Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

Leaf spray massespektrometri er en direkte kemisk analyse teknik, der minimerer forberedelsen af prøver og eliminerer kromatografi, giver mulighed for hurtig påvisning af små molekyler fra plantevæv.

Abstract

Planter producerer tusindvis af små molekyler, der er forskellige i deres kemiske egenskaber. Massespektrometri (MS) er en effektiv teknik til at analysere plante metabolitter, fordi det giver Molekylær vægte med høj følsomhed og specificitet. Leaf spray MS er en omgivende ionisering teknik hvor plantevæv bruges til direkte kemisk analyse via electrospray, fjerne kromatografi fra processen. Denne tilgang til prøveudtagning metabolitter giver mulighed for en bred vifte af kemiske klasser skal påvises samtidigt fra intakt plantevæv, minimere mængden af prøveforberedelse nødvendigt. Når det bruges med en høj opløsning, nøjagtige masse MS, muliggør leaf spray MS en hurtig opdagelse af metabolitter af interesse. Det er også muligt at indsamle tandem masse opsplitning data med denne teknik til at lette en sammensatte identifikation. Kombinationen af nøjagtige masse målinger og fragmentering er gavnlige i bekræfter sammensatte identiteter. Leaf spray MS teknik kræver kun mindre ændringer til en nanospray ionisering kilde og er et nyttigt redskab til at udvide funktionerne i et massespektrometer. Her, analyseres friske blade væv fra Sceletium tortuosum (Aizoaceae), en traditionel medicinsk plante fra Sydafrika, talrige mesembrine alkaloider er registreret med blad spray MS.

Introduction

Planter indeholder en bred vifte af små molekyler med forskellige kemiske egenskaber. MS er en effektiv teknik til at analysere plante-forbindelser, fordi det kan give elementært kompositioner med en høj følsomhed og specificitet for detektion og identifikation af metabolitter1. Mest almindeligt, er MS udført på opløsningsmiddel-ekstraherede prøver, som er adskilt af kromatografi før MS analyse1. Men brugen af væskekromatografi (LC) kræver langvarig analyse gange og er ofte forbundet med en omfattende stikprøve forberedelse1. Derimod er direkte kemisk analyse af intakt væv, der omgår kromatografi en meget hurtig teknik, der kræver minimal prøve forberedelse2. Således, i tilfælde hvor kromatografiske trin kan være betalbare, en direkte kemisk analyse kan være meget fordelagtige.

Typiske LC-MS til naturlige produkter og metabolomics forskning bygger på lange bulk ekstraktioner af tørrede eller frosne plantematerialer som indeholder flere væv og celler typer3. Alternativt kan direkte kemisk analyse, såsom MS påvisning af metabolitter fra plantevæv, isolere celletyper og undgå forberedelse artefakter4. Leaf spray MS, også benævnt væv-spray5,6, er en direkte omgivende ionisering MS teknik, som kræver stort set ikke prøve forberedelse5,7. Leaf spray MS er nært beslægtet med papir spray MS, en omgivende ionisering teknik med Karakteristik af electrospray Ionisation, der giver mulighed for påvisning af analysander, der er deponeret på papir7. På trods af navnet, leaf spray MS gælder for forskellige typer af plantevæv, ikke bare blade, og har været vist på frugt, frø, rødder, blomster væv og knolde, blandt andre6,8,9, 10,11,12. Teknikken letter ionisering af endogene fytokemikalier direkte fra plantematerialer i massespektrometer til registrering af8. Leaf spray MS kan også give oplysninger om den geografiske fordeling af kemikalier i forskellige vævstyper i planter13. Sammenlignet blad spray MS med opløsningsmiddelekstraktion og LC-MS, tyder resultaterne blad spray MS giver mulighed for hurtig påvisning af overflade metabolitter fra unikke celletyper såsom trichomes13. Figur 1 illustrerer blad spray MS eksperimentelle set-up. Direkte electrospray Ionisation opstår efter kun mindre kilde ændringer. En høj spænding er anvendt til plantevæv via en metal klemme, producerer en spray af meget ladet dråber danner en Taylor kegle, der bærer ioner til ion indløb af MS. Electrospray ionisering opstår fra den naturlige væske af planten eller fra de opløsningsmiddel appl IED plante overflade. En spids på væv letter electrospray og kan være naturligt forekommende eller skabt ved at skære.

Leaf spray MS er en hurtig metode til kvalitativ og semi-kvantitative analyse af intakt plantevæv, der har fundet nytte for en bred vifte af applikationer. For eksempel er teknikken blevet brugt til at opdage endogene stoffer til at skelne mellem beslægtede arter, og endda til at vurdere ændringer i de samme arter dyrkes under forskellige betingelser. Tidligere undersøgelser har vist denne tilgang ved at måle metabolitter i beautyberry (Callicarpa L.) 12 og amerikansk ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. i sidstnævnte eksempel Ginsenosider, aminosyrer og oligosaccharider kunne påvises efter befugtning rå ginseng væv. Vilde og dyrkede amerikansk ginseng blev differentieret fra knold skiver6. Ginseng knold integritet var bevaret efterfølgende blad spray MS, hvilket gav mulighed for en senere morfologiske og mikroskopisk kontrol6. Derudover kan eksogen forbindelser på planten prøver også påvises. En række pesticider (acetamiprid, diphenylamin, imazalil, linuron og thiabendazol) er blevet opdaget på skræl eller papirmasse af frugt og grøntsager9. Mens disse undersøgelser og mange andre har vist nytten af blad spray MS til forskellige specifikke formål, har en detaljeret protokol ikke tidligere indberettet.

Her, vil protokol beskrivelse ikke fokusere på optimering af metoden for en specifik væv eller sammensatte. Snarere, påvisning af mesembrine alkaloider fra Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) bruges som et eksempel til at diskutere de nødvendige optimering foranstaltninger, der skal træffes, når du opretter et blad spray MS eksperiment for en art, væv, eller forbindelser for første gang. S. tortuosum er en saftige endemiske til regionen halvtørre Karroo i Sydafrika. En traditionel medicin af San og Khoi Khoi folk, det blev brugt til appetit og tørst undertrykkelse såvel som for dets psykotrope og smertestillende effekter14,15. I øjeblikket, anvendes standardiserede ekstrakter til behandling af neuropsykiatriske og neuropsykologiske forstyrrelser16,17. De primære forbindelser af interesse omfatter alkaloid mesembrine og derivater heraf, hvoraf mange er også fundet i relaterede Sceletium arter15. Både vilde og dyrkede populationer af S. tortuosum har varierende koncentrationer af mesembrine alkaloider, således præsentere en kvalitetskontrol udfordring18. En metode til hurtig påvisning af mesembrine alkaloider, såsom blad spray MS, kan være nyttige i overvågningen Sceletium produkter. Fordi tidligere var der ingen detaljerede visuelle forsøgsplan for blad spray MS teknik, vi vil illustrere metoden ved hjælp af eksemplet med S. tortuosum, og følgende er beskrevet: ændring af et nanospray kilde, den udvælgelse og forberedelse af plantevæv, erhvervelse af data, fortolkning af resultaterne, og optimering af MS parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ændringer til Nanospray kilde for blad Spray MS

  1. Brug en modificeret nanospray kilde til blad spray MS. Ingen fluidic komponenter er nødvendige for blad spray MS, ændre kilden ved at fjerne LC sonden fra kilden.
  2. Saml blade spray MS ledning, der vil anvende spændingen på plantevæv med passende pinkoden for at tilslutte i kilden. Lodde pin til den ene ende af en isoleret ledning; lodde en klemme til den modsatte ende af wiren.
    Bemærk: Klemme (alligator klip type) måske eller måske ikke har tænder. For lille væv foretrækkes en klemme uden tænder. En valgfri flex arm med en klemme kan føjes til nanospray kilde til at bistå positionering af plantevæv. Bemærk at denne protokol specifikt beskriver hvordan man udfører blad spray MS på en hybrid Quadrupol ion trap masse analyzer MS system (Se Tabel af materialer); andre MS systemer kan dog ændres for at udføre denne teknik6. Kobling blad spray kan MS med en bærbar massespektrometer real-time kemisk analyse udføres på stedet uden at skulle transportere plantemateriale til laboratoriet19,20.
  3. Placer en anti-statisk gulvet måtten på gulvet under kilden for at reducere den elektrisk udladning, der måtte opstå fra kilden ved hjælp af høje spændinger.

2. forberedelse af MS System for blad Spray MS

  1. Hvis systemet har for nylig været i brug, lade det cool at røre ved og fjerne eventuelle alternative kilde og feje kegle. Vedhæfte nanospray blad spray MS kilde.
  2. Oprette en melodi fil med de relevante ionisering parametre angivet som følger: kappe, medhjælper og feje gas til 0; spray spændingen til 2-5 kV; kapillar temperaturen til 150-250 ° C; og S-objektiv RF-niveau til 50. Gem filen tune med de ønskede parametre8,13. Optimere spænding og temperatur for den bedste ionisering af væv og forbindelser af interesse.
    Bemærk: Gode udgangspunkter er 4 kV og 200 ° C.
  3. Gøre en metode fil herunder blad spray MS tune fil med: positiv og negativ fuld MS; en opløsning af 70.000; et AGC mål 1 x 106. højst det 200 MS; og den ønskede scanning vifte m/z. Alternativt, brug kun 1 polaritet.

3. forberedelse af Instrument, opløsningsmidler og plantevæv

Bemærk: Altid bære handsker, og brug ikke plantevæv, der er blevet håndteret med bare hænder. Ellers, forurenende ioner som polyethylenglycol vil dominere spektre.

  1. Bringe plantevæv for analyse til samme rum som MS systemet skal give mulighed for en hurtig sampling.
  2. For plantevæv, der ikke har et naturligt spids, bruge et barberblad på et glas dias til at skære en tilspidset punkt (figur 2). Stoerrelsen af væv til analysen baseret på instrument følsomhed, vævstype og forbindelser af interesse (f.eks.en ung S. tortuosum blad er ~ 5 mm i længden).
    1. Snit S. tortuosum blade på 10 uger efter spiring i tynde strimler, hver med en tilspidset ende til at danne et punkt.
  3. Bruge tang til at forsigtigt vælge plantevæv enden vil være fastspændt. Holde væv med pincet, omhyggeligt overføre det til klemmen.
    Forsigtig: Berør ikke instrument kilde, hvis spændingen er på.
  4. Justere den fleksible arm og wire med klemme til at placere vævet i overensstemmelse med MS indløb, så afstanden mellem plantevæv og ion indløb af MS er 5-10 mm for den tredobbelte Quadrupol (f.eks.TSQ) og lineær fælde Quadrupol (LTQ) og 10 -50 mm for ion trap masse analyzer (fx, orbitrap)8.
    1. Sæt den modsatte ende af wiren i kilden. Hvis det første forsøg producere et lavt signal intensitet, flytte plantevæv tættere til ion inlet (henvise til diskussionen om optimering).
  5. Indlæse filen metode; nævne datafil og angive fil opbevaring placeringen. Derefter tænde MS systemet ved at klikke på spil og klik på Start for at begynde erhverve data.
  6. Anvend opløsningsmiddel (fx, methanol) ved hjælp af en pipette med en gel-loading tip til at maksimere afstanden mellem hænderne og højspænding at beskytte brugeren.
    Bemærk: Den opløsningsmiddel volumen kræves, afhænger af størrelse, tørhed og tekstur af væv, ~ 2-20 µL. S. tortuosum blade kræver normalt ikke opløsningsmidler, der skal tilføjes. Omhyggeligt gælder opløsningsmidlet og ikke røre instrument kilde når spændingen er på. Brug LC-MS grade opløsningsmidler og glasvarer, der har været acid vasket og er fri for vaske-og rengøringsmidler. I nogle væv, kan et signal observeres uden tilsætning af et opløsningsmiddel på grund af den naturlige vandindhold plante væv. Men en større signal intensitet og reduceret S/N opnås typisk ved at anvende et opløsningsmiddel til væv.
  7. Erhverve data så længe signalet fortsætter, eller indtil de passende spectra er blevet indsamlet, typisk 30-60 s. Hvis det er nødvendigt, gælde supplerende opløsningsmiddel for at opretholde et højt signal intensitet i et længere tidsrum. Stop dataopsamling og pause MS system.
  8. Fjern væv og vaske klemmen med 100% methanol og en fnugfri serviet. Ren MS ion inlet efter ca 1-2 h af erhvervelse af blad spray MS efter leverandørens specifikationer. Også, ren MS ion fjorden mellem analyser af forskellige vævstyper.

4. data kvalitetsvurdering

  1. Åbn datafilen og visuelt inspicere basistoppen masse chronogram. Kontroller, at signalet intensitet er ~1.0 x 107 til 5,0 x 108. Hvis signalet er lavere, flytte væv tættere til ion indløb. Hvis højere, den forreste ende af MS systemet bliver beskidt, så Flyt væv fra ion indløb.
  2. Baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af ioner af interesse i massespektre produceret, ændre parametrene.
    Bemærk: Protokollen kan pause her.

5. tandem masse opsplitning

  1. Beslutte, hvad ioner er af interesse for tandem masse opsplitning (MS/MS); en massespektre signal, der er > 1.0 x 105 er tilstrækkelig for udvælgelse af ioner til MS/MS.
  2. Skabe en ny metode fil med en medtagelsesliste m/z ud med 4 decimaler. Klik på globale lister og integration. Vælg fragmentering energien under egenskaber af PRM, [f.eks.normaliserede kollisionen energi (NCE) af 30-50 er et godt udvalg til at starte med] og andre parametre, MS/MS.
    1. For at få MS/MS data for mesembrine alkaloider, splitte de følgende ioner, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zog 292.1897 m/z, NCE 35.
      Bemærk: MS/MS data erhvervelse kan udføres umiddelbart efter MS eller på et senere tidspunkt. Det samme væv kan ofte være fastspændt efter en fuld MS og kan genbruges for at erhverve MS/MS data. Men, hvis en lastvognschaufføren ikke giver et tilstrækkeligt signal, bruge et nyt væv.
  3. Indlæse filen MS/MS metode og en navngiven datafil. Drej på MS system, og begynde at erhverve data, tilføje et opløsningsmiddel, hvis det er nødvendigt. Når passende spectra er blevet indsamlet, typisk efter 30-60 s, stoppe erhvervelse.
  4. Indsamle fragmentering ved mange forskellige energier, når du tildeler fragmentioner.
    Bemærk: Da blad spray MS mangler et kromatografisk separation, fragmentering spectra er tilbøjelige til at indeholde mange ioner, og fragmentering på forskellige energikilder vil bidrage til at bringe klarhed.

6. formodede identifikationer af nøjagtige masse og Tandem masse opsplitning

  1. Gøre formodede identifikationer af henvisninger nøjagtige masse målinger fra offentligt tilgængelige metabolit databaser såsom Metlin21, menneskelige Metabolome Database22, masse Bank23, Lipid kort24, Statens Institut for Standarder og teknologi MS Søg25, respekt for fytokemikalier26eller BNI27.
  2. Da disse databaser ikke er udtømmende, udføre en supplerende litteraturgennemgang på plantearter kemisk karakteriseret som nødvendigt.
  3. Match fragmentering ioner fra blad spray MS/MS til ovennævnte databaser når MS/MS oplysninger findes, eller til litteraturen. Alternativt kan du bruge en manuel fortolkning af MS/MS fragmentioner eller en fragmentering af en autentisk standard udført af direkte indsprøjtning eller LC-MS/MS.

7. dataanalyse

  1. Konvertere MS rå filer til mzXML med msConvert-værktøjet fra Proteowizard28.
  2. Brug XCMS softwarepakken gennemføres i R peak plukkes. Bruge en direkte infusion forarbejdningsmetode til blad spray MS analyse.
    Bemærk: De godt kommenteret scripts, som bruges til behandling af personoplysninger kan findes på https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. For at opnå semi-kvantitative målinger, tegner sig for den eksperimentelle variabilitet, normalisere intensiteten af hver metabolit af den samlede ion aktuelle (TIC), som bladet spray MS signal intensitet kan variere, delvis på grund af små variationer i positionering af blad i kilden og forskelle i bladform og størrelse.
  4. Alternativt bruge leverandør-forudsat software til analyse af data eller MZmine2 (skal findes på http://mzmine.github.io/)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På 10 uger efter spiring, frisk indsamlede dyrket i drivhus S. tortuosum blade blev analyseret af blad spray MS. Den eksperimentelle arbejdsproces til påvisning af metabolitter fra S. tortuosum blade ved hjælp af blad spray MS er illustreret i figur 2. Et blad blev valgt, skåret i en tynd stribe med en tilspidset ende til at danne et punkt og fastspændt med blad spray MS Glødetrådsapparater klemme. Plantevæv var placeret ~ 30 mm fra ion-fjorden og i overensstemmelse med x- og y-axes. Ved indledningen af blad spray MS af S. tortuosum efterlader blev ioner fundet uden nogen opløsningsmiddel ansøgning. Planter af slægten Sceletium er sukkulenter med tykke blade med et højt vandindhold, der muliggør electrospray Ionisation af blad spray MS uden ekstern anvendelse af opløsningsmiddel. Dog mest typisk kræver plantevæv et opløsningsmiddel program til at opdage ioner.

En masse chronogram og massespektre stærkt befolket med ioner er produceret efter 30 s af erhvervelse i positive ionisering tilstand (figur 3). Chronogram repræsenterer en vellykket blad spray MS eksperimentere, hvor et stabilt signal blev opretholdt i den fulde varighed af erhvervelse. I denne undersøgelse karakteriseret ialt ni mesembrine alkaloider blev opdaget af blad spray MS og formodede identifikation blev foretaget fra den nøjagtige masse af protonated ioner af tidligere forbindelser (tabel 1)30. Det er en fordel at udføre blad spray MS på en høj opløsning, nøjagtig-masse (HRAM) massespektrometer, som gør det muligt at løse lidt forskellige masserne. For eksempel, m/z på 262.1794 derfor kunne identificeres som dihydrojoubertiamine i stedet for som mesembrenone-M (demethyl - dihydro-), hvilket ville have været på m/z 262.1443.

Leaf væv forblev fastspændt til en tandem masse (MS/MS) opsplitning af et par ioner af interesse (tabel 1). Figur 4 viser tre eksempler på MS/MS fragmentering spektre fra blad spray MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zog 292.1897 m/z. Formodede identitet blev bekræftet af masse fragmenter og bekræftet med tidligere identificerede fragmenter30. Protonated ion af 276.1583 m/z blev identificeret som to forskellige isomerer af mesembrine-M (demethyl) og en anden to isomerer af mesembrenone-M på grund af tilstedeværelsen af diagnostiske fragmenter for hver isomer (tabel 1).

Både mesembrine og mesembrine-M (dihydro-) blev opdaget af blad spray MS og derfor identificeret af nøjagtige masse samt masse opsplitning. Protonated ion af mesembrine på 290.1742 m/z er en af de mest forekommende ioner i spektrum; Derfor kan det være en sandsynlig kandidat som en biomarkør for fremtidige undersøgelser. De to vigtigste Opiumalkaloider S. tortuosum er mesembrine og mesembrenone, som begge blev let fundet af blad spray MS. Flere af de forbindelser, opdaget af blad spray MS kan være nyttige i overvågningen af plantematerialer Sceletium og afledte produkter.

Figure 1
Figur 1: Leaf spray MS diagram af set-up. Leaf spray MS er en metabolit profilering metode, der giver mulighed for hurtig prøveudtagning af intakt plantevæv. Diagrammet viser et blad spray MS med kV høj spænding med en klemme og mulighed for at anvende et opløsningsmiddel til plantevæv. Leaf spray MS letter electrospray Ionisation direkte fra plantevæv i MS indløb. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Workflow af blad spray MS eksperimentere. Valgte plantevæv, en Sceletium tortuosum blad, blev skåret, så overføres med pincet til at være fastspændt, og derefter placeret foran ion fjorden før dataopsamling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Metabolit profilering af Sceletium tortuosum af blad spray MS med positive ionisering. (A) dette panel viser et blad spray MS samlede ion count (TIC) masse chronogram. For hver top top antallet er tid (min) og bunden er m/z. (B) dette panel viser blad spray MS metabolit profil af Sceletium tortuosum positive massespektrum. Indsatsen viser 260-295 m/z. Nøjagtig masserne er rapporteret med 4 decimaler med en fejl < 6 ppm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Leaf spray MS positive ionisering tandem massespektre fra Sceletium tortuosum skåret blad. Disse paneler viser tandem massespektre (MS/MS) indsamlet i positive ionisering tilstand med blad spray MS. Putative identifikationer af alkaloider er lavet af den nøjagtige masse og masse opsplitning for følgende: (A) mesembrine-M og mesembrenone-M isomerer, (B) mesembrine og (C) mesembrine-M (dihydro-). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sammensatte Molekylformel Målte Monoisotopic masse m/z [M + H] ppm fejl Fragmenter
Dihydrojoubertiamine C16H232 262.1794 5.0 NIELSEN
Mesembrenone-M (O - demethyl-) C16H193 274.1431 4.5 NIELSEN
Mesembrine-M (O - demethyl-) C16H213 276.1583 5.9 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258
Mesembrine-M (N - demethyl-) C16H213 276.1583 5.9 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247
Mesembrenone-M (O-demethyl - dihydro-) C16H213 276.1583 5.9 124, 205, 218, 227, 245
Mesembrenone-M (N-demethyl - dihydro-) C16H213 276.1583 5.9 120, 151, 210, 229, 241
Mesembrenone C17H213 288.1587 4.3 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270
Mesembrine C17H233 290.1742 4.9 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272
Mesembrine-M (dihydro-) C17H253 292.1897 5.2 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274

Tabel 1: formodede identifikation af Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider af blad spray MS. Denne tabel rapporter om positive ionisering nøjagtig masserne og fragmentioner for Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vellykket brug af denne protokol er baseret på optimering af forskellige trin for plantearter, vævstype og target forbindelser af interesse. De parametre, der er beskrevet i protokollen giver et godt udgangspunkt. De følgende eksperimentelle beslutninger skal være fremstillet og testet: eller ej til brug (1) klip eller uncut væv og (2) opløsningsmidlet eller ingen opløsningsmidler, (3) hvad opløsningsmiddel til at bruge og i hvilken mængde (4) hvad afstand af væv fra ion-fjorden skal være , og (5) spænding amplitude. Målet med optimering er at finde de betingelser, der producerer en kontinuerlig signal, der fortsætter til mindst 30 s til et par minutter. Betingelserne bør give en fyldestgørende og reproducerbare signal intensitet, som er nødvendig for at udføre nøjagtige masse og MS/MS målinger. Højt signal intensitet er opnået via en vellykket og pålidelige spray af ioner fra vævet. Spray kvalitet er afhængig af skarpheden af spidsen af det væv, der peger mod ion indløb, afstanden mellem spidsen af væv og ion fjorden, og den elektriske spænding. En vellykket spray er meget afhængige af skarphed i væv tip punkt, og i nogle tilfælde, vævet skal skæres for at danne en spids. Især mindre ændringer i skarpheden af vinklen på den koniske form på spidsen af den afskårne væv have betydelig indvirkning på den resulterende kvalitet af ioniserende stråling og dermed signal intensitet produceret7. I tilfælde hvor væv er allerede påpegede, så er ingen skæring nødvendigt, som er tilfældet med græs vinger eller lancetformede blade5,13.

En ion signal kan undertrykkes og ustabil når plasma decharge opstår fra væv som følge af at være placeret for tæt til ion indfaldende eller den elektriske spænding bliver for høj. En korrekt placering af vævet og et udvalg af den elektriske spænding er forpligtet til at sikre en stabil og ensartet spray mellem prøver. Afstand af væv fra MS ion inlet påvirker også kvaliteten og kvantiteten af signal produceret. Generelt er skal en mindre vævsprøve placeres tættere på fjorden, selv om små væv ikke kan resultere i et lavt signal intensitet hvis spids er ekstremt pegede eller forbindelser er stærkt koncentreret. Intensitet og konsistens af spektre bør optimeres empirisk ved at sammenligne flere placering positioner langs z-aksen. Det er afgørende for en passende ionisering at plantevæv er justeret med MS ion indløb i både x- og y-axes. Dog hvis plantevæv ligger urimeligt ion indløb, kan dette kræve en hyppigere rengøring af ion optik og den forreste ende af MS system.

Mængden opløsningsmiddel, der anvendes på toppen af væv kan variere fra 0 - 50µL afhængigt af vandindholdet og størrelsen af vævsprøve. I tilfælde, hvor vævet er ekstremt højt vandindhold og skæres, som i tilfælde af den saftige Sceletiumkan ingen opløsningsmidler tilsættes. Det er imidlertid mere typisk bruge mindst 5-10 µL af opløsningsmiddel til mindst én ansøgning. Tilføjelse af et opløsningsmiddel er nødvendigt, når du bruger en tørret væv eller frisk væv med en lav vandindhold for at lette spray. Hvis en lille mængde opløsningsmiddel, der anvendes på et stort stykke af plantemateriale, vil det sandsynligvis absorberes uden at producere en tilstrækkelig spray. Omvendt, hvis for højt et bind bruges, forbindelser kan være fortyndet eller korrekt desolvation vil ikke let og effektivt forekommer. En alternativ mulighed for at manuelt pipettering opløsningsmiddel er at anvende løbende opløsningsmiddel til væv via en sprøjten pumpe, så de observerede signal henfalder som funktion af tiden som sammensat er forarmet fra plante materiale10. Forskellige typer af opløsningsmidler bør prøves, og de deraf følgende spektre i forhold til at kontrollere enhver forbedring af mængden og konsistens af ion(s) for forbindelser af interesse. Tilføjelsen af et opløsningsmiddel ikke kun producerer spray men kan også give en selektivitet for udvinding af forskellige stoffer. Organiske opløsningsmidler med forskellige polariteter (methanol, dichlormethan, hexanes, acetonitril, kloroform og acetone) er blevet sammenlignet og medføre væsentligt forskellige ioner til stede i spektrene fra en peanut frø8. I almindelighed, er methanol et godt første opløsningsmiddel valg, som det har vist sig at fungere godt for mange plantevæv og en lang række fytokemikalier, herunder aminosyrer, alkaloider, flavonoler, kulhydrater, organiske syrer, fedtsyrer og fosfolipider8. Anvendelsen af 100% vand på uslebne plantevæv virker ikke typisk godt men kunne forbedres med tilsætning af salte10. I mange tilfælde, ud over protonated ioner af indelukke, andre rigelige adukter registreres som natrium og kalium adukter. Tilstedeværelsen af disse salt adukter er endnu mere fremherskende, når salt er føjet til opløsningsmiddel og kan være en fordel. For eksempel, blev en øget følsomhed og selektivitet af phenol glycosider fra Populus arter observeret med tilsætning af natrium og kalium ioner til det anvendte opløsningsmiddel10.

To store begrænsninger af blad spray MS teknik er (1) lave dynamikområde og (2) udfordringer med kvantitering. Typisk er kun de mest udbredte stoffer ioniseret og opdaget af teknikken. Falder i ionisering effektivitet på grund af ion undertrykkelse, der opstår dramatisk i mangel af kromatografiske adskillelse er mindre af et problem med rigelige metabolitter. For at omgå denne begrænsning, kan scanningsområde justeres til fokus på kun m/z intervallet af interesse. Men lav-overflod forbindelser stadig kan ikke påvises uden adskillelse og koncentration af kromatografi. I modsætning til den typiske kvantitering af forbindelser fra et uddrag, interne standarder kan ikke være korrekt blandet ind i plantemateriale før blad spray MS. Semi-quantitative målinger og relative koncentrationer er opnået ved at placere en kendt koncentration af en standardopløsning på væv overfladen og derefter at lade det tørre før et blad spray MS analyse8,9,31. For eksempel blev kvantitering standardtilsætningsmetoden brugt til at beregne forholdet mellem den repræsentative ion for den interne standard til ion af interesse at bestemme relative mængder32. En kalibreringskurve blev brugt til at vurdere den relative koncentration. Brug denne metode, det var muligt at sammenligne forholdet mellem de forskellige glycosider til en intern standard, rebaudioside D, og den relative koncentration af specifikke glycosider kunne derefter beregnes inden for Stevia blade33. Alternativt, en mere nøjagtig kvantificering er muligt med en brændselsfremstilling navngivet standard af sammensat af interesse, selv om kommerciel tilgængelighed kan være en udfordring. Brugen af metabolisk mærket plantevæv kan også forbedre kvantitering med denne metode34.

Betragtning af, at konventionelle LC-MS/MS kræver en omfattende prøveforberedelsen og kromatografisk separation, er andre metoder for analyse ofte ønsket. Leaf spray MS er en direkte kemisk analyse teknik, der let kan anvendes og tilbyder enkelhed, præcision, nøjagtighed og hurtig metabolit påvisning og semi-kvantificering. Derfor undersøgte vi egnetheden af blad spray MS til at overvåge det kemiske indhold af S. tortuosum, som kan danne grundlag for chemotaxonomic værktøjer til at differentiere arter af Sceletium slægten baseret på biokemiske signaturer. Flere anatomiske egenskaber af dette anlæg gøre det en ideel proeveemne for blad spray MS. Det er en sukkulent, der indeholder store mængder af vand, hvilket er en fordel som spray kan være genereret uden anvendelse af et opløsningsmiddel. Sceletium blad indeholder idioblasts (blære-lignende celler)15 som danne opbevaring reserver hvor specialiserede metabolitter kan ophobes. Leaf spray MS er en i vivo analyse teknik til at karakterisere plantevæv i en hurtig måde. Den generelle teknik kan anvendes til mange plantearter, vævstyper og klasser af forbindelser. Teknikker, der fange oplysninger om plante-forbindelser er af stor interesse at forstå plante primære og specialiserede stofskifte for menneskelige anvendelser af sundhed, ernæring, landbrug og energi35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NSF plante Genome Research Program grant IOS-1238812 og postdoc stipendium i biologi IOS-1400818. Arbejdet blev også finansieret af et Monsanto Graduate studerende stipendium til Katherine A. Sammons. Fulbright afrikanske forsker lærde Program (2017-2018) er takkede for finansieringen tildeles Nokwanda P. Makunga. Vi værdsætter donation af en nanospray kilde fra Jessica Prenni og Proteomics og Metabolomics anlægget ved Colorado State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
  22. Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
  23. Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
  24. Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
  25. National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
  26. ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
  27. GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
  28. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  31. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  32. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  33. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  34. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  35. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

Biokemi sag 136 Leaf spray MS massespektrometri electrospray Ionisation omgivende ionisering Sceletium tortuosum mesembrine alkaloider naturprodukter plante metabolitter små molekyler
Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freund, D. M., Sammons, K. A.,… More

Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter