Summary
Циркулирующих микроРНК показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда. В этом исследовании мы описываем протокол для извлечения Мирна, обратной транскрипции и цифровой ПЦР для количественной оценки абсолютной интерферирующим в сыворотке крови больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Abstract
Циркулирующих сыворотки микроРНК (интерферирующим) показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда (ами), освобождаются от сердечно-сосудистых клеток в кровоток. Циркулирующих интерферирующим очень стабильны и могут быть количественно. Количественном выражении конкретных интерферирующим могут быть связаны с патологии и некоторые интерферирующим шоу высокого ткани и специфики болезней. Поиск нового биомаркерами для сердечно-сосудистых заболеваний имеет важное значение для медицинских исследований. Совсем недавно была изобретена цифровая полимеразной цепной реакции (dPCR). dPCR, в сочетании с флуоресцентные гидролиза зонды, позволяет конкретных прямых абсолютной количественной оценки. dPCR демонстрирует превосходные технические качества, включая низкий изменчивость, высокой линейности и высокой чувствительностью по сравнению с количественным полимеразной цепной реакции (ПЦР). Таким образом dPCR является более точные и воспроизводимые метод непосредственно количественной оценки адаптивной, особенно для использования в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний. В этом издании мы опишем, как для эффективного выполнения цифровой ПЦР с целью оценки абсолютной копией номер в образцах сыворотки.
Introduction
Циркулирующих интерферирующим были определены как перспективные маркеров для целого ряда заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний1. Интерферирующим малы, -кодирования молекулы одноцепочечной РНК (длиной около 22 нуклеотидов) участвуют в post-transcriptional регулирование через изменения РНК перевода и влияющих на выражение гена2, и выпускаются в обращение в физиологических и патологических государствах. Количественном выражении конкретных интерферирующим могут быть связаны с патологией, и некоторые интерферирующим показать высокий ткани и болезни специфика1. Сердечно-сосудистых заболеваний адаптивной стали привлекательными кандидатами как нового биомаркерами потому, что они чрезвычайно стабильны в сыворотке крови и может легко быть количественно с помощью ПЦР методологии3. Потенциальную ценность интерферирующим качестве биомаркеров для инфаркта миокарда были оценены в небольших исследований, но проверки в большой когорты хватает2. К примеру мир-499 встречается сильно выражена в мышцу миокарда, и было показано, значительно возросла в ами4,5,6. Кроме того, он регулирует запрограммированы гибели клеток (апоптоз) и дифференциация кардиомиоцитов и таким образом участвует в нескольких механизмов после ами7. За исключением некоторых небольших исследований, превосходства и добавочное значение интерферирующим для диагностики ами отчетности превосходства или равенства к высок чувствительности сердечной troponins не еще было доказано в крупномасштабных исследований2,5 6, ,8. Более перспективные исследования в большой когорты таким образом, необходимо оценить потенциальную ценность диагностических адаптивной. Кроме того методы количественной оценки Мирна необходимо оптимизировать и стандартизированных с использованием сопоставимых протоколы9. Стандартизированных анализы могут уменьшить несогласованные результаты и может помочь интерферирующим стать потенциальным биомаркеров для рутинной клинического применения, как биомаркеров должны измеряться в воспроизводимый способом обеспечить их клинического применения.
Недавно dPCR была введена в качестве конечного анализа. Это разбивает образца на приблизительно 20 000 индивидуальных реакций10. DPCR система затем использует математические Пуассона статистический анализ флуоресцентные сигналов (положительных и отрицательных реакций), позволяя абсолютный количественной оценки без стандартной кривой10. При объединении dPCR датчиками флуоресцентные гидролиза, весьма конкретных прямых абсолютной количественная оценка интерферирующим стало возможным. Цифровая полимеразной цепной реакции, как показано, демонстрируют превосходные технические качества (включая снижение изменчивости, увеличение повседневной воспроизводимости, высокая степень линейности и высокой чувствительностью) для количественного определения уровней микроРНК в обращения по сравнению с количественной реальном масштабе времени PCR10,11. Эти превосходные технические качества может помочь смягчить нынешние ограничения на использование циркулирующего интерферирующим в качестве биомаркеров и может привести к созданию интерферирующим биомаркеров в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний, а также как диагностический метод в Общие. В предыдущем исследовании мы недавно применяется dPCR абсолютной количественного определения циркулирующих интерферирующим у больных с AMI и смогли продемонстрировать превосходное диагностический потенциал, по сравнению с количественной оценки интерферирующим ПЦР12.
В этом издании мы хотим продемонстрировать, что с помощью dPCR точные и воспроизводимые метод непосредственно количественной оценки распространения сердечно-сосудистых адаптивной. Абсолютная количественная оценка Мирна уровней в сыворотке, используя цифровой PCR, показывает потенциал для использования в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний. В этом издании мы подробно описать, как эффективно выполнять цифровой ПЦР и как определить номер копии абсолютный микроРНК в сыворотке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Добыча Мирна от сыворотки/плазмы
Примечание: Для того, чтобы надлежащим образом оценить количественно адаптивной, правильный микроРНК изоляции от сыворотки/плазмы представляет собой решающий шаг. Главное иметь в виду, особенно потому, что существуют различные протоколы, должен придерживаться того же рабочего процесса при обработке образцов. В этом протоколе Мирна добывается из 50 мкл сыворотки. Не используйте более чем 200 мкл, как этот предел процесс правильного извлечения.
- Подготовить сыворотки или оттепель замороженных образцов.
- Добавьте 250 мкл (5 томов) коммерческие лизис реагента в 50 мкл сыворотки. Поддержка lysis, vortexing. Поместите трубку с lysate на скамейке при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Спайк lysate с 3.5 мкл Спайк в управления (1.6 x 107 копий/мкл) и смешать их на vortexing.
- 50 мкл хлороформа (то есть, равное количество относительно начала образцов сыворотки) для отделения фазы. Встряхните трубки для 15 s. место трубку на скамейке при комнатной температуре на 2-3 мин.
- Для этапа разъединения центрифуга трубки на 12000 x g при 4 ° C на 15 мин.
Примечание: в настоящее время образцы разделены на верхней водной фазе, содержащие РНК, белый межфазной и ниже, розовый органические фазы. - Передача верхняя водной фазе (100 мкл), содержащие РНК в новую трубу. Не передавать любой материал, белый интерфаза, как это фальсификация правильного подсчета РНК.
- Добавьте 150 мкл (т.е., 1.5 x объема передаваемых образца) 100% этанола. Смешайте материалы, закупорить их вверх и вниз. Не центрифуга для них и быстро перейти к следующему шагу.
- Пипетка 250 мкл образца на коммерческих спин столбец в 2-мл пробирку коллекции. Закройте крышку. Центрифуга для столбца > 8000 x g при комнатной температуре 15 s. отклонения потока через.
- Мкл 700 коммерческих стиральных буфера № 1 в столбце спина. Закройте крышку и центрифуги столбца > 8000 x g при комнатной температуре 15 s. Отменить прогон Отмывающий буфер.
- Добавьте 500 мкл коммерческих стиральных буфера номер 2 в столбце спин. Закройте крышку и центрифуги столбца > 8, 000 x g при комнатной температуре 15 s. Отменить прогон Отмывающий буфер.
- Пипетка 500 мкл 80% этанола в столбце спина. Закройте крышку, центрифуга столбца > 8, 000 x g при комнатной температуре на 2 мин отбросить коллекции трубка с потока через.
- Трансфер столбце спина в новой коллекции 2-мл пробирку. Центрифуга для столбца на полной скорости с открытой крышкой для просушки мембраны. Выбросите коллекции трубка с потока через.
- Перевести столбце спина в новой коллекции 1,5 мл трубки. Элюировать РНК путем применения 30 мкл РНКазы свободной воды непосредственно к центру мембраны. Закройте крышку. Центрифуга для столбца на полной скорости на 1 мин.
- Магазин РНК-70 ° c.
Примечание: Для хранения очищенной РНК в РНКазы свободной воды от-70 ° C до-20 ° C обеспечивает не деградации мРНК на 1 год. После производителя протокол минимальное количество РНКазы свободной воды, чтобы разбавить РНК — 10 мкл. использование менее 10 мкл могут недостаточно гидрата мембраны и снижения общей доходности РНК.
2. Обратная транскрипция
Примечание: Комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) был синтезирован по протоколу следующие 15 мкл обратная транскрипция (RT) (общая реакция объем).
- Оттепель в комплект RT на льду. Держите ферменты в холодильнике как можно дольше предотвратить их от унизительного и спина их вниз перед использованием. Оттепель RT грунтовки на льду и уменьшается их перед использованием.
- Подготовьте смесь мастер, как описано в таблице 1.
- Комбинат 10 мкл мастер смеси и 5 мкл извлеченные РНК в скважину в 96 хорошо плиты.
- Центрифуга хорошо пластины на 2000 x g при 4 ° C на 2 мин.
- Используйте протокол тепловой цикл, описанные в таблице 2 для обратной транскрипции.
Примечание: Как описано ниже, cDNA могут непосредственно обрабатываться в цифровой машины ПЦР (см. Таблицу материалы); Кроме того она может храниться при температуре-20 ° C.
3. капелька поколения и цифровой PCR
Примечание: Цифровой ПЦР была выполнена с использованием следующих 40 мкл протокола.
- Оттепель в коммерческих dPCR смесь, подготовленный cDNA и праймеры PCR на льду. Центрифуга для них незадолго перед использованием.
- Подготовьте смесь мастер, как описано в Таблица 3.
- Добавьте 1.33 мкл/хорошо RT продукта и центрифуги кратко.
- Пипетка 20 мкл пример в каждой скважине 8-Ну кассеты (средний ряд).
Примечание: Если кассета 8-Ну не заполнены полностью, заполните оставшиеся скважин с non шаблона элементов управления (фнт), опустить cDNA (т.е., RT продукт производится с водой вместо извлеченный РНК) или коммерческих буфера dPCR. НПС служит элемент управления загрязнения. Вода, не должны использоваться в оставшихся скважинах, потому что это будет отрицательно влиять на качество формирования капли. - Пипетка 70 мкл капля масла поколения для датчиков в нефтяных скважинах (Нижняя строка) 8-Ну кассеты.
- Поместите прокладку поверх 8-Ну кассеты и кассеты в генератор капелька. Закройте генератор капелька. Ждать, пока 3 индикатор горит зеленым.
Примечание: в настоящее время создаются капельки. - Тщательно и медленно перевести 40 мкл формируется капля образца (верхняя строка) на отдельных скважин 96-луночных плиты, закупорить.
- После завершения формирования капли на образцах, печать пластину ПЦР с pierceable dPCR фольга на 180 ° C для 4 s.
- Фольга герметичный ПЦР пластину в циклователь и цикла, как описано в таблице 4, рампы со скоростью 2,5 ° C/сек.
4. капелька чтение и анализ
- Передача пластину от тепловой cycler к основанию пластины держателя. Затяните пластину PCR, поместив в верхней части держателя пластины на пластину для ПЦР.
- Запустите программное обеспечение коммерческих dPCR.
- Введите имя образца, имя эксперимент и целевой установки. Выберите абсолютный количественной оценки.
- Запустите капелька, чтение, нажав кнопку Запуск. Выберите FAM/HEX или FAM/Вик обнаружения химии при работе с зондами гидролиза.
Примечание: Коммерческие dPCR программного обеспечения будет затем авто анализ данных. - Проверьте капелька чисел в таблице результатов для обеспечения правильного капелька поколения.
- Выберите все скважины с же количественных Мирна и нажмите кнопку анализ. Используйте 2D пятно следует отметить позитивные капельки и вручную исправить auto проанализированных данных (рис. 1).
5. правильные расчеты на образце
- Нормализовать образца умножением образец нормализации факторов (NF).
NF = средний [C. elegans мир-39 измерений]все образцы/ [C. elegans мир-39]данного образца - Вычислите окончательного Мирна сывороточной концентрации, регулируя для разбавления факторов (DF).
[Мирна] окончательный = [Мирна]необработанное значение x DFRT xdPCR DF x DFEx
Где:
[Мирна] необработанное значение = Мирна, количественно коммерческих dPCR программного обеспечения;
DFRT = коэффициент разбавления шаблона в обратная транскрипция;
DFdPCR = коэффициент разбавления шаблон в dPCR;
DFEx = коэффициент разрежения в добыче.
6. синтетические олигонуклеотида разрежения серии
- Оттепель лиофилизированные синтетических олигонуклеотида на льду. Кратко центрифуги.
- Разбавить лиофилизированные синтетических олигонуклеотида в свободной от нуклеиназы воде до конечной концентрации 10 пмоль / мкл. кратко центрифуга его.
- Развести его в свободной от нуклеиназы водой, как описано в таблице 5. Центрифуга для разбавления кратко между каждым шагом разрежения в 8000 x g 10 s.
- Продолжить с обратной транскрипции, как описано в шаге 2 и анализировать образцы с цифровой ПЦР, как описано в разделе Шаг 3 и шаг 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цифровые PCR, в сочетании с флуоресцентные гидролиза зондов позволяет исследователям непосредственно определить абсолютное количество конкретных интерферирующим в копии/мкл. Как образец в dPCR секционируется в приблизительно 20 000 индивидуальных реакциях PCR, dPCR не требует технического реплицирует10. Система dPCR использует математические Пуассона статистический анализ флуоресцентные сигналов (отличающихся между положительной и отрицательной реакции) включение абсолютной количественной оценки, без необходимости для стандартной кривой10. Для того, чтобы правильно рассчитать концентрации, необходимо количество приемлемых капли (> 15 000). Не шаблон управления обеспечить исключение значительное усиление неспецифической. Все образцы, включенных в анализ обрабатываются с использованием такой же объем, метода и протокол постановки ПЦР для укрепления достоверности полученных результатов. Полученная концентрация в dPCR нормализуются с помощью процедуры срединного нормализации во всех проб, анализируется с синтетической шипами в C. elegans мир-3913. Нормализация данных в отмеренное количество шипами в C. elegans мир-39 исправляет-пример различия в эффективности извлечения РНК и служит элемент реакции PCR, далее добавить к достоверности результатов. Существует нет установленных золотой стандарт для нормализации интерферирующим сыворотки; Однако внешние элементы управления, например шипами в C. elegans мир-39 являются элегантное решение для нормализации процедур, как эндогенных интерферирующим часто изменяются в различных заболеваний государств9.
Образцы анализируемого сыворотки были приобретены до чрескожного коронарного вмешательства (PCI), 8 ч после PCI и 16 h после PCI, от больных с острым инфарктом миокарда сегмента ST фасада (STEMI). СТЕМИ пациентов выставку тяжелой ишемии и таким образом квалифицировать для оценки нового биомаркерами ишемии. Чтобы оценить кинетику мир-499 выпуска и потенциального использования мир-499 как биомаркер для ишемии в сердечно-сосудистых заболеваний, мир-499 была проанализирована с dPCR у всех пациенток для трех различных время очков14.
Рисунок 1 демонстрирует выбор положительных капли, давая окончательный Мирна концентрации рассчитывается путем программного обеспечения. Фракция срабатываний в образце определяет концентрацию копий/мкл как вычисляемые программным обеспечением коммерческих dPCR. Результаты также могут быть визуализированы в 2D сюжет и срабатываний можно вручную пометить кружками. Концентрации рассматриваются только в том случае, если они выше неспецифических амплификации фнт.
Рисунок 2 показывает линейность и добра из приспосабливать ряда искусственных микроРНК олигонуклеотида имеет мир-499-5 p разрежения в дубликаты. Серия 8-шаг разрежения была выполнена из 2500 копий/мкл до 0 копий/мкл. Вычисляемые ожидаемых копий/мкл как описано в таблице 5 себя 100% RT и цифровой ПЦР эффективность. В этой установки, цифровой ПЦР демонстрирует высокую степень линейности (r2 = 0,99). Предел обнаружения (LoD = 0,12) и предел квантификации (LoQ = 0,23) также представлены в Рисунок 2, показаны, что даже низкий Мирна выражение может быть обнаружен успешно. Таким образом dPCR может использоваться для количественного определения даже низкие сыворотке циркулирующих адаптивной. Предел обнаружения (LoD) и предел квантификации (LoQ) вычисляются после подход Forootan и др. 15 и являются определяется как LoD = LoB + 1.645 x σнизкойконцентрацияобразца, где предел пустой (LoB) рассчитывается как LoB = среднийпустой + 1.645 x σпустым. Количественный предел, то сметные запуск репликации стандартных кривых15. Чтобы обеспечить воспроизводимость количественная оценка адаптивной, только Мирна концентрации, которые лежат выше Лод и LoQ рассматриваются как допустимое точное значение.
Рисунок 3 показывает представитель результаты мир-499 уровней больных с ST-высоте инфаркта миокарда (STEMI), n = 16 в каждый момент времени. Образцы были взяты перед чрескожной интервенции (PCI) (t = 0), 8 ч после PCI (t = 8) и 16 h после PCI (t = 16), и мир-499 уровни были по сравнению с уровнями мир-499 больных с стабилизированное заболевание коронарной артерии (CAD, n = 20). Основные характеристики пациента можно найти в таблице 6. После первоначального выпуска мир-499 в сыворотке крови в первые 8 ч после инфаркта миокарда мир-499 уровень уменьшается снова после 16 ч. Тенденция к увеличению уже можно увидеть в начале СТЕМИ (t = 0), и значительное увеличение уровня мир-499, по сравнению с пациентами с CAD может быть видели 8 ч после СТЕМИ (t = 8, p < 0.01) при сравнении уровней мир-499 Мир-499 уровней стабильных пациентов, CAD. Приемник работает кривых (ROC) показывают возможной полезности мир-499 как Роман биомаркеров для различения с CAD и пациентам с СТЕМИ [площадь под кривой (AUC)) = 0,62 для образцов, взятых перед чрескожной интервенции (PCI), AUC = 0,75 для образцов, взятых 8 ч после PCI, а AUC = 0,78 для образцов, взятых после PCI, по сравнению с уровнями сыворотки мир-499 в больных с CAD 16 h].
Рисунок 1: выбор положительных капель в разведении серии выполнены в дубликаты. (A) порог устанавливается вручную выше негативные капельки. (B) результаты визуализируются в 2D пятно, срабатываний, отобранных кружили. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: синтетический мир-499 олигонуклеотида разрежения серии. (A) измерения были проведены в двух экземплярах. Представлены данные журнала, преобразованную как абсолютное копий на мкл. линейной регрессии и добра fit (2r-значение) отображаются. Данные представлены как среднее ± SEM. (B) Эта группа показывает предел обнаружения (LoD) и предел квантификации (LoQ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Количественная оценка циркулирующих мир-499-5 p сыворотки крови у больных с ST-высоте инфаркта миокарда (n = 16) до чрескожного коронарного вмешательства (PCI), 8 h после PCI и 16 h после PCI, по сравнению с пациентами с стабильной коронарной артерии болезнь (n = 20). (A) циркулирующих сыворотки мир-499-5 p представлена как средство с Среднеквадратичная ошибка среднего с соответствующим p-значение рассчитывается путем односторонней ANOVA следуют тест post hoc Бонферрони (p < считался 0,05 статистически значимые). (B) приемник операционной характеристика (ROC) анализ выполняется на данных из группы А. ROC-анализ демонстрирует чувствительность и специфичность биомаркеров. Кроме того показываются соответствующие площадь под кривой (AUC) значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| количество образцов | ||||
| n = 1 | / Ну [мкл] | |||
| Нуклеаза свободной воды | 4.16 | |||
| 10 x буфер вспять транскрипции | 1.5 | |||
| 100нм dNTP | 0,15 | |||
| АБС битор РНКазы | 0.19 | |||
| конкретные RT грунт | 3 | |||
| Коммерческие Обратной транскриптазы фермента 50 U/ul | 1 | |||
| Всего Мастер-микс | 10 | |||
Таблица 1: Обратная транскрипция реагентов микс.
| Температура | Время |
| 16 ° C | 30 минут |
| 42 ° C | 30 минут |
| 85 ° C | 5 мин. |
| 4 ° C | ∞ |
Таблица 2: Тепловой Велоспорт условия для обратной транскрипции.
| количество образцов | ||||
| n = 1 | / Ну [мкл] | |||
| Нуклеаза свободной воды | 7.67 | |||
| коммерческие dPCR микс | 10 | |||
| 20 x конкретных гидролиза праймер/зонд | 1 | |||
| Всего Мастер-микс | 18.67 | |||
Таблица 3: Цифровой ПЦР реагент микс.
| Температура | Время |
| 95 ° C | 10 мин. |
| 94 ° C | 30 секунд (x40) |
| 60 ° C | 1 мин |
| 98 ° C | 10 мин. |
| 4 ° C | ∞ |
Таблица 4: Тепловые условия Велоспорт для цифровой PCR.
| Трубка | Переданы синтетических олигонуклеотида мир-499 (мкл) | Растворителя (мкл) | микроРНК (копий/мкл) | Ожидаемые копий/мкл в РТ | Ожидаемые копий/мкл в dPCR |
| Исходный текст | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18,7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150.4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37,6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Таблица 5: Синтетические разрежения серии для мир-499.
| Характеристика | Все | Стабильная CAD пациентов (n = 20) | СТЕМИ пациентов (n = 24) | p значение |
| Возраст | 64,7 ± 11,9 | 66.7 ± 13.1 | 62,2 ± 9,9 | 0.2810 |
| Мужчины | 77,8% | 65% | 93,8% | 0.0392 |
| DM | 33,3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| ГТН | 61.1% | 60% | 62,5% | 0.8785 |
| Дислипидемия | 38,9% | 65% | 6,3% | 0,0003 |
| Курильщик | 47,2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| История семьи | 25% | 35% | 12,5% | 0.1213 |
| Избыточный вес | 58,3% | 55% | 62,5% | 0.6501 |
| Креатинин сыворотки (мг/дл) | 0,94 (0,83 - 1) | 0,98 (0,82 - 1.01) | 0.93 (0,83 - 1) | 0,7255 |
| CK пик (U / I) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0.0004 |
| cTnT пик (нг/Л) | 322.5 (23,8-4533) | 18 (7-25,3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| ЗНА % | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| Значения представлены как означает ± SD; Медианные значения (25 до 75-й процентиль диапазона) или % | ||||
| DM: сахарный диабет | ||||
| ГТН: гипертензия | ||||
| CK: Креатинкиназа | ||||
| cTnT: сердечная тропонина T | ||||
| ФИЛЖ: Фракция выброса левого желудочка | ||||
Таблица 6: Основные характеристики пациента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цифровая ПЦР является относительно новой конечной точки методом ПЦР, что позволяет прямой абсолютной количественной нуклеиновых кислот в рамках выборки. Метод обладает особыми преимуществами, включая снижение изменчивости, увеличение повседневной воспроизводимость и превосходная чувствительность11,12. Кроме того, из-за разделения образца на приблизительно 20 000 одной реакции и анализа конечной точки, dPCR более устойчивы к мешая веществ в PCR, по сравнению с количественной ПЦР-16. Эти качества в dPCR делают его привлекательной альтернативой количественного RT-PCR как диагностический инструмент для количественной оценки. Как циркулирующих интерферирующим часто присутствуют на низких в сыворотке, пока ученые были оспорены надлежащим образом определить интерферирующим ПЦР9. С другой стороны dPCR надлежащим образом можно подсчитать даже низкий Мирна выражение в сыворотке, смягчение проблем наблюдается пониженное количество Мирна количественной оценки17. DPCR возможность непосредственно дать графов/мкл, даже в очень низкой Мирна выражении, таким образом делает его привлекательным диагностический инструмент для сердечно-исследовательского сообщества в исследованиях биомаркер Мирна. Как концентрации уступаны графов/мкл можно умножить на коэффициент разбавления, используемых в добыче и RT-реакции, dPCR, это можно достичь точное количество копий в 1 мкл сыворотки. Представленные здесь рабочего процесса могут выполняться в до 96 образцов на тарелку, таким образом обеспечивая инструмент для крупных сердечно-сосудистых исследований. Хотя dPCR exhibits несколько преимуществ над количественного RT-PCR, не еще применяется обычно для количественной оценки интерферирующим в сердечно-сосудистых исследований. Кроме того, стандартизированных данных нормализации процедуры отсутствуют.
В этом подходе мы демонстрируем, что dPCR, в сочетании с флуоресцентные гидролиза зонды, позволяет конкретных прямых абсолютной количественная оценка циркулирующих интерферирующим связан с сердечно-сосудистых заболеваний. С этим докладом мы стремились продемонстрировать оптимизированный протокол для обнаружения Мирна через dPCR и подтвердить преимущества dPCR перед количественного RT-PCR.
Мы подтвердили хорошей линейностью dPCR экспонатов и низкие пределы обнаружения и количественного определения dPCR для количественной оценки адаптивной. По шипование образца с синтетическим олигонуклеотида, нормализации образца можно, регулируя для эффективности извлечения и изменения в образец.
В заключение цифровой ПЦР, как оно exhibits превосходство в технической квалификации и диагностический потенциал, является лучшим текущий метод количественной оценки Мирна и далее могут быть использованы для больших Multi-центр сердечно-сосудистой Мирна биомаркер исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы имеют без подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
