Summary
Spettrometria di massa di foglia spray è una tecnica di analisi chimica diretta che riduce al minimo la preparazione del campione ed Elimina cromatografia, consentendo per la rilevazione rapida di piccole molecole da tessuti vegetali.
Abstract
Le piante producono migliaia di piccole molecole che sono diversi nelle loro proprietà chimiche. Spettrometria di massa (MS) è una tecnica potente per l'analisi dei metaboliti vegetali perché fornisce pesi molecolari con alta sensibilità e specificità. Spruzzo del foglio MS è una tecnica di ionizzazione ambientale cui tessuto vegetale è utilizzato per l'analisi chimica diretta tramite electrospray, eliminando cromatografia dal processo. Questo approccio alla degustazione di metaboliti permette di essere rilevati simultaneamente dai tessuti vegetali intatto, riducendo al minimo la quantità di preparazione dei campioni necessari per una vasta gamma di classi chimiche. Quando viene utilizzato con una MS di massa ad alta risoluzione, accurata, spruzzo del foglio MS facilita il rilevamento rapido di metaboliti di interesse. È anche possibile raccogliere dati di frammentazione tandem massa con questa tecnica per facilitare un'identificazione di composta. La combinazione di misure accurate di massa e la frammentazione è utile nel confermare identità composta. Lo spray di foglia tecnica MS richiede solo piccole modifiche a una sorgente di ionizzazione nanospray ed è uno strumento utile per espandere ulteriormente le funzionalità di uno spettrometro di massa. Qui, il tessuto fresco foglia da Sceletium tortuosum (Aizoaceae), una pianta medicinale tradizionale dal Sud Africa, è analizzato; numerosi mesembrine alcaloidi vengono rilevati con spruzzo del foglio MS.
Introduction
Le piante contengono una vasta gamma di piccole molecole con proprietà chimiche diverse. MS è una tecnica potente per l'analisi dei composti vegetali perché può fornire composizioni elementale con un'alta sensibilità e specificità per la rilevazione e l'identificazione di metaboliti1. Più comunemente, MS viene eseguita su campioni estratti con solvente, che sono separati mediante cromatografia a prima analisi MS1. Tuttavia, l'uso della cromatografia liquida (LC) richiede tempi di analisi lunga e spesso è associato con un vasto campione preparazione1. Al contrario, analisi chimica diretta dei tessuti intatti che elude la cromatografia è una tecnica molto rapida, che necessitano di preparazione minima del campione2. Così, in casi dove possono essere rinunciati passaggi cromatografici, un'analisi chimica diretta può essere molto vantaggiosa.
Tipico di LC-MS per la ricerca di prodotti e metabolomica naturale si basa su estrazioni lunga massa di materiali secchi o surgelati vegetali contenenti più tessuti e delle cellule tipi3. In alternativa, analisi chimica diretta, ad esempio il rilevamento di MS di metaboliti da tessuto vegetale, possono isolare tipi cellulari ed evitare artefatti di preparazione4. Spruzzo del foglio MS, noto anche come tessuto-spray5,6, è una tecnica di ionizzazione ambiente diretto MS, che richiede essenzialmente, nessuna preparazione del campione5,7. Spruzzo del foglio che MS è collegato strettamente a spruzzo di carta MS, una tecnica di ionizzazione ambiente con caratteristiche di ionizzazione electrospray che consente il rilevamento degli analiti che si depositano sulla carta7. A dispetto del nome, spruzzo del foglio MS è applicabile ai vari tipi di tessuti vegetali, lascia non solo è stato dimostrato su frutta, semi, radici, tessuti floreali e tuberi, tra gli altri6,8,9, 10,11,12. La tecnica facilita l'ionizzazione di sostanze fitochimiche endogena direttamente da materiali vegetali nello spettrometro di massa per rilevamento8. Spruzzo del foglio MS può anche fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle sostanze chimiche nei tipi differenti del tessuto in piante13. Quando spruzzo del foglio MS viene confrontato con l'estrazione con solvente e LC-MS, i risultati indicano spruzzo del foglio che MS consente il rilevamento rapido dei metaboliti superficie da tipi di cella univoci come tricomi13. La figura 1 illustra la struttura sperimentale di foglia spray MS. Ionizzazione electrospray diretto si verifica solo le modifiche di origine secondaria. Un'alta tensione viene applicata al tessuto della pianta tramite una fascetta metallica, producendo uno spray di goccioline molto caricate formando un cono di Taylor che trasporta gli ioni e la presa dello ione della sig. ra Electrospray ionizzazione avviene dal liquido naturale della pianta o dal solvente appl IED a superficie della pianta. A punta sul tessuto facilita l'electrospray e possa essere naturalmente presenti in natura o creati dal taglio.
Spruzzo del foglio MS è un metodo veloce per l'analisi qualitativa e semiquantitativa di tessuti vegetali intatto che hanno trovato il programma di utilità per una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, la tecnica è stata utilizzata per rilevare composti endogeni per distinguere specie affini e anche per valutare i cambiamenti nella stessa specie coltivate in condizioni diverse. Studi precedenti hanno dimostrato questo approccio misurando metaboliti in beautyberry (Callicarpa L.) 12 e ginseng americano (Panax quinquefolium L.) 6. in quest'ultimo esempio, ginsenosidi, gli aminoacidi e gli oligosaccaridi potrebbero essere rilevati dopo aver bagnato del tessuto ginseng crudo. Ginseng americano coltivate e selvatiche sono stati differenziati da tubero fette6. Spruzzo del foglio successivo MS, che ha permesso per una successiva ispezione morfologica e microscopica6era preservare l'integrità di tubero di ginseng. Inoltre, possono essere individuati anche composti esogeni su campioni di piante. Un numero di pesticidi (acetamiprid, difenilammina, imazalil, linuron e tiabendazolo) è stato rilevato sulla buccia o polpa di frutta e verdura9. Mentre questi studi e molti altri hanno dimostrato l'utilità di spruzzo del foglio MS per vari scopi specifici, un protocollo dettagliato precedentemente non è stato segnalato.
Qui, la descrizione di protocollo non si concentrerà sull'ottimizzazione del metodo per un tessuto specifico o composti. Piuttosto, la rilevazione di mesembrine alcaloidi di Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) viene utilizzata come esempio per discutere le misure di ottimizzazione necessarie che dovrebbero essere prese durante l'impostazione di un esperimento di MS foglia spray per una specie, tessuto, o presenti per la prima volta. S. tortuosum è una succulenta endemica nella regione di Karroo semi-aride del Sud Africa. Una medicina tradizionale del San e Khoi Khoi i popoli, è stato usato per la soppressione dell'appetito e della sete, anche per quanto riguarda i suoi effetti psicotropi e analgesici14,15. Attualmente, gli estratti standardizzati sono utilizzati per il trattamento di patologie neuropsichiatriche e neuropsicologiche16,17. I composti primari di interesse includono il mesembrine dell'alcaloide e suoi derivati, molti dei quali si trovano anche correlate Sceletium specie15. Popolazioni coltivate e selvatiche di S. tortuosum hanno concentrazioni variabili di alcaloidi mesembrine, presentando così un controllo di qualità sfida18. Un metodo per la determinazione rapida di alcaloidi mesembrine, come spruzzo del foglio MS, può essere utile nel monitoraggio Sceletium prodotti. Perché in precedenza, c' non era stato nessun protocollo sperimentale visual dettagliato per lo spray foglia tecnica MS, ci illustrerà il metodo utilizzando l'esempio di S. tortuosume viene descritto quanto segue: la modifica di un'origine nanospray, il selezione e preparazione dei tessuti vegetali, l'acquisizione dei dati, l'interpretazione dei risultati e l'ottimizzazione dei parametri MS.
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Protocol
1. le modifiche all'origine Nanospray per foglia spruzzare MS
- Utilizzare un'origine nanospray modificate per spruzzo del foglio MS. Come nessun componenti fluidici sono necessari per spruzzo del foglio MS, è possibile modificare l'origine rimuovendo la sonda LC dall'origine.
- Assemblare il filo MS di spruzzo di foglia si applicherà la tensione al tessuto della pianta con il perno adatto per collegare la sorgente. Saldare il perno a un'estremità di un filo isolato; un morsetto all'estremità opposta del filo di saldatura.
Nota: Il morsetto (alligator clip tipo) può o non può avere i denti. Per piccolo tessuto, un morsetto senza denti è preferito. Un braccio flex opzionale con un morsetto può essere aggiunti all'origine nanospray per facilitare il posizionamento del tessuto vegetale. Nota che questo protocollo in particolare viene descritto come eseguire spruzzo del foglio MS su un analizzatore di massa di ibridi quadrupolo trappola ionica sistema MS (Vedi la Tabella materiali); Tuttavia, altri sistemi MS possono essere modificati per eseguire questa tecnica6. Spruzzo del foglio di accoppiamento MS con un'analisi chimica in tempo reale portatile spettrometro di massa può essere eseguita sul posto senza la necessità di trasportare il materiale vegetale per il laboratorio19,20. - Posizionare un tappetino antistatico al piano sottostante l'origine per ridurre la scarica elettrica che può verificarsi dall'origine utilizzando alte tensioni.
2. preparazione del sistema MS per foglia Spray MS
- Se il sistema è stato recentemente in uso, lasciarlo raffreddare al tatto e rimuovere qualsiasi fonte alternativa e il cono di sweep. Associare la fonte di MS nanospray spruzzo di foglia.
- Creare un file tune con i parametri appropriati ionizzazione impostati come segue: guaina, ausiliare e gas di espulsione a 0; la tensione di spruzzo a 2-5 kV; la temperatura capillare a 150-250 ° C; e il livello di S-obiettivo RF a 50. Salvare il file di sintonia con i parametri desiderati8,13. Ottimizzare la tensione e la temperatura per l'ionizzazione migliore del tessuto e presenti di interesse.
Nota: Sono buoni punti di partenza 4 kV e 200 ° C. - Creare un file di metodo incluso il foglia spray MS tune file con: MS completo positivi e negativi; una risoluzione di 70.000; un obiettivo AGC di 1 x 106; un massimo di 200 ms; e l'intervallo di scansione desiderata m/z. In alternativa, utilizzare solo 1 polarità.
3. preparazione dello strumento, solventi e tessuto vegetale
Nota: Sempre indossare guanti e non utilizzare tessuto vegetale che è stato gestito con le mani nude. In caso contrario, gli ioni di contaminanti come il polietilene glicole dominerà gli spettri.
- Portare i tessuti vegetali per l'analisi per la stessa camera come il sistema MS consentono per un campionamento rapido.
- Per tessuto vegetale che non dispone di una punta naturalmente, usare una lama di rasoio su un vetrino per tagliare un punto conico (Figura 2). Determinare la quantità di tessuto necessari per l'analisi basata sulla sensibilità dello strumento, tipo di tessuto e presenti di interesse (ad es., un giovane S. tortuosum foglia di ~ 5 mm di lunghezza).
- Taglio S. tortuosum lascia a 10 settimane post-germinazione in strisce sottili, ciascuno con un'estremità appuntita per formare un punto.
- Utilizzare pinze per selezionare delicatamente il tessuto della pianta alla fine che sarà bloccata. Tenendo il tessuto con il forcipe, trasferire con cautela al morsetto.
Attenzione: Non toccare l'origine dello strumento se la tensione è su. - Regolare il braccio flessibile e il filo con il morsetto per posizionare il tessuto in linea con l'ingresso di MS in modo che la distanza fra i tessuti vegetali e l'ingresso di ioni del MS è 5-10 mm per il triplo quadrupolo (ad es., TSQ) e trappola lineare quadrupolo (LTQ) e 10 -50 mm per la presa dello ione analizzatore di massa (ad es., orbitrap)8.
- Collegare l'estremità opposta del filo la fonte. Se i primi tentativi di produrre un'intensità di segnale basso, spostare il tessuto vegetale più vicino verso l'ingresso di ioni (fare riferimento alla discussione per ottimizzazione).
- Caricare il file di metodo; nome del file di dati e impostare il percorso di archiviazione di file. Attivare il sistema MS facendo clic su Play , quindi fare clic su Start per iniziare l'acquisizione dei dati.
- Applicare un solvente (ad es., metanolo) utilizzando una pipetta con una punta di gel-caricamento per massimizzare la distanza tra le mani e l'alta tensione per proteggere l'utente.
Nota: Il volume di solvente necessario dipende dalla dimensione, secchezza e trama del tessuto, in genere ~ 2-20 µ l. S. tortuosum foglie non richiedono alcun solvente da aggiungere. Applicare con cura il solvente e non toccare l'origine dello strumento quando la tensione è su. Utilizzare solventi grado LC-MS e lavori di vetro che è stato acido lavato ed è libero di detergenti. In alcuni tessuti, un segnale può essere osservato senza l'aggiunta di un solvente a causa del contenuto di acqua naturale del tessuto della pianta. Tuttavia, una maggiore intensità del segnale e la ridotta S/N in genere si ottiene applicando un solvente al tessuto. - Acquisire dati, purché il segnale persiste o fino a quando gli spettri adeguati sono stati raccolti, in genere 30-60 s. Se necessario, applicare ulteriori solvente per mantenere un'alta intensità del segnale per una quantità di tempo maggiore. Fermare l'acquisizione di dati e mettere in pausa il sistema MS.
- Rimuovere il tessuto e lavare il morsetto con 100% di metanolo e un panno privo di lanugine. Pulire l'ingresso di ioni MS dopo circa 1-2 h dell'acquisizione di spruzzo del foglio MS secondo le specifiche del fornitore. Inoltre, pulire l'ingresso di ioni MS tra analisi di diversi tipi di tessuto.
4. i dati valutazione di qualità
- Aprire il file di dati e ispezionare visivamente il Cronogramma massa base picco. Verifica che l'intensità del segnale è ~1.0 x 107 a 5,0 x 108. Se il segnale è inferiore, è possibile spostare il tessuto più vicino verso l'ingresso di ioni. Se superiore, il front-end del sistema MS diventerà sporco, quindi spostare il tessuto più lontano l'ingresso di ioni.
- Basato sulla presenza o sull'assenza degli ioni di interesse in spettri di massa prodotta, alterare i parametri.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. tandem massa frammentazione
- Decidere quali gli ioni sono di interesse per la frammentazione di massa tandem (MS/MS); un segnale di spettri di massa che è > 1,0 x 105 è sufficiente per la selezione di ioni per MS/MS.
- Fare un nuovo file di metodo con un elenco di inclusione di m/z fuori a 4 cifre decimali. Fare clic su elenchi globali e inclusione. In proprietà del PRM, selezionare l'energia di frammentazione [ad es., energia di collisione normalizzato (NCE) di 30-50 è una buona gamma per cominciare] e altri parametri di MS/MS.
- Per ottenere i dati di MS/MS per gli alcaloidi mesembrine, frammento i seguenti ioni, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z, NCE 35.
Nota: L'acquisizione di dati di MS/MS può essere eseguita immediatamente dopo la MS o in un secondo momento. Lo stesso tessuto spesso può rimanere bloccato dopo una MS completa e può essere riutilizzato per acquisire i dati di MS/MS. Tuttavia, se un accertati non fornisce un segnale sufficiente, utilizzare un nuovo tessuto.
- Per ottenere i dati di MS/MS per gli alcaloidi mesembrine, frammento i seguenti ioni, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z, NCE 35.
- Caricare il file di metodo di MS/MS e un file di dati denominato. Accendere il sistema MS e inizia l'acquisizione di dati, eventualmente aggiungendo un solvente. Quando gli spettri adeguati sono stati raccolti, in genere dopo 30-60 s, interrompere l'acquisizione.
- Quando si assegnano gli ioni frammento, raccogliere frammentazione alle tante energie.
Nota: Poiché spruzzo del foglio MS manca una separazione cromatografica, gli spettri di frammentazione sono suscettibili di contenere molti ioni e frammentazione alle diverse energie vi aiuterà a fare chiarezza.
6. putativi identificazioni di frammentazione di massa massa accurata e Tandem
- Fare identificazioni putativi facendo riferimento a precise misurazioni di massa da database di metabolita pubblicamente disponibile come Metlin21, Human Metabolome Database22, massa Banca23, mappe dei lipidi24, Istituto nazionale di Standard e tecnologia MS ricerca25, rispetto per i Phytochemicals26, o PNL27.
- Come questi database non sono esaustivi, di eseguire una revisione della letteratura sulle specie vegetali caratterizzati chimicamente come necessario.
- Corrispondenza tra gli ioni di frammentazione da foglia spruzzare MS/MS per i database di cui sopra quando sono disponibili informazioni di MS/MS, o alla letteratura. In alternativa, utilizzare un'interpretazione manuale degli ioni frammento MS/MS o una frammentazione di un autentico standard effettuate dall'iniezione diretta o LC-MS/MS.
7. analisi dei dati
- Convertire i file raw di MS mzXML file con lo strumento di msConvert da Proteowizard28.
- Utilizzare il pacchetto di software XCMS implementato in R per il prelievo di picco. Utilizzare un'infusione diretta l'elaborazione del metodo per lo spray foglia analisi MS.
Nota: Il ben commentato scripts utilizzati per l'elaborazione dati può essere trovato alla https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code. - Per ottenere misure semi-quantitative, contabilità per la variabilità sperimentale, normalizzare l'intensità di ogni metabolita dalla corrente ionica totale (TIC), come lo spray di foglia MS l'intensità del segnale può variare, in parte a causa di lievi variazioni nel posizionamento dei la foglia nell'origine e le differenze di dimensioni e forma della foglia.
- In alternativa, utilizzare fornito dal fornitore di software per l'analisi dei dati o MZmine2 (per essere trovato alla http://mzmine.github.io/)29.
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Representative Results
A 10 settimane che post-germinazione, appena raccolti coltivati in serra, S. tortuosum foglie sono stati analizzati da spruzzo del foglio MS. Il flusso di lavoro sperimentale per la rilevazione di metaboliti da S. tortuosum lascia utilizzando spruzzo del foglio che MS è illustrata nella Figura 2. Una foglia è stata selezionata, tagliata in una striscia sottile con un'estremità appuntita per formare un punto e serrata con lo spray di foglia MS filo morsetto apparato. Tessuto della pianta è stato posizionato ~ 30 mm dall'ingresso di ioni e in linea con gli assi x e y. All'atto dell'apertura dello spray foglia che foglie di MS di S. tortuosum , gli ioni sono stati rilevati senza alcuna applicazione di solvente. Piante della famiglia Sceletium sono succulente con foglie spesse con un elevato contenuto di acqua che consente di ionizzazione electrospray di spruzzo del foglio MS senza l'applicazione esterna di un solvente. Tuttavia, più in genere, tessuti vegetali richiedono un'applicazione di solvente per rilevare gli ioni.
Un cronogramma massa e densamente popolati con gli ioni di spettri di massa sono state prodotte dopo 30 s di acquisizione in modalità di ionizzazione positiva (Figura 3). Cronogramma rappresenta un successo foglia MS sperimentare dove un segnale stabile è stato mantenuto per tutta la durata dell'acquisizione. In questo studio, un totale di nove mesembrine alcaloidi sono stati rilevati da spruzzo del foglio MS e presunte identificazioni sono state fatte dalla massa esatta degli ioni protonata del precedentemente caratterizzato composti (tabella 1)30. È vantaggioso effettuare spruzzo del foglio MS su un ad alta risoluzione, massa accurata (HRAM) spettrometro di massa, che lo rende possibile risolvere masse leggermente diverse. Per esempio, la m/z a 262.1794 potrebbe essere putativamente identificato come dihydrojoubertiamine anziché come mesembrenone-M (demetil - diidro-), che sarebbe stato a m/z 262.1443.
Tessuto fogliare è rimasto bloccato per una frammentazione di tandem massa (MS/MS) di alcuni ioni di interesse (tabella 1). Figura 4 vengono illustrati tre esempi di spettri di frammentazione MS/MS da spruzzo del foglio MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z. Presunta identità sono state verificate da frammenti di messa e confermata con frammenti identificati in precedenza30. Lo ione protonata di 276.1583 m/z è stato identificato come due diversi isomeri di mesembrine-M (demetil) e un altro due isomeri di mesembrenone-M, grazie alla presenza di frammenti di diagnostiche per ogni isomero (tabella 1).
Sia mesembrine e mesembrine-M (diidro-) sono stati rilevati da spruzzo del foglio MS e putativamente identificati da massa esatta così come dalla frammentazione di massa. Lo ione protonata del mesembrine a 290.1742 m/z è uno degli ioni più abbondanti nello spettro; di conseguenza, potrebbe essere un candidato probabile come biomarcatore per gli studi futuri. I due alcaloidi principali di S. tortuosum sono mesembrine e mesembrenone, entrambi i quali sono stati prontamente rilevati da spruzzo del foglio MS. Molti dei composti rilevati da spruzzo del foglio che MS può essere utile nel monitoraggio dei materiali di Sceletium e prodotti derivati.
Figura 1: diagramma di spruzzo MS foglia di set-up. Spruzzo del foglio MS è un metabolita metodo che consente il rapido campionamento del tessuto vegetale intatto di profilatura. Il diagramma mostra una foglia MS con kV alta tensione applicata con una pinza e l'opzione per applicare un solvente al tessuto della pianta. Spruzzo del foglio MS facilita la ionizzazione electrospray direttamente dal tessuto della pianta nell'ingresso di MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: flusso di lavoro di spruzzo del foglio MS sperimentare. Tessuti vegetali selezionati, una foglia di Sceletium tortuosum , è stato tagliato, poi trasferito con pinze per essere fissata e quindi posizionato davanti l'ingresso di ioni prima dell'acquisizione di dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profiling del metabolita di Sceletium tortuosum di spruzzo del foglio MS con ionizzazione positiva. (A), questo pannello mostra una foglia MS Cronogramma massa di ione totale conteggio (TIC). Per ogni picco, il numero superiore è il tempo (min) e la parte inferiore è il m/z. (B) questo pannello mostra lo spray foglia MS profilo di metabolita di uno spettro di massa positivo di Sceletium tortuosum . L'inserto Visualizza 260-295 m/z. Masse accurate risultano 4 cifre decimali con un errore < 6 ppm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Spettri di ionizzazione positiva della massa del tandem del spray MS del foglia da Sceletium tortuosum tagliare foglia. Questi pannelli mostrano spettri di massa tandem (MS/MS) raccolti in modalità di ionizzazione positiva con spruzzo del foglio MS. Putative identificazioni degli alcaloidi sono realizzate dalla massa accurata e frammentazione di massa per quanto segue: (A) mesembrine-M e mesembrenone-M isomeri, mesembrine (B) e (C) mesembrine-M (diidro-). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composto | Formula molecolare | Misurato massa Monoisotopic m/z [M + H] | errore di ppm | Frammenti |
| Dihydrojoubertiamine | C16H23NO2 | 262.1794 | 5.0 | N/A |
| Mesembrenone-M (O - demethyl-) | C16H19NO3 | 274.1431 | 4.5 | N/A |
| Mesembrine-M (O - demethyl-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258 |
| Mesembrine-M (N - demethyl-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247 |
| Mesembrenone-M (O-demethyl - diidro-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 124, 205, 218, 227, 245 |
| Mesembrenone-M (N-demethyl - diidro-) | C16H21NO3 | 276.1583 | 5.9 | 120, 151, 210, 229, 241 |
| Mesembrenone | C17H21NO3 | 288.1587 | 4.3 | 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270 |
| Mesembrine | C17H23NO3 | 290.1742 | 4.9 | 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272 |
| Mesembrine-M (diidro-) | C17H25NO3 | 292.1897 | 5.2 | 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274 |
Tabella 1: Putative identificazioni di Sceletium tortuosum Mesembrine alcaloidi di spruzzo del foglio MS. Questa tabella riporta masse accurata ionizzazione positiva e ioni frammento per Sceletium tortuosum mesembrine alcaloidi.
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Discussion
Il riuscito uso di questo protocollo si basa sull'ottimizzazione dei vari passaggi per la specie di piante, tipo di tessuto e presenti di destinazione di interesse. I parametri descritti nel protocollo forniscono un buon punto di partenza. Le seguenti decisioni sperimentali devono essere realizzati e testati: o meno all'uso (1) taglio o tessuto uncut e (2) solvente o nessun solvente, (3) quali solvente da utilizzare e in quale volume, (4) che cosa la distanza del tessuto dall'ingresso di ioni deve essere e (5) l'ampiezza di tensione. L'obiettivo dell'ottimizzazione è quello di trovare le condizioni che producono un segnale continuo che persiste per almeno 30 s per pochi minuti. Le condizioni dovrebbero fornire un'intensità di segnale adeguata e riproducibile, che è necessario per eseguire misure di MS/MS e massa esatta. Alta intensità del segnale avviene tramite un spray affidabile e di successo degli ioni dal tessuto. La qualità dello spruzzo è dipenda la nitidezza della punta del tessuto rivolto verso l'ingresso di ioni, la distanza tra la punta dell'insenatura del tessuto e dello ione e la tensione elettrica applicata. Uno spruzzo successo dipende fortemente la nitidezza del punto della punta del tessuto e, in alcuni casi, il tessuto deve essere tagliato per formare un'estremità appuntita. In particolare, alterazioni lievi nell'acutezza dell'angolo di forma affusolata alla punta del taglio tessuto effetti significativi sulla qualità risultante di ionizzazione e così l'intensità del segnale prodotto7. In casi dove i tessuti sono già puntati, quindi nessun taglio è necessario, come è il caso con fili d'erba o foglie a forma di lancetta5,13.
Un segnale di ioni può essere soppresso e instabile in caso di Scarica di plasma dal tessuto come conseguenza di essere posizionato troppo vicino per l'ingresso di ioni o la tensione elettrica è troppo alta. Un corretto posizionamento del tessuto e una selezione della tensione elettrica sono tenuti a garantire uno spruzzo stabile e coerenza tra i campioni. La distanza del tessuto dall'ingresso di ioni MS influenza anche la qualità e la quantità del segnale prodotto. In generale, un piccolo campione di tessuto deve essere posizionato più vicino all'ingresso, anche se il tessuto di piccole dimensioni non può comportare un'intensità bassa del segnale se la punta è estremamente appuntita o i composti sono altamente concentrati. L'intensità e la consistenza degli spettri dovrebbe essere ottimizzati empiricamente confrontando diverse posizioni lungo l'asse z. È fondamentale per un'ionizzazione adatta che il tessuto della pianta sia allineato con l'ingresso di ioni di MS in entrambi la x e y. Tuttavia, se i tessuti vegetali sono irragionevolmente vicino l'ingresso di ioni, questo può richiedere una pulizia più frequente dell'ottica dello ione e il front-end del sistema MS.
Il volume di solvente applicato sopra il tessuto può variare da 0 - 50 µ l a seconda del contenuto di acqua e la dimensione del campione di tessuto. Nei casi in cui il tessuto è estremamente elevata in contenuto di acqua e viene tagliato, come nel caso della succulenta Sceletium, nessun solvente può essere aggiunto. Tuttavia, è più tipico di utilizzare almeno 5-10 µ l di solvente per almeno un'applicazione. L'aggiunta di un solvente è necessario quando si utilizza un tessuto secco o freschi con un basso contenuto d'acqua per facilitare lo spray. Se una piccola quantità di solvente viene utilizzata su un grande pezzo di materiale vegetale, probabilmente sarà assorbita senza produrre uno spruzzo sufficiente. Al contrario, se viene utilizzato un volume troppo elevato, composti possono essere diluiti o desolvatazione corretto prontamente e in modo efficiente non si verificherà. Un'opzione alternativa per pipettaggio manualmente solvente è continuamente applicare solvente al tessuto tramite una pompa a siringa in modo che i decadimenti di segnale osservato come funzione del tempo come il composto è vuotato dalla pianta del materiale10. Dovrebbero essere provati vari tipi di solventi, e gli spettri risultanti rispetto a verificare alcun miglioramento della quantità e consistenza del ion(s) per i presenti di interesse. L'aggiunta di un solvente non solo produce spray, ma può anche fornire una selettività per l'estrazione di composti diversi. Solventi organici con diverse polarità (metanolo, diclorometano, esano, acetonitrile, cloroformio e acetone) sono stati confrontati e provocare significativamente differenti ioni presenti negli spettri da un8di semi di arachidi. In generale, il metanolo è una buona scelta prima di solvente, come è stato dimostrato di lavorare bene per molti tessuti vegetali e una vasta gamma di sostanze fitochimiche, tra cui aminoacidi, alcaloidi, flavonoli, carboidrati, acidi organici, acidi grassi e fosfolipidi8. L'applicazione di acqua 100% su tessuti vegetali uncut in genere non funzionano bene ma potrebbe essere migliorata con l'aggiunta di sali10. In molti casi, oltre a protonata ioni di un composto, altri abbondanti addotti vengono rilevati come sodio e potassio addotti. La presenza di queste sale addotti è ancor più prevalente quando sale è aggiunto al solvente e può essere vantaggioso. Ad esempio, un aumento della sensibilità e selettività dei glicosidi fenolici da Populus specie sono stati osservati con l'aggiunta di ioni sodio e potassio al solvente applicata10.
Due limitazioni principali dello spray foglia tecnica MS sono (1) la bassa gamma dinamica e (2) le sfide con la quantificazione. In genere, solo i composti più abbondanti sono ionizzati e rilevati dalla tecnica. Diminuisce l'efficienza di ionizzazione dovuto la soppressione dello ione che si presenta drammaticamente in assenza di separazione cromatografica sono meno di un problema con abbondanti metaboliti. Per aggirare questa limitazione, l'intervallo di scansione può essere regolata a fuoco solo l'intervallo di m/z di interesse. Tuttavia, basso-abbondanza composti ancora non possono essere rilevati senza la separazione e la concentrazione forniti da cromatografia. A differenza della quantificazione tipica di composti da un estratto, standard interni non possono essere correttamente miscelati in materiale vegetale prima foglia misurazioni MS. Semi-quantitative e relative concentrazioni sono state ottenute inserendo un noto concentrazione di una soluzione standard sulla superficie del tessuto e poi lasciandola asciugare prima di uno spray di foglia MS analisi8,9,31. Ad esempio, il metodo di aggiunta standard di quantificazione è stato utilizzato per calcolare il rapporto dello ione rappresentativo per lo standard interno per lo ione di interesse determinare quantità relative32. Una curva di calibrazione è stata usata per stimare la concentrazione relativa. Utilizzando questo metodo, è stato possibile confrontare il rapporto dei glicosidi vari per un interno rebaudioside standard, D, e la concentrazione relativa di glicosidi specifici potrebbe quindi essere calcolata all'interno di Stevia foglie33. In alternativa, una più accurata quantificazione è possibile con uno standard isotopicamente etichettato il composto d'interesse, anche se la disponibilità in commercio può essere una sfida. L'uso di tessuto vegetale metabolicamente con etichetta può anche migliorare la quantificazione con questo metodo34.
Dato che convenzionale LC-MS/MS richiede una vasta campionatura e separazione cromatografica, altri metodi per l'analisi sono spesso desiderati. Spruzzo del foglio MS è una tecnica di analisi chimica diretta che può essere facilmente applicata e offre semplicità, precisione, accuratezza e metabolita rapido rilevamento e semi-quantificazione. Per questo motivo, abbiamo studiato l'idoneità di spruzzo del foglio MS per monitorare il contenuto chimico di S. tortuosum, che può fornire la base per strumenti chemotaxonomic di differenziare le specie del genere Sceletium basato su biochimica firme. Anatomiche diverse proprietà di questa pianta rendono un esemplare di prova ideale per spruzzo del foglio MS. Si tratta di un succulento, contenenti elevate quantità di acqua, che è vantaggiosa in quanto lo spray può essere generato senza l'applicazione di un solvente. Sceletium foglia contiene idioblasti (vescica-come le cellule)15 che fungono da riserve di deposito dove si possono accumulare metaboliti specializzati. Spruzzo del foglio MS è una tecnica di analisi in vivo per caratterizzare il tessuto vegetale in modo veloce. La tecnica generale è applicabile a molte specie di piante, tipi di tessuto e classi di composti. Tecniche che acquisire informazioni sui composti vegetali sono di grande interesse per comprendere il metabolismo primario e specializzato di pianta per usi umani di salute, nutrizione, agricoltura ed energia35.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NSF Plant Genome Research Program IOS-1238812 e la borsa di studio post-dottorato in biologia IOS-1400818. Il lavoro inoltre è stato finanziato da una borsa di studente laureato di Monsanto di Katherine A. Sammons. Il programma Fulbright africano ricercatore studiosi (2017-2018) è ringraziato per finanziamenti accordati per Nokwanda P. Makunga. Noi apprezziamo molto la donazione di una fonte di nanospray da Jessica Prenni e l'impianto di proteomica e metabolomica presso la Colorado State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest - S. tortousum |
References
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