Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Published: June 21, 2018 doi: 10.3791/57949
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute, University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology, Stellenbosch University

Summary

Yaprak sprey kütle spektrometresi numune hazırlama en aza indirir ve küçük moleküller bitki doku üzerinden hızlı tespiti için izin kromatografi, ortadan kaldırır bir doğrudan kimyasal analiz tekniğidir.

Abstract

Bitkilerin kimyasal özelliklerini çeşitli küçük moleküller binlerce üretmek. Kütle spektrometresi (MS) yüksek duyarlılık ve özgüllük ile moleküler ağırlık sağladığı için bitki metabolitleri analiz etmek için güçlü bir tekniktir. Yaprak sprey MS bitki doku electrospray, kromatografi işleminden ortadan kaldırılması yoluyla doğrudan kimyasal analiz için kullanıldığı bir ortam iyonlaşma tekniğidir. Bu yaklaşım metabolitleri örnekleme için çok çeşitli kimyasal sınıfları için aynı anda numune hazırlama gerekli miktarını en aza indirerek olduğu gibi bitki dokulardan tespit edilmesini sağlar. Yüksek çözünürlüklü, doğru kitle MS ile kullanıldığında, yaprak sprey MS metabolitleri ilgi hızlı algılama kolaylaştırır. Bileşik bir kimlik kolaylaştırmak için bu tekniği ile tandem kitle parçalanma veri toplamak mümkündür. Doğru kitle ölçümler ve parçalanma ile birlikte bileşik kimlikleri doğrulayan faydalıdır. Yaprak sprey MS teknik bir nanospray iyonizasyon kaynağı sadece küçük değişiklikler gerektirir ve daha fazla bir kütle spektrometre yeteneklerini genişletmek için yararlı bir araçtır. Burada, tortuosum tortuosum (Aizoaceae), Güney Afrika, geleneksel bir tıbbi bitki dokudan taze yaprak analiz edilir; çok sayıda mesembrine alkoloidler yaprak sprey MS ile tespit edilir.

Introduction

Bitkiler küçük moleküller çeşitli kimyasal özelliklere sahip geniş bir yelpazesi içerir. MS elemental besteleri yüksek duyarlılık ve özgüllük ile algılama ve metabolitleri1tanımlaması için-ebilmek sağlamak o çünkü bitki bileşikleri analiz etmek için güçlü bir tekniktir. En sık, MS MS Analizi1önce Kromatografi ayrılır solvent çıkarılan örnekleri gerçekleştirilir. Ancak, sıvı kromatografi (LC) kullanımı uzun analiz kez gerektirir ve genellikle bir kapsamlı örnek hazırlık1ile ilişkilidir. Buna ek olarak, kromatografi kaçınmanızı sağlar doğrudan kimyasal sağlam doku analizi en az örnek hazırlama2gerektiren bir çok hızlı, bir tekniktir. Böylece, nerede kromatografik adımları forgone durumlarda, doğrudan kimyasal analizi son derece avantajlı olabilir.

Tipik LC-MS doğal ürünler ve metabolomics araştırma için birden fazla doku ve hücre türleri3içeren kurutulmuş veya dondurulmuş bitki malzemelerin uzun toplu çekimi üzerinde dayanır. Alternatif olarak, doğrudan kimyasal analizi, metabolitleri bitki dokusundan MS tespiti gibi hücre tipleri yalıtmak ve hazırlık eserler4kaçının. Yaprak sprey MS olarak doku-sprey5,6, da, hiçbir örnek hazırlama75,esas gerektirir bir doğrudan ortam iyonlaşma MS tekniktir. Yaprak spreyi MS yakından kağıt sprey MS, bir ortam iyonlaşma teknik özellikleri kağıt7yatırılır analitler tespiti için sağlar electrospray iyonlaşma ile ilgilidir. Rağmen adını, yaprak sprey MS bitki doku türleri için geçerlidir, sadece yaprakları ve oldu6,8,9, meyve, tohum, kök, çiçek doku ve yumrular, diğerleri arasında olarak gösterdi 10,11,12. Teknik doğrudan bitki malzemelerden endojen fitokimyasallar iyonlaşma algılama8için kütle spektrometre içine kolaylaştırır. Yaprak sprey MS Ayrıca kimyasal bitki13farklı doku türlerine kayma dağıtımı hakkında bilgi sağlar. Yaprak sprey MS solvent ekstraksiyon ve LC-MS ile karşılaştırıldığında sonuç yaprak sprey MS yüzey metabolitleri hızlı tespiti için trichomes13gibi benzersiz hücre türleri sağlar öneririz. Şekil 1 yaprak sprey MS deneysel ayarı gösterir. Doğrudan electrospray iyonlaşma yalnızca küçük kaynak değişiklikleri sonra oluşur. Yüksek gerilim ile metal kelepçe bitki doku uygulanır, bir sprey Bayan Electrospray iyon giriş için iyonları taşıyan bir Taylor koni oluşturan çok damlacıkları üreten iyonlaşma bitkisinin doğal sıvı veya solvent Uygula oluşur IED bitki yüzeyine. Doku üzerinde bir sivri uç electrospray kolaylaştırır ve kesim tarafından meydana gelen veya oluşturulan doğal olarak olabilir.

Yaprak sprey MS yarar-si olmak kurmak geniş bir uygulama yelpazesi için olduğu gibi bitki doku nitel ve yarı nicel analizi için hızlı bir yöntemdir. Örneğin, teknik endojen bileşikleri ilişkili tür ayırt etmek ve hatta farklı koşullar altında yetiştirilen aynı tür değişimler değerlendirmek için algılamak için kullanılan. Önceki çalışmalar beautyberry (Callicarpa L.) metabolitler ölçerek bu yaklaşım göstermiştir 12 ve Amerikan ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. ikinci örnekte, ginsenosides, amino asitler ve oligosakkaritler ham ginseng doku ıslatma sonra tespit edilemedi. Vahşi ve ekili Amerikan ginseng yumru dilimleri6' dan farklı. Ginseng yumru bütünlüğü için bir sonraki morfolojik ve mikroskobik muayene6izin izleyen yaprak sprey MS, korundu. Ayrıca, bitki örnekleri eksojen bileşikler de tespit edilebilir. Böcek ilaçları (acetamiprid, difenilamin, imazalil, linuron ve thiabendazole) bir dizi kabuğu veya meyve ve sebze9hamuru tespit edildi. Bu çalışmalar ve diğer pek çok yaprak sprey MS yarar çeşitli özel amaçlı göstermiştir iken, detaylı bir protokol daha önce bildirilmemiştir.

Burada, protokol açıklama yöntemi belirli bir doku veya bileşik optimizasyon üzerinde odaklanmak değil. Aksine, mesembrine alkoloidler üzerinden tortuosum tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) algılama örnek olarak bir yaprak sprey MS deneme için bir tür, doku, ayarlarken alınması gereken gerekli optimizasyonu önlemleri görüşmek üzere kullanılan veya ilk kez compound(s). S. tortuosum Güney Afrika'nın yarı kurak Karroo bölgesine sulu bir endemik var. Geleneksel tıp San ve Khoi Khoi halklar, iştah ve susuzluk bastırılması de onun psikotropik ve analjezik etkileri14,15gelince için kullanıldı. Şu anda standart özü nöropsikiyatrik ve nöropsikolojik bozukluklar16,17tedavisi için kullanılmaktadır. Birincil bileşikler ilgi alkaloid mesembrine ve birçoğu da ilgili tortuosum türler15' te bulunur onun türevleri içerir. S. tortuosum vahşi ve ekili nüfus mesembrine alkoloidler, değişken konsantrasyonları böylece bir kalite kontrol meydan okuma18sunulması var. Bir yöntem gibi yaprak sprey MS, mesembrine alkoloidler hızlı tespiti için tortuosum ürünleri izlemek yararlı olabilir. Çünkü daha önce yaprak spreyi MS tekniği için detaylı görsel Deneysel protokol olmuştu, S. tortuosumörneği kullanarak yöntemi gösterilecektir ve aşağıda anlatılan: nanospray kaynak modifikasyonu seçimi ve bitki dokularında hazırlanması, verileri edinimi, sonuçların yorumlanması ve MS parametrelerinin optimizasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nanospray kaynak yaprak için yapılan değişiklikler MS sprey

  1. Değiştirilmiş nanospray kaynak yaprak sprey MS için kullanın. Herhangi bir sıvı bileşen yaprak sprey MS için gerekli olduğundan, kaynak kaynak LC sonda kaldırarak değiştirin.
  2. Bitki doku kaynak tanıttığım için uygun iğne ile gerilim uygulanacağı yaprak sprey MS tel bir araya getirin. PIN bir sonuna kadar yalıtılmış bir tel lehim; bir kelepçe tel ters sonuna lehim.
    Not: Kelepçe (timsah klip türü) diş olabilir veya olmayabilir. Küçük doku için bir kelepçe diş olmadan tercih edilir. Bir isteğe bağlı esnek kol ile bir kelepçe bitki doku konumlandırma yardımcı olmak için nanospray kaynağına eklenebilir. Not Bu iletişim özellikle nasıl bir melez quadrupole iyon kapanı kitle Çözümleyicisi üzerinde MS sistem yaprak sprey MS gerçekleştirileceği anlatılmaktadır (bkz. Tablo reçetesi); Ancak, diğer MS sistemleri bu tekniği6gerçekleştirmek için değişmiş olabilir. Yaprak sprey kaplin MS bir taşınabilir kütle spektrometre, gerçek zamanlı kimyasal analiz laboratuvarı19,20bitki malzeme taşımak için gerek kalmadan yerinde gerçekleştirilebilir.
  3. Kaynaktan yüksek voltajlarını kullanırken ortaya çıkabilecek elektrik deşarj azaltmak için kaynak altındaki katta bir anti-statik kat mat yerleştirin.

2. yaprak sprey MS için MS sistem hazırlanması

  1. Sistem kullanımda son zamanlarda, dokunmak serin ve herhangi bir alternatif kaynak ve süpürme koni kaldırmak için izin. Nanospray yaprak sprey MS kaynağı iliştirebilirsiniz.
  2. Bir melodi oluşturarak uygun iyonlaşma parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: kılıf, yardımcı ve süpürme gaz 0; 2-5 kV için sprey voltaj; 150-250 ° c kılcal sıcaklığı; ve 50 S-objektif RF seviyesine. İstenen parametreler8,13ile tune kaydedin. Voltaj ve sıcaklık dokusunun en iyi iyonlaşma ve compound(s) ilgi için en iyi duruma getirme.
    Not: başlangıç noktaları iyi 4 olan kV ve 200 ° c
  3. Yaprak sprey MS ayar dosyası ile de dahil olmak üzere bir yöntem dosyası: pozitif ve negatif tam MS; 70.000 çözünürlüğe; AGC hedef 1 x 106; en çok 200 MS; ve istenen tarama aralığı m/z. Alternatif olarak, sadece 1 polarite kullanın.

3. araç, çözücüler ve bitki dokusu hazırlanması

Not: Her zaman eldiven giymek ve işlenene bitki dokusu çıplak elleriyle kullanmayın. Aksi takdirde, Polietilen glikol gibi kirletici iyonları spectra hakim olacaktır.

  1. Bitki doku analizi için hızlı bir örnekleme için izin vermek için MS sistem aynı odada için getir.
  2. Doğal olarak sivri bir uç yok bitki doku için konik noktası (Şekil 2) kesmek için bir cam slayt üzerinde bir jilet kullanın. Doku enstrüman duyarlılık, doku türü ve compound(s) ilgi temel analiz için gerekli miktarını belirler (Örneğin, Genç S. tortuosum yaprak yani ~ 5 mm uzunluğunda).
    1. Kesim S. tortuosum 10 hafta sonrası çimlenme her bir noktası oluşturmak için bir konik ucuyla ince şeritler halinde bırakır.
  3. Forseps yavaşça klempe sonunda bitki doku seçmek için kullanın. Doku forseps ile tutarak, dikkatle için kelepçe aktarmak.
    Uyarı: gerilim açıksa araç kaynak dokunmayın.
  4. Böylece bitki doku ve iyon giriş MS arasındaki mesafe 5-10 mm için (Örneğin, TSQ) triple quadrupole doku MS giriş doğrultusunda konumlandırmak için kelepçe ile esnek kol ve tel ayarlamak ve doğrusal tuzak quadrupole (LTQ) ve 10 -İyon kapanı kitle analyzer (Örneğin, orbitrap)850 mm.
    1. Tel karşı tarafındaki diğer ucuna kaynağına takın. İlk deneme bir düşük sinyal şiddeti üretmek, bitki doku daha yakın iyon koya hareket (en iyi duruma getirme için tartışma bakın).
  5. Yöntemi dosya yüklemek; veri dosyası ad ve dosya depolama konumunu ayarlayın. Sonra MS sistemde oynamak tıklatarak açın ve veri alınıyor başlamak için Başlat ' ı tıklatın.
  6. Bir çözücü (Örneğin, metanol) geçerli bir damlalıklı elleri ve Kullanıcı korumak için yüksek gerilim arasındaki mesafe en üst düzeye çıkarmak için olan bir jel-yükleme ipucu kullanarak.
    Not: Çözücü birim boyutu, kuruluk ve doku doku bağlıdır gereken, genellikle ~ 2-20 µL. S. tortuosum yaprakları eklenecek herhangi bir solvent gerektirmez. Çözücü dikkatle uygulayın ve gerilim açık olduğunda araç kaynak dokunmayın. LC-MS sınıf çözücüler ve asit yıkanmış ve deterjanlar ücretsiz cam kullanın. Bazı dokularda bir sinyal bir çözücü bitki doku doğal su içeriği nedeniyle ek olmadan gözlenen. Ancak, bir büyük sinyal yoğunluğu ve düşük S/N genellikle elde edilir bir çözücü için doku uygulayarak.
  7. Sinyal devam ederse ya da yeterli spectra toplayana kadar veri elde genellikle 30-60 s. Gerekirse, ek çözücü yüksek sinyal şiddeti daha uzun bir süre korumak için geçerlidir. Veri toplama durdurmak ve MS sistem duraklatabilirsiniz.
  8. Dokuyu ve kelepçe % 100 metanol ve hav bırakmayan bir mendil ile yıkayın. MS iyon giriş sonra yaklaşık 1-2 h-edinimi yaprak sprey MS tarafından satıcı özelliklerine göre temiz. Ayrıca, MS iyon giriş analizleri farklı doku türlerinin arasında temiz.

4. veri kalite değerlendirmesi

  1. Veri dosyasını açın ve temel pik kitle chronogram kontrol edin. Sinyal şiddeti ~1.0 x 107 5.0 x 10 için olup olmadığını kontrol edin8. Sinyal düşükse, daha yakın doku iyon koya hareket. Çok daha yüksek, MS sisteminin ön uç kirli olacak doku iyon giriş kadar uzak hareket.
  2. Üretilen kitle spectra ilgi iyonları olup bağlı olarak, parametreleri değiştirmek.
    Not: Protokol burada duraklatılmış.

5. tandem kitle parçalanma

  1. İyonları tandem kitle parçalanma (MS/MS); için ilgi vardır karar > 1.0 x 10 bir kitle spectra sinyal5 MS/MS için iyonları seçimi için yeterli.
  2. Bir ekleme listesi m/z ile yeni bir yöntem dosya 4 ondalık basamağa olun. Tıkırtı üstünde genel listeleri ve dahil. PRM özellikleri' nin altında parçalanma enerji seçin [örnormalleştirilmiş çarpışma enerjisini 30-50 (NCE) olduğunu iyi bir sıra ile başlamak] ve diğer MS/MS parametreler.
    1. Mesembrine alkoloidler için MS/MS verileri elde etmek için aşağıdaki iyonları, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zve 292.1897 m/z, NCE 35 parçası.
      Not: MS/MS veri toplama hemen sonra MS veya daha sonra gerçekleştirilebilir. Aynı doku kez tam bir MS sonra klempe kalabilir ve MS/MS veri elde etmek için yeniden kullanılabilir. Bir respraying yeterli sinyal sağlamaz, ancak, yeni bir doku kullanın.
  3. MS/MS yöntemi dosya ve bir adlandırılmış veri dosyası yükleyin. MS sistemde açıp başlatmadan veri alma, bir çözücü ekleme. Genellikle yeterli spectra toplanan sonra 30-60 s, satın alma durdurur.
  4. Parçalanma, birçok farklı enerji parçası iyonları atarken toplamak.
    Not: bu yana kromatografik ayırma yaprak sprey MS yoksun, parçalanma spectra birçok iyonları bulunma olasılığı ve farklı enerjilerde parçalanan açıklık getirmek yardımcı olacaktır.

6. sözde tanımlamaları doğru kütle ve Tandem kitle parçalanma tarafından

  1. Metlin21, insan Metabolome veritabanı22, kitle banka23, Lipid haritalar24, Ulusal Enstitüsü gibi kamuya metaboliti veritabanlarındaki doğru kitle ölçümler başvurarak sözde kimlikleri olun Standartlar ve teknoloji MS25, saygı fitokimyasallar26veya GNPS27için arama.
  2. Bu veritabanları ayrıntılı değildir olarak gerektiği gibi kimyasal olarak karakterize bitki türü üzerinde ek bir literatür gerçekleştirin.
  3. Maç parçalanma iyonları yaprak üzerinden MS/MS MS/MS bilgi hazır olduğunda yukarıda belirtilen veritabanlarına veya edebiyat sprey. Alternatif olarak, MS/MS parçası iyonları el ile yorumlanması veya direkt enjeksiyon veya LC-MS/MS tarafından gerçekleştirilen bir otantik standart bir parçalanma kullanın.

7. veri analizi

  1. MS raw dosyalarını Proteowizard28msConvert aracını kullanarak mzXML dosyaları dönüştürmek.
  2. R de en yüksek çekme için uygulanan XCMS yazılım paketi kullanın. Işleme yöntem yaprak spreyi MS analizi için doğrudan bir infüzyon kullanın.
    Not: veri işleme için kullanılan iyi açıklama eklediğiniz komut dosyaları https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code bulunabilir.
  3. Yarı nicel ölçümler için deneysel değişkenliği, muhasebe, elde etmek için her metaboliti yoğunluğunu MS sinyal şiddeti kısmen konumlandırma içinde küçük farklılıklar nedeniyle değişebilir yaprak sprey olarak toplam iyon tarafından geçerli (TIC), normalize Kaynak ve yaprak şekli ve boyutu farklılıkları yaprak.
  4. Alternatif olarak, (http://mzmine.github.io/ bulunabilir için) veri analizi veya MZmine2 satıcı tarafından sağlanan yazılımı kullanın29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

10 hafta sonrası çimlenme, taze toplanan sera yetiştirilen S. tortuosum yaprakları yaprak sprey MS tarafından analiz edildi. S. tortuosum üzerinden metabolitleri algılamak için deneysel iş akışı MS Şekil 2' de gösterildiği yaprak sprey kullanarak bırakır. Bir yaprak bir noktası oluşturmak için bir konik ucuyla ince bir şerit halinde kesip, seçilen ve yaprak sprey MS tel kelepçe aparatı ile sabitlenmiş. Bitki doku ~ 30 mm iyon giriş ve x - ve y-axes doğrultusunda yerleştirildi. S. tortuosum MS yaprakları yaprak sprey başlatılması iyonlarının çözücü herhangi bir uygulama tespit edildi. Bitkiler tortuosum ailesinin succulents yaprak sprey MS olmadan bir çözücü dış uygulama tarafından electrospray iyonlaşma sağlayan bir yüksek su içeriği ile kalın yaprakları ile vardır. Ancak, en tipik olarak, bitki doku iyonları algılamak için çözücü bir uygulama gerektirir.

Bir kitle chronogram ve kitle spectra ağır iyonları ile doldurulan 30'dan sonra üretildi s Alım olumlu iyonlaşma modunda (Şekil 3). Chronogram MS nerede istikrarlı bir sinyal alım tam süresince devam edildi deneme başarılı yaprak sprey temsil eder. Bu çalışmada, dokuz mesembrine alkoloidler MS ve sözde tanımlamaları protonated iyonları tam kütlesi daha önce yapılan yaprak sprey tarafından algılanan toplam bileşikler (Tablo 1)30ile karakterizedir. Yaprak sprey MS biraz farklı kitleler gidermek mümkün kılan bir yüksek çözünürlüklü, doğru-kitle (HRAM) kütle spektrometre üzerinde gerçekleştirmek için avantajlıdır. Örneğin, 262.1794, m/z putatively yerine dihydrojoubertiamine olarak mesembrenone-M olarak belirlenmiştir (demethyl - dihydro-), hangi m/z 262.1443 olurdu.

Yaprak dokusu bir tandem kitle (MS/MS) (Tablo 1) ilgi birkaç iyonlar için parçalanma klempe kaldı. Şekil 4 üç MS/MS parçalanma spectra ürününün yaprak sprey MS, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zve 292.1897 m/zgösteriyor. Sözde kimlikleri kitle parçaları tarafından doğrulanmadı ve önceden tanımlanan parçaları30ile doğruladı. 276.1583 m/z protonated iyon mesembrine-M iki farklı izomerler tespit edilmiştir (demethyl) ve mesembrenone-m her izomer (Tablo 1) tanı parçalarının varlığı nedeniyle başka bir iki izomerler.

Mesembrine ve mesembrine-M (dihydro-) yaprak sprey MS tarafından algılanır ve putatively'de kitle parçalanma tam kitle tarafından tanımlanan. Mesembrine 290.1742 m/z protonated iyon spektrumda en bol bulunan iyonların biridir; Bu nedenle, bu bir biyomarker gelecekteki çalışmaları için olası bir aday olabilir. İki ana alkoloidler S. tortuosum , mesembrine ve mesembrenone, ikisi de kolayca yaprak sprey MS tarafından tespit edildi vardır. Birkaç yaprak sprey MS tortuosum türetilmiş ürünleri, bitki malzemelerden izlemek yararlı olabilir tarafından algılanan bileşikler.

Figure 1
Şekil 1: yaprak sprey MS diyagramı tuzak. Yaprak parfümüdür MS bir metaboliti olduğu gibi bitki doku hızlı örnekleme için sağlar yöntemi profil oluşturma. Diyagram bir yaprak sprey MS bir kelepçe ve bitki dokusu ile bir çözücü uygulamak için seçeneği ile uygulanan kV yüksek gerilim ile gösterir. Yaprak sprey MS MS giriş içine doğrudan doğruya--dan bitki doku electrospray iyonlaşma kolaylaştırır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: iş akışı yaprak spreyi MS deneme. Seçilen bitki doku, tortuosum tortuosum yaprak kesebilir sonra klempe ve iyon giriş veri alım öncesinde önünde yer alan forseps ile transfer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Metaboliti tortuosum tortuosum olumlu iyonlaşma ile yaprak sprey MS tarafından profil oluşturma. (A) Bu panel gösterir bir yaprak sprey MS toplam iyon sayısı (TIC) kitle chronogram. Her tepe için üstteki sayıyı süresi (dk) ve alt m/z. (B) Bu panel yaprak sprey MS metaboliti profil tortuosum tortuosum olumlu kitle spektrum gösterir. İlave 260-295 m/zgörüntüler. Doğru kitleler 4 ondalık basamakla bir hata < 6 ppm ile rapor edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Yaprak yaprak sprey MS olumlu iyonlaşma tandem kitle spectra tortuosum tortuosum üzerinden kesti. Bu paneller tandem kitle spectra (MS/MS) pozitif iyonlaşma modunda MS. Putative tanımlamaları, alkoloidler doğru kütle ve aşağıdakiler için kitle parçalanma yapılır yaprak sprey ile toplanan göster:(a)mesembrine-M ve mesembrenone-M izomerler, (B) mesembrine ve (C) mesembrine-M (dihydro-). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik Moleküler formülü Ölçülen Monoisotopic kütlesi m/z [M + H] ppm hata Parçaları
Dihydrojoubertiamine C16H23hiçbir2 262.1794 5.0 N/A
Mesembrenone-M (O - demethyl-) C16H19Hayır3 274.1431 4.5 N/A
Mesembrine-M (O - demethyl-) C16H21Hayır3 276.1583 5,9 121, 152, 195, 201, 218, 219, 258
Mesembrine-M (N - demethyl-) C16H21Hayır3 276.1583 5,9 109, 121, 138, 189, 201, 218, 247
Mesembrenone-M (O-- dihydro - demethyl) C16H21Hayır3 276.1583 5,9 124, 205, 218, 227, 245
Mesembrenone-M (N-- dihydro - demethyl) C16H21Hayır3 276.1583 5,9 120, 151, 210, 229, 241
Mesembrenone C17H21Hayır3 288.1587 4.3 124, 151, 191, 199, 226, 230, 257, 270
Mesembrine C17H23NO3 290.1742 4,9 110, 121, 134, 152, 201, 215, 219, 232, 233, 241, 259, 260, 272
Mesembrine-M (dihydro-) C17H25Hayır3 292.1897 5.2 151, 177, 201, 217, 243, 259, 274

Tablo 1: sözde tanımlamaları, Tortuosum tortuosum mesembrine alkoloidler yaprak sprey MS. tarafından Bu tablo olumlu iyonlaşma doğru kitleler ve parça iyonları tortuosum tortuosum mesembrine alkoloidler için raporlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bitki türleri, doku türü ve hedef compound(s) ilgi için çeşitli adımlar optimizasyonu başarılı kullanımı, bu iletişim kuralını kullanır. İletişim kuralında tanımlanan parametreler iyi bir başlangıç noktası sağlar. Aşağıdaki deneysel kararlar yapılan test ve olması gereken: olsun veya olmasın kullanımı (1) kesme veya kesilmemiş doku ve (2) çözücü veya hiçbir solvent, kullanmak için (3) ne solvent ve hangi birim, (4) ne iyon giriş dokudan mesafe olmalıdır ve (5) gerilim genlik. En iyi duruma getirme amacı üretmek için en az 30 devam ederse sürekli bir sinyal koşulları bulmaktır s birkaç dakika için. Koşulları tam kütle ve MS/MS ölçümleri gerçekleştirmek için gereken yeterli ve tekrarlanabilir sinyal şiddeti sağlamalıdır. Yüksek sinyal şiddeti iyonlar dokusundan başarılı ve güvenilir bir sprey yoluyla elde edilir. Sprey kalite iyon giriş, doku ve iyon giriş ucu ve uygulanan elektrik voltaj arasındaki uzaklığı doğru işaret doku ucu keskinliğini bağlıdır. Başarılı bir sprey yüksek doku uç noktası netlik üzerinde bağlıdır ve bazı durumlarda, doku bir sivri uç oluşturmak için kesmek gerekir. Özellikle, kesme doku ucundaki konik şekil bakış açısı netliği içinde hafif değişiklikler iyonlaşma elde edilen kalitesi üzerinde önemli etkileri var ve böylece üretilen sinyal şiddeti7. Çim bıçakları veya lanset şeklinde yaprakları5,13modelinde olduğu gibi nerede dokulara zaten işaret etti durumda, o zaman hiçbir kesim, gereklidir.

Bir iyon sinyal bastırılır ve kararsız plazma deşarj olmanın bir sonucu olarak dokusundan ortaya çıktığında çok yakın iyon giriş veya elektrik gerilim çok yüksek olması için yerleştirilir. Uygun konumlandırma doku ve elektrik voltaj çeşitli örnekleri arasında istikrarlı ve tutarlı sprey sağlamak için gereklidir. MS iyon giriş dokudan mesafe de üretilen sinyal miktarı ve kalitesini etkiler. Genel olarak, her ne kadar küçük ölçekli doku bir düşük sinyal şiddeti ucu çok sivri veya yüksek konsantrasyonlu bileşiklerdir neden olabilir değil daha küçük bir doku örneği koya, daha yakın yerleştirilmelidir. Yoğunluk ve tutarlılık spectra ürününün ampirik olarak z ekseni boyunca çeşitli yerleşim kademelerde karşılaştırarak optimize edilmelidir. Bitki doku hem x - ve y-axes MS iyon giriş ile hizalanır uygun bir iyonizasyon önemlidir. Bitki doku makul iyon giriş yakın ise, ancak, bu iyon optik ve MS sisteminin ön uç bir daha sık temizlik gerekebilir.

Doku üzerine uygulanan solvent hacmi 0 - 50µL su içeriği ve doku örneğinin boyutu bağlı olarak değişebilir. Doku su içeriği son derece yüksektir ve kesilir, etli tortuosum, durumunda olduğu gibi durumlarda hiçbir solvent eklenebilir. Ancak, en az 5-10 µL solvent, en az bir uygulama için kullanmak daha normaldir. Bir çözücü ilavesi kurutulmuş doku veya taze doku sprey kolaylaştırmak için bir yüksek su içeriği ile kullanırken gereklidir. Çözücü az miktarda bitki materyali büyük bir parçası üzerinde kullanılıyorsa, bu büyük olasılıkla yeterli bir sprey üretmeden absorbe edilebilir. Diğer taraftan, çok yüksek bir birim kullanılıyorsa, bileşikler seyreltilmiş veya uygun desolvation değil kolayca ve verimli bir şekilde ortaya çıkar. El ile solvent pipetting için alternatif bir seçenek gözlenen sinyal bozuluyor bileşik olarak zamanın bir fonksiyonu olarak tükenmiş bitki malzeme10' dan böylece sürekli çözücü bir şırınga pompa ile doku uygulamaktır. Çeşitli çözücüler denenmelidir ve herhangi bir iyileşme miktarı ve faiz compound(s) için ion(s) tutarlılığını doğrulamak için elde edilen spectra göre. Bir çözücü ilavesi sadece sprey üretir ama bir seçicilik farklı bileşikler çıkarılması için de sağlayabilir. Organik çözücüler farklı kutuplar (metanol, diklorometan, hexanes, Asetonitril, kloroform ve aseton) ile karşılaştırıldığında var ve önemli ölçüde farklı iyonları bir fıstık tohum8spectra içinde mevcut neden. Bu birçok bitki doku ve fitokimyasallar, amino asitler, alkoloidler, flavonollar, karbonhidrat, organik asitler, yağ asitleri ve fosfolipitler8geniş bir yelpazesi için iyi çalışması için gösterdiği gibi genel olarak metanol iyi bir ilk solvent, seçimdir. % 100 su saf bitki doku üzerine uygulanması genellikle iyi çalışmaz ama tuzları10eklenmesiyle gelişmiş olabilir. Birçok durumda, bir bileşik protonated iyonları yanı sıra diğer bol adducts sodyum ve potasyum gibi algılanır adducts. Bu tuz varlığı adducts tuz için solvent eklendiğinde ve yararlı olabilir, hatta daha prevalandir. Örneğin, bir duyarlılık arttı ve Populus türlerden bakalit glikosidler selectivity sodyum ve potasyum iyonları ile uygulanan çözelti10ilavesi ile tespit edildi.

İki büyük yaprak spreyi MS tekniği (1 düşük dinamik alan ve (2) Nefelometri güçlüklerin sınırlamalardır. Genellikle, yalnızca en bol bulunan bileşikler iyonize ve tekniği ile tespit edildi. İyonlaşma verimliliği önemli ölçüde kromatografik ayırma yokluğunda oluşur iyon bastırılması nedeniyle düşüş bol metabolitleri ile bir sorun daha az olduğunu. Bu sınırlamayı aşmak için tarama aralığı yalnızca ilgi m/z aralığındaki odaklanmak için ayarlanabilir. Ancak, düşük-bereket bileşikler hala ayırma ve konsantrasyon Kromatografi tarafından sağlanan olmadan algılanmayabilir. Tipik Nefelometri ekstresi üzerinden bileşiklerin aksine kendi standartlarına düzgün yaprak sprey önce bitki materyali içine MS. Semi-quantitative ölçümleri karıştırılamaz ve göreli konsantrasyonları bilinen bir yerleştirerek elde edilmiştir Standart bir çözüm konsantrasyonu doku yüzey ve daha sonra izin veren bir yaprak sprey MS analiz8,9,31önce kurumasını. Örneğin, Nefelometri standart ek yöntem temsilcisi Ion iyon göreli miktarları32belirlemek ilgi için dahili standart için oranını hesaplamak için kullanıldı. Bir kalibrasyon eğrisi göreli yoğunlaşmasını tahmin etmek için kullanıldı. Bu yöntemi kullanarak, bir iç standart, rebaudioside D için çeşitli glikosidler oranını karşılaştırmak mümkün olduğunu, belirli glikosidler göreli yoğunlaşmasını sonra Steiçinde yaprakları33hesaplanacak ve. Alternatif olarak, ticari kullanılabilirlik bir meydan okuma olabilir rağmen daha doğru Nefelometri bileşik faiz, isotopically etiketli bir standart ile mümkün değildir. Metabolik olarak etiketli bitki doku kullanımı da bu yöntemi34ile Nefelometri artırabilirsiniz.

Verilen bu geleneksel LC-MS/MS bir geniş numune hazırlama ve kromatografik ayırma gerektirir, analiz için diğer yöntemleri kez istenilen. Yaprak sprey MS kolayca uygulanabilir ve basitlik, hassasiyet, doğruluk ve hızlı metaboliti algılama ve yarı Nefelometri sunuyor bir doğrudan kimyasal analiz tekniğidir. Bu nedenle, biz yaprak sprey türü üzerinde biyokimyasal temel tortuosum ayrım yapmak chemotaxonomic araçlar için temel sağlayan S. tortuosum, kimyasal içeriği izlemek için MS uygunluğu araştırdık imzalar. Çeşitli anatomik Özellikler bu bitkinin yaprak spreyi MS için bir ideal test örnek olun. Sprey bir çözücü uygulaması olmadan oluşturulabilir olarak avantajlı olan su, yüksek miktarda içeren bir sulu olduğunu. Tortuosum yaprak nerede özel metabolitleri birikebilir depolama rezervleri hizmet idioblasts (mesane benzeri hücreler)15 içerir. Yaprak sprey MS, bitki doku hızlı bir şekilde niteleyen bir vivo içinde analiz tekniğidir. Genel Teknik birçok bitki türü, doku türleri ve sınıfları bileşiklerin geçerlidir. Sağlık, beslenme, tarım ve enerji35insan kullanımlar için bitki birincil ve özel metabolizma anlamak için büyük ilgi bitki bileşikler hakkında bilgi yakalamak teknikler vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser NSF bitki genom araştırma programı hibe IOS-1238812 ve doktora sonrası bursu biyoloji IOS-1400818 tarafından finanse edildi. Çalışma ayrıca bir Monsanto yüksek lisans öğrencisi bursu için Katherine A. Sammons tarafından finanse edildi. Fulbright Afrika araştırmacı âlimler Program (2017-2018) Nokwanda s. Makunga için layık finansmanı için teşekkür etti. Jessica Prenni nanospray kaynaktan bağış ve Colorado State Üniversitesi'nde proteomik ve Metabolomics tesis takdir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Conn Pin Digi-Key elctronics WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp Digi-Key elctronics 314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics 290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. Metlin. , Available from: http://metlin.scripps.edu (2018).
  22. Human Metabolome Database. , Available from: http://www.hmdb.ca/ (2018).
  23. Mass Bank. , Available from: http://www.massbank.jp/?lang=en (2018).
  24. Lipid Maps. , Available from: http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html (2018).
  25. National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from: http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/ (2018).
  26. ReSpect. , Available from: http://spectra.psc.riken.jp/ (2018).
  27. GNPS. , Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018).
  28. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  31. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  32. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate? Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  33. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  34. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  35. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

Biyokimya sayı: 136 yaprak sprey MS kütle spektrometresi electrospray iyonlaşma ortam iyonizasyon tortuosum tortuosum mesembrine alkoloidler doğal ürünler bitki metabolitleri küçük moleküller
Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freund, D. M., Sammons, K. A.,… More

Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter