtmaterial som innehåller flera vävnader och cell typer3. Alternativt kan direkt kemisk analys, till exempel MS påvisning av metaboliter från växtvävnad, isolera celltyper och undvika förberedelse artefakter4. Leaf spray MS, även kallad vävnad-spray5,6, är en direkt omgivande jonisering MS-teknik, vilket kräver i princip inget prov förberedelse5,7. Leaf spray MS är nära besläktad med papper spray MS, en omgivande jonisering teknik med egenskaper av elektrospray jonisering som möjliggör upptäckt av analyter som deponeras på papper7. Trots namnet, leaf spray MS är tillämplig på olika typer av växt vävnader, inte bara lämnar och har visat på frukt, frön, rötter, blommig vävnader och knölar, bland annat6,8,9, 10,11,12. Tekniken underlättar joniseringen av endogena fytokemikalier direkt från växtmaterial i massa spektrometern för upptäckt8. Leaf spray MS kan också ge information om den rumsliga fördelningen av kemikalier i olika vävnadstyper i växter13. När leaf spray MS jämförs med vätskeextraktion och LC-MS, tyder resultaten leaf spray MS möjliggör snabb påvisande av surface metaboliter från unika celltyper som trichomes13. Figur 1 illustrerar leaf spray MS experimental set-up. Direkta elektrospray jonisering uppstår efter endast smärre källa ändringar. En hög spänning appliceras på anläggningen vävnad via en metall klämma, producerar en spray med mycket laddad droppar bildar en Taylor-kon som bär jonerna till den MS. Electrospray ion inlopp jonisering uppstår från den naturliga vätskan av växten eller den lösningsmedel appl IED anläggning yta. En spetsig spets på vävnad underlättar elektrospray och kan vara naturligt förekommande eller skapas genom att skära.
Leaf spray MS är en snabb metod för kvalitativ och semikvantitativ analys av intakt växt vävnader som har hittat verktyget för en mängd olika applikationer. Tekniken har till exempel använts för att upptäcka endogena föreningar att skilja besläktade arter, och även att utvärdera förändringar i samma art odlas under olika förhållanden. Tidigare studier har visat detta synsätt genom att mäta metaboliter i beautyberry (Callicarpa L.) 12 och amerikansk ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. i det senare exemplet ginsenosider, aminosyror och oligosackarider kunde detekteras efter vätning raw ginseng vävnad. Vilda och odlade amerikansk ginseng var åtskilt från knölen skivor6. Ginseng tuber integriteten bevarades efterföljande blad spray MS, som möjliggjorde en efterföljande morfologiska och mikroskopisk inspektion6. Dessutom kan exogena föreningar på växtprover också upptäckas. Ett antal bekämpningsmedel (acetamiprid, difenylamin, imazalil, linuron och tiabendazol) har upptäckts på skal eller massa av frukt och grönsaker9. Medan dessa studier och många andra har visat nyttan av leaf spray MS för olika specifika ändamål, har ett detaljerat protokoll inte tidigare rapporterats.
Här kommer protokollet beskrivningen inte fokuserar på optimering av metoden för en specifik vävnad eller sammansatta. Snarare, detektion av mesembrine alkaloider från Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (isörtsväxter) används som ett exempel för att diskutera de nödvändiga optimering åtgärder som bör vidtas när du konfigurerar ett blad spray MS experiment för en art, vävnad, eller andra för första gången. S. tortuosum är en saftiga ingår i släktet regionen halvtorra Karroo i Sydafrika. En traditionell medicin av San och Khoi Khoi bemannar, det användes för aptit och törst dämpning samt när det gäller dess psykotropa och analgetiska effekter14,15. För närvarande används standardiserade extrakt för behandling av neuropsykiatriska och neuropsykologiska störningar16,17. De primära föreningarna av intresse inkluderar den alkaloiden mesembrine och dess derivat, varav många finns också i relaterade Sceletium arter15. Både vilda och odlade populationer av S. tortuosum har varierande koncentrationer av mesembrine alkaloider, alltså presentera en kvalitetskontroll utmaningen18. En metod för snabb påvisande av mesembrine alkaloider, såsom blad spray MS, kan vara användbar i övervakning Sceletium produkter. Eftersom tidigare, det hade ingen detaljerad visuell experimentellt protokoll för leaf spray MS teknik, vi kommer att illustrera metoden i exemplet med S. tortuosumoch följande beskrivs: ändring av en nanospray källa, den urval och förberedelse av växt vävnader, förvärvet av data, tolkningen av resultaten och optimering av parametrarna MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ändringar av Nanospray källa för Leaf spraya MS
- Använda en modifierad nanospray källa för leaf spray MS. Eftersom inga fluidic komponenter är nödvändiga för leaf spray MS, modifiera källkoden genom att ta bort sonden LC från källan.
- Montera leaf spray MS tråd som kommer att gälla växt vävnaden med lämpliga pin för att koppla in källan spänningen. Löda pin till ena änden av en isolerad ledare; löda en klämma till den motsatta änden av tråden.
Obs: Klämman (alligator clip typ) kan eller kan inte ha tänder. För små vävnad är en klämma utan tänder att föredra. En valfri flex arm med en klämma kan läggas till nanospray källan att hjälpa positionering växt vävnaden. Observera att detta protokoll specifikt beskriver hur du utför leaf spray MS på en massa analyzer för hybrid quadrupole ion trap MS system (se Tabell för material). andra MS-system kan dock ändras för att utföra denna teknik6. Koppling leaf spray kan MS med en bärbar masspektrometer realtid kemisk analys utföras på plats utan att behöva transportera växtmaterial till laboratoriet19,20. - Placera en anti-statisk golvmatta på golvet nedanför källan till minska den elektrisk urladdning som kan uppstå från källan när du använder höga spänningar.
2. beredning av MS systemet för Leaf Spray MS
- Om systemet har nyligen varit i bruk, låta det svalna till touch och ta bort någon alternativ källa och sopa konen. Fäst nanospray leaf spray MS källan.
- Skapa en tune fil med lämpliga jonisering parametrarna som ställts enligt följande: slida, extra och bärargas till 0; spray spänningen till 2-5 kV; Kapillär temperaturen till 150-250 ° C; och S-objektiv RF nivå till 50. Spara filen tune med önskade parametrar8,13. Optimera den spänning och temperatur för bästa joniseringen av vävnad och andra sevärdheter.
Obs: Bra utgångspunkter är 4 kV och 200 ° C. - Göra en metod-fil inklusive blad spray MS tune filen med: positiva och negativa full MS; en upplösning på 70.000; ett AGC mål 1 x 106. högst det 200 MS; och önskad scan intervallet m/z. Alternativt, Använd endast 1 polaritet.
3. beredning av Instrument, lösningsmedel och växtvävnad
Obs: Alltid bära handskar, och Använd inte växtvävnad som har hanterats med händerna. Annars kommer främmande joner såsom polyetylenglykol dominerar spektra.
- Ta växt vävnader för analysen till samma rum som det MS-systemet för att möjliggöra en snabb provtagning.
- För växtvävnad som inte har ett naturligt spetsiga tips, Använd ett rakblad på en glasskiva för att skära en avsmalnande punkt (figur 2). Bestämma mängden vävnad som behövs för analys baserat på instrumentet känslighet, vävnadstyp och andra av intresse (t.ex., en ung S. tortuosum blad som är ~ 5 mm i längd).
- Skär S. tortuosum lämnar på 10 veckor efter groning i tunna strimlor, var och en med avsmalnande ände att bilda en punkt.
- Använd tången för att försiktigt välja växt vävnaden i slutet som kommer att spännas. Håller vävnaden med pincett, noggrant överföra det till klämman.
Varning: Vid inte instrumentet källan om spänningen är på. - Justera den flexibla arm och tråd med klämman att placera vävnaden i linje med MS inloppet så att avståndet mellan växtvävnad och MS ion inlopp är 5-10 mm för den tredubbla quadrupole (t.ex., TSQ) och linjär fälla quadrupole (LTQ) och 10 -50 mm för ion trap massa analyzer (t.ex., orbitrap)8.
- Anslut den andra änden av kabeln till källan. Om de första försöken producera en låg signalintensitet, flytta växt vävnaden närmare till inloppet ion (se diskussion för optimering).
- Ladda filen metod; namnge filen och ange fillagringsplatsen. Sedan slå på MS systemet genom att klicka på spela upp och klicka på Starta för att börja skaffa data.
- Tillämpa ett lösningsmedel (t.ex., metanol) använder en Pipettera med en gel-lastning-tips för att maximera avståndet mellan händerna och den höga spänningen att skydda användaren.
Observera: Volymen spädningsvätska som krävs beror på storlek, torrhet och konsistens av vävnad, vanligtvis ~ 2-20 µL. S. tortuosum bladen inte kräver något lösningsmedel ska läggas. Försiktigt applicera lösningsmedlet och vidrör inte instrumentet källan när spänningen är på. Använd LC-MS grade lösningsmedel och glasvaror som varit syra tvättad och är fri av rengöringsmedel. I vissa vävnader, kan en signal observeras utan tillsats av lösningsmedel på grund av naturliga vattenhalten i växtvävnad. Dock uppnås en ökad signalintensitet och minskad S/N vanligen genom att tillämpa ett lösningsmedel på vävnaden. - Uppkopplingstyp så länge signalen kvarstår eller tills adekvat spektra har samlats, vanligen 30-60 s. Om det behövs, applicera ytterligare lösningsmedel för att upprätthålla en hög signalintensitet under en längre tid. Stoppa dataförvärvet och pausa i MS-systemet.
- Ta bort vävnaden och tvätta klämman med 100% metanol och en luddfri torka. Rengöra MS ion inloppet efter ca 1-2 h av förvärvet av leaf spray MS enligt leverantörens specifikationer. Dessutom ren MS ion inloppet mellan analyser av olika vävnadstyper.
4. data kvalitetsbedömning
- Öppna datafilen och inspektera den bas peak massa chronogram. Kontrollera att signalintensitet är ~1.0 x 107 till 5,0 x 108. Om signalen är lägre, flytta vävnaden närmare till ion inloppet. Om den främre änden av MS systemet blir högre, smutsiga, så flytta vävnaden längre från ion inloppet.
- Baserat på närvaron eller frånvaron av joner av intresse i de masspektra produceras, ändra parametrarna.
Obs: Protokollet kan pausas här.
5. tandem Mass fragmentering
- Bestämma vilka joner är av intresse för tandem mass fragmentering (MS/MS); en masspektrum-signal som är > 1,0 x 105 räcker för urvalet av joner för MS/MS.
- Göra en ny metod-fil med en lista av m/z ut till 4 decimaler. Klicka på globala listor och inkludering. Välj den fragmentering energin i egenskaperna för PRM[e.g., normaliserade kollision energi (NCE) 30-50 är ett bra utbud till att börja med] och andra MS/MS-parametrar.
- För att få MS/MS data för mesembrine alkaloider, fragment av följande joner, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zoch 292.1897 m/z, på NCE 35.
Obs: MS/MS dataförvärvet kan utföras omedelbart efter MS eller vid ett senare tillfälle. Samma vävnaden kan ofta förbli spänns efter en full MS och kan återanvändas för att förvärva MS/MS data. Men om en lackeringsarbeten inte ger en tillräcklig signal, använda en ny vävnad.
- För att få MS/MS data för mesembrine alkaloider, fragment av följande joner, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zoch 292.1897 m/z, på NCE 35.
- Ladda filen MS/MS metod och en namngiven fil. Slå på MS systemet och starta förvärvar data, lägga till en vätska om det behövs. När tillräcklig spectra har samlats in, vanligtvis efter 30-60 s, sluta förvärvet.
- Samla in fragmentering på många olika energier när du tilldelar fragment joner.
Obs: Eftersom leaf spray MS saknar en kromatografisk separation, fragmentering spektra sannolikt innehåller många joner och fragmentera på olika energier kommer att hjälpa till att bringa klarhet.
6. förmodad identifieringar av korrekt massa och Tandem Mass fragmentering
- Gör förmodad identifieringar genom att referera till korrekt massa mätningar från allmänt tillgängliga metabolit databaser såsom Metlin21, mänskliga bröstmjölkssammansättningen databas22, massa Bank23, Lipid kartor24, Konjunkturinstitutet Standarder och teknik MS Sök25, respekt för fytokemikalier26eller BNI27.
- Dessa databaser är inte uttömmande, utföra en ytterligare litteraturstudie på de växtarter som kemiskt kännetecknas som behövs.
- Matchen fragmentering joner från leaf spraya MS/MS i ovan nämnda databaser när MS/MS information är tillgänglig, eller till litteraturen. Alternativt använda en manuell tolkning av MS/MS fragment joner eller en splittring av en autentisk standard utförs av direktinsprutning eller LC-MS/MS.
7. dataanalys
- Konvertera MS raw-filer till mzXML filer med verktyget msConvert från Proteowizard28.
- Använda programpaketet XCMS genomförs i R för peak plockning. Använd en direkt infusion bearbetningsmetod för leaf spray MS analys.
Obs: De väl kommenterad skript som används för behandling av personuppgifter kan hittas på https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code. - För att erhålla semikvantitativt mätningar, redovisning för experimentell variationer, normalisera intensiteten i varje metabolit av den totala ion nuvarande (TIC), till leaf spray MS signal intensiteten kan variera, delvis på grund av små variationer i placeringen av blad i källan och skillnaderna i bladform och storlek.
- Alternativt använda leverantör tillhandahåller programvara för analys av data eller MZmine2 (som finns på http://mzmine.github.io/)29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På 10 veckor efter groning, nyligen uppsamlat växthus odlade S. tortuosum lämnar analyserades av leaf spray MS. Experimentell arbetsflödet för att identifiera metaboliter från S. tortuosum lämnar använder blad spray MS illustreras i figur 2. Ett löv valdes, skuren i en tunn remsa med avsmalnande ände att bilda en punkt, och spänns med leaf spray MS klämma glödtråd. Växtvävnad placerades ~ 30 mm från ion inlopp och i linje med x- och y. Vid initiering av leaf spray MS av den S. tortuosum lämnar, upptäcktes joner utan några lösningsmedel tillämpning. Växter i familjen Sceletium är suckulenter med tjocka blad med en hög vattenhalt som möjliggör elektrospray jonisering av leaf spray MS utan externa tillämpning av ett lösningsmedel. Men oftast, kräver växt vävnader ett lösningsmedel för att detektera joner.
En massa chronogram och masspektrum tätbefolkade med joner producerades efter 30 s av förvärvet i positiva joniseringen läge (figur 3). Chronogram representerar en framgångsrik leaf spray MS experimentera där en stabil signal bibehölls under hela förvärvet. I denna studie präglas sammanlagt nio mesembrine alkaloider upptäcktes av leaf spray MS och förmodad identifieringar har gjorts från exakta massan av protonerade jonerna av tidigare föreningar (tabell 1)30. Det är fördelaktigt att utföra leaf spray MS på en högupplöst, korrekt-massa (HRAM) masspektrometer, vilket gör det möjligt att lösa lite olika massorna. Exempelvis m/z på 262.1794 förment kunde identifieras som dihydrojoubertiamine i stället för som mesembrenone-M (demethyl - dihydro-), vilket skulle ha varit på m/z 262.1443.
Bladvävnad återstod spänns för en tandem mass (MS/MS) fragmentering av några joner av intresse (tabell 1). Figur 4 visar tre exempel på MS/MS fragmentering spectra från leaf spray MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zoch 292.1897 m/z. Förmodad identiteter var verifierade av massa fragment och bekräftade med tidigare identifierade fragment30. Protonerade jonen för 276.1583 m/z identifierades som två olika isomerer av mesembrine-M (demethyl) och en annan två isomerer av mesembrenone-M på grund av diagnostiska fragment för varje isomer (tabell 1).
Både mesembrine och mesembrine-M (dihydro-) upptäcktes av leaf spray MS och förment identifieras av exakta massan samt massa fragmentering. Protonerade jonen av mesembrine på 290.1742 m/z är en av de vanligast förekommande jonerna i spektrumet; Därför kan det vara en sannolik kandidat som en biomarkör för framtidsstudier. Två huvudsakliga alkaloiderna av S. tortuosum är mesembrine och mesembrenone, vilka båda var lätt upptäcks av leaf spray MS. Flera av de föreningar som upptäcks av leaf spray MS kan vara användbara vid övervakning av växtmaterial av Sceletium och härledda produkter.
Figur 1: Leaf spray MS diagram över set-up. Leaf spray MS är en metabolit som profilering metod som möjliggör snabb provtagning av intakt växtvävnad. Diagrammet visar en leaf spray MS med kV hög spänning appliceras med en klämma och möjlighet att tillämpa ett lösningsmedel växt vävnaden. Leaf spray MS underlättar elektrospray jonisering direkt från växt vävnaden till MS inlet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: arbetsflöde för leaf spray MS experimentera. Valda växtvävnad, en Sceletium tortuosum blad, var skär, sedan överförs med pincett vara fastklämd och sedan placerad framför inloppet ion före dataförvärvet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Metabolit profilering av Sceletium tortuosum av leaf spray MS med positiva joniseringen. (A) denna panel visar ett blad spray MS totala ion count (TIC) massa chronogram. För varje topp, översta numret är tid (min) och botten är m/z. (B) denna panel visar leaf spray MS metabolit profil av Sceletium tortuosum positiva masspektrum. Infällt visar 260-295 m/z. Till 4 decimaler med en fel < 6 ppm redovisas korrekt massorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Leaf spray MS positiva joniseringen tandem masspektra från Sceletium tortuosum skär blad. Dessa paneler visar tandem masspektrum (MS/MS) samlas in i positiva joniseringen läge med leaf spray MS. Putative identifieringar av alkaloider är gjorda av korrekt massa och massa fragmentering för följande: (A) mesembrine-M och mesembrenone-M isomerer, (B) mesembrine och (C) mesembrine-M (dihydro-). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förening | Molekylformel | Uppmätta Monoisotopic massan m/z [M + H] | ppm fel | Fragment |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23nr2 | 262.1794 | 5.0 | EJ TILLÄMPLIGT |
| Mesembrenone-M (O - demethyl-) | C16H19nr3 | 274.1431 | 4.5 | EJ TILLÄMPLIGT |
| Mesembrine-M (O - demethyl-) | C16H21nr3 | 276.1583 | 5,9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Mesembrine-M (N - demethyl-) | C16H21nr3 | 276.1583 | 5,9 | 109 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone-M (O-demethyl - dihydro-) | C16H21nr3 | 276.1583 | 5,9 | 124, 205, 218, 227 245 |
| Mesembrenone-M (N-demethyl - dihydro-) | C16H21nr3 | 276.1583 | 5,9 | 120, 151, 210, 229 241 |
| Mesembrenone | C17H21nr3 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Mesembrine | C17H23nr3 | 290.1742 | 4,9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Mesembrine-M (dihydro-) | C17H25nr3 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
Tabell 1: förmodad identifieringar av Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider av leaf spray MS. Den här tabellen rapporterar om positiva joniseringen korrekt massorna och fragment joner för Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lyckad användning av detta protokoll är beroende av optimering av olika steg för växtarter, vävnadstyp och mål andra sevärdheter. De parametrar som beskrivs i protokollet ger en bra utgångspunkt. Följande experimentella beslut måste vara tillverkade och testade: om huruvida att använda (1) klippa eller oklippt vävnad och (2) lösningsmedel eller inget lösningsmedel, (3) vilken vätska du använder och i vilken volym, (4) vad vävnad från ion inlopp bör avståndet vara , och (5) spänning amplituden. Målet med optimering är att hitta de villkor som producerar en kontinuerlig signal som kvarstår i minst 30 s till några minuter. Villkoren bör ge en tillräcklig och reproducerbara signalintensitet, som behövs för att utföra exakta massan och MS/MS mätningar. Hög signal intensiteten uppnås via en framgångsrik och pålitlig spray av joner från vävnaden. Spray kvalitet beror på skärpan i spetsen av den vävnad som pekar mot inloppet ion, avståndet mellan spetsen på inloppet vävnad och ion, och den elektriska spänningen som tillämpas. En lyckad spray är starkt beroende av skärpan i punkten av vävnad spetsen och, i vissa fall vävnaden ska klippas för att bilda en spetsig spets. I synnerhet smärre ändringar i skärpan av vinkeln på den koniska formen på spetsen av skära vävnaden har betydande effekter på resulterande kvaliteten på jonisering och thus signalintensitet producerat7. I de fall där vävnader är redan pekade, då är ingen skärning nödvändigt, vilket är fallet med gräs blad eller lancet-formade blad5,13.
En ion signal kan undertryckas och instabil när plasma ansvarsfrihet uppstår från vävnaden till följd av att vara placerade för nära inloppet till ion eller den elektriska spänningen är för hög. En korrekt placering av vävnaden och ett urval av den elektriska spänningen är krävs för att säkerställa en stabil och konsekvent spray mellan prover. Distansera av vävnaden från MS ion inlopp påverkar också kvalitet och kvantitet av signal produceras. I allmänhet bör ett mindre vävnadsprov placeras närmare inloppet, även om små vävnad inte kan resultera i en låg signalintensitet om spetsen är extremt pekade eller föreningarna som är högkoncentrerad. Intensitet och konsekvens av spectra bör optimeras empiriskt genom att jämföra flera placering positioner längs z-axeln. Det är viktigt för en lämplig jonisering att växt vävnaden är i linje med MS ion inloppet i både x- och y. Dock om växt vävnaden är orimligt nära inloppet till ion, kan detta kräva en mer frekvent rengöring av ion optiken och den främre änden av MS systemet.
Volymen spädningsvätska som appliceras ovanpå vävnaden kan variera från 0 - 50µL beroende på vattenhalten och storleken på vävnadsprov. I fall där vävnaden är extremt hög i vattenhalt och skärs, som i fallet med den saftiga Sceletium, kan inget lösningsmedel läggas. Det är dock vanligare att använda minst 5-10 µL av lösningsmedel för minst ett program. Tillsats av lösningsmedel är nödvändigt när du använder torkade vävnad eller färsk vävnad med en låg vattenhalt för att underlätta spray. Om en liten mängd av lösningsmedlet används på en stor bit av växtmaterial, kommer det sannolikt att absorberas utan att producera en tillräcklig spray. Omvänt, om för hög en volym används, föreningar kan spädas eller korrekt desolvering lätt och effektivt kan inträffa inte. Ett alternativ till manuellt pipettering lösningsmedel är att ständigt tillämpa vätska i vävnad via en sprutpump så att de observerade signal förfaller som funktion av tiden som föreningen är utarmat från plant material10. Olika typer av lösningsmedel bör prövas, och de resulterande spectrana jämfört verifierar någon förbättring av kvantiteten och konsekvens av ion(s) för andra av intresse. Tillsats av lösningsmedel inte bara producerar spray men kan också ge en selektivitet för utvinning av olika föreningar. Organiska lösningsmedel med olika polaritet (metanol, diklormetan, hexanes, acetonitril, kloroform och aceton) har jämförts och resultera i betydligt olika joner närvarande i spektra från en jordnöt utsäde8. Metanol är i allmänhet en bra förstaval för lösningsmedel, eftersom det har visat sig fungera bra för många växt vävnader och ett brett utbud av fytokemikalier, inklusive aminosyror, alkaloider, flavonoler, kolhydrater, organiska syror, fettsyror och fosfolipider8. Tillämpningen av 100% vatten på uncut växt vävnader vanligtvis fungerar inte bra men kan förbättras med tillsats av salter10. I många fall, förutom protonerade joner av en förening, andra riklig addukter identifieras såsom natrium och kalium addukter. Förekomsten av dessa salt addukter är ännu vanligare när salt tillsätts lösningsmedlet och kan vara fördelaktigt. Till exempel observerades en ökad känslighet och selektivitet av fenoliska glykosider från Populus -arter med tillsats av natrium och kalium joner till tillämpad lösningsmedel10.
Två stora begränsningar av leaf spray MS teknik är (1) litet dynamiskt omfång och (2) utmaningar med kvantifiering. Normalt är endast de vanligast förekommande föreningarna joniserat och upptäcks av tekniken. Minskningar i jonisering effektivitet på grund av ion dämpningen som uppstår dramatiskt i avsaknad av kromatografisk separation är mindre problem med förekommande metaboliterna. För att kringgå denna begränsning, kan skanningsområde justeras att fokusera på endast m/z spänna av intresse. Dock kan låg-överflöd föreningar fortfarande inte upptäckas utan separation och koncentration som tillhandahålls av kromatografi. Till skillnad från typiska kvantitering av föreningar från extrakt, interna standarder kan inte blandas ordentligt i växtmaterialet innan leaf spray MS. Semi-quantitative mätningar och relativa koncentrationer har erhållits genom att placera en känd koncentrationen av en standardlösning på vävnadsytan och sedan låta det torka före ett löv spraya MS analys8,9,31. Exempelvis användes metoden kvantitering standard tillägg att beräkna förhållandet mellan de representativa ion för den interna standarden till jonen av intresse att bestämma relativa mängder32. En kalibreringskurva användes för att uppskatta den relativa koncentrationen. Med den här metoden, det var möjligt att jämföra förhållandet mellan de olika glykosider till en intern standard, rebaudioside D, och den relativa koncentrationen av specifika glykosider kunde sedan beräknas inom Stevia blad33. Alternativt, en mer exakt kvantifiering är möjligt med en isotopically märkt standard av sammansatta av intresse, även kommersiella tillgången kan vara en utmaning. Användning av metaboliskt märkt växtvävnad kan också förbättra kvantitering med denna metod34.
Med tanke på att konventionella LC-MS/MS kräver en omfattande provberedning och kromatografisk separation, önskas ofta andra metoder för analys. Leaf spray MS är en direkt kemisk analys teknik som enkelt kan tillämpas och erbjuder enkelhet, precision, noggrannhet och snabb metabolit upptäckt och semi kvantifieringsmetoden. Av denna anledning undersökt vi lämpligheten av leaf spray MS att övervaka det kemiska innehållet i S. tortuosum, som kan ligga till grund för chemotaxonomic verktyg för att skilja arterna av släktet Sceletium baserat på biokemiska signaturer. Flera anatomiska egenskaper av denna anläggning gör den en idealisk provkroppen för leaf spray MS. Det är en suckulent, som innehåller höga mängder av vatten, vilket är fördelaktigt eftersom sprayen kan genereras utan tillämpning av ett lösningsmedel. Sceletium blad innehåller idioblasts (urinblåsan-liknande celler)15 som tjänar som lagring reserver där specialiserade metaboliter kan ackumuleras. Leaf spray MS är en in-vivo analys teknik att karakterisera växtvävnad på ett snabbt sätt. Den allmänna tekniken är tillämplig på många växtarter, vävnadstyper och klasser av föreningar. Tekniker att samla in information om växt föreningar är av stort intresse att förstå växt primära och specialiserade metabolismen för människors användning av hälsa, näring, jordbruk och energi35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NSF växt Genome Research Program bidraget IOS-1238812 och den postdoktorsstipendium i biologi IOS-1400818. Arbetet finansierades också ett Monsanto Graduate Student stipendium till Katherine A. Sammons. Fulbright afrikanska forskare forskare programmet (2017-2018) är tackade för finansieringen tilldelas Nokwanda P. Makunga. Vi uppskattar donation av en nanospray källa från Jessica Prenni och proteomik och metabolomik anläggningen vid Colorado State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest - S. tortousum |
References
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
- Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
- Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
- Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
- Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
- Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
- Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
- Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
- Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
- Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
- Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
- Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
- Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
- Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
- Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
- Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
- Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
- Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
- National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
- ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
- GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
- Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
- Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
- Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
- Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
