Summary
순환 microRNAs는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색에 대 한 생체로 약속을 보여주었다. 이 연구에서 우리는 미르 추출, 반전 녹음 방송 및 심혈 관 질환 환자의 혈 청에서 miRNAs의 절대 정량화에 대 한 디지털 PCR 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
순환 혈 청 microRNAs (miRNAs) 순환으로 심장 혈관 세포에서 출시 되는 심혈 관 질환 및 급성 심근 경색 (AMI), 대 한 생체로 약속을 보여왔다. 순환 miRNAs 매우 안정 하 고 측정할 수 있습니다. 특정 한 miRNAs의 양적 표현 병 리, 그리고 일부 miRNAs 쇼 높은 조직 및 질병 특이성에 연결할 수 있습니다. 심혈 관 질환에 대 한 새로운 바이오 마커를 찾는 의료 연구에 대 한 중요성 이다. 아주 최근에, 디지털 연쇄 반응 (dPCR) 발명 되었습니다. dPCR, 형광 가수분해 프로브와 함께 특정 직접 절대 정량화를 수 있습니다. dPCR 낮은 다양성, 높은 선형성 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 비해 높은 감도 포함 하 여 우수한 기술적 특성을 전시 한다. 따라서, dPCR miRNAs, 특히 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서 사용에 대 한 직접 측정 하는 더 정확 하 고 재현 가능한 방법 이다. 이 책에서 우리는 효과적으로 혈 청 샘플에 절대 복사 번호 평가 디지털 PCR을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
순환 miRNAs 질병, 심혈 관 질환1등의 숫자에 대 한 유망 표식으로 확인 되었습니다. miRNAs는 작은, 비 코딩 단일 가닥 RNA 분자 (약 22 뉴클레오티드 긴) 관련은 post-transcriptional 레 귤 레이 션 을 통해 메신저 RNA 번역 및 영향을 미치는 유전자 식2, 변경에 생리 적 및 병 적인 상태에 순환으로 해제 됩니다. 특정 miRNAs의 양적 표현, 병 리에 연결 될 수 있습니다 그리고 일부 miRNAs 보여 높은 조직과 질병 특이성1. 심혈 관 질환, miRNAs 되고있다 매력적인 후보자로 소설 생체 PCR 방법론3의 도움으로 측정할 수 있기 때문에 그들은 혈 청에 있는 현저 하 게 안정 하 고 쉽게 할 수 있다. 작은 연구에서 심근 경색에 대 한 생체로 miRNAs의 잠재적인 가치를 평가 하지만 큰 동료에서 유효성 검사2부족 이다. 예를 들어 미르-499 이다 높은 심근 근육 표현 발견 하 고 아미4,,56에 크게 증가를 보였다. 그것은 또한, 조절 프로그램 된 세포 죽음 (apoptosis)와 cardiomyocytes의 차별화 및 따라서 AMI7다음 몇 가지 메커니즘에 관련 된. 우월과 아미의 진단에 대 한 miRNAs의 증분 값을 보고 몇 가지 작은 연구를 제외 하 고 우월 또는 높은 감도 심장 troponins 평등 입증 되지 않은 아직 대규모 연구2,5 ,,68. 큰 동료에서 더 많은 예비 연구는, 따라서, miRNAs의 잠재적인 진단 가치를 평가할 필요 합니다. 또한, miRNA 정량화의 방법을 최적화 하 고9프로토콜 표준화를 사용 하 여 비교. 표준화 된 분석 실험 일관성 없는 결과 줄일 수 있습니다 하 고 일상적인 임상 응용 프로그램에 대 한 잠재적인 생체 되 miRNAs biomarkers 그들의 임상 적용 되도록 재현 방법으로 양이 정해질 필요가 도움이 될 수 있습니다.
최근, dPCR 끝점 분석으로 도입 되었습니다. 그것은 약 20000 개별 반응10샘플 파티션을. DPCR 시스템은 다음 수학 포아송 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응)의 표준 곡선10없이 절대 정량화를 사용를 사용 합니다. 때 dPCR를 결합 하 여 형광 가수분해 프로브, miRNAs의 매우 구체적인 직접 절대 정량화 가능한 이루어집니다. 디지털 연쇄 반응으로 나타났습니다 미르 수준 측정에 대 한 (를 포함 하 여 감소 변화, 증가 일상적인 재현성, 선형성의 고차 및 높은 감도) 우량한 기술적인 질을 전시 하는 순환 양적 실시간 PCR10,11에 비해. 이러한 우수한 기술적 특성 생체로 순환 miRNAs를 사용 하 여 현재 한계를 완화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 및 biomarkers 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상에서과에서 진단 방법으로 miRNAs의 설립으로 이어질 수 있습니다. 일반. 이전 연구에서 우리는 최근 miRNAs는 AMI 환자의 순환의 절대 정량화에 대 한 dPCR를 적용 하 고 정량12miRNAs의 정량화에 비해 우수한 진단 가능성을 입증 할 수 있었다.
이 출판물에는 dPCR를 사용 하 여 직접 심장 혈관 miRNAs 순환 측정에 대 한 정확 하 고 재현 방법 설명 하겠습니다. 혈 청, 디지털 PCR를 사용 하 여 미르 수준 절대 정량화 대형 멀티 센터 심장 혈관 임상 시험에 사용에 대 한 잠재적인 보여줍니다. 이 책에서 우리가 자세히 설명 효과적으로 디지털 PCR을 수행 하는 방법 및 혈 청에 절대 미르 복사본 수를 검출 하는 방법.
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Protocol
1. 혈장/혈 청에서 miRNA의 추출
참고: 계량 miRNAs 적절 하 게, 위하여 혈장/혈 청 으로부터 분리 하 여 정확한 예측에 관한 중요 한 단계입니다. 명심할 것, 특히 때문에 다른 프로토콜, 중요 한 건 샘플을 처리 하는 동안 동일한 워크플로를 준수 하는 것입니다. 이 프로토콜에서 miRNA는 혈 청의 50 µ L에서 추출 됩니다. 이 제한은 올바른 추출 과정으로 200 µ L를 사용 하지 마십시오.
- 혈 청을 준비 하거나 냉동된 샘플을 동결 해제 합니다.
- 혈 청의 50 µ L를 250 µ L (5 권) 상업 세포 시 약을 추가 합니다. Vortexing 여는 세포를 지원 합니다. 5 분 동안 실 온에서 벤치에는 lysate와 튜브를 놓습니다.
- 스파이크에 컨트롤 (107 복사본 / µ L x 1.6)의 3.5 µ L로 lysate 스파이크와 vortexing에 의해 그들을 섞는다.
- 단계 구분에 대 한 클로 프롬 (즉, 시작 혈 청 샘플으로 동일한 금액)의 50 µ L를 추가 합니다. 15 미 위 2-3 분 동안 실 온에서 벤치에 튜브 튜브를 적극적으로 악수.
- 단계 구분에 대 일 분 동안 4 ° C에서 12000 x g에서 튜브 원심.
참고: 샘플 이제 RNA, 흰색 interphase, 그리고 낮은, 핑크 유기 단계를 포함 하는 위 수성 단계로 구분 됩니다. - 위 수성 단계 (100 µ L) RNA를 포함 하는 새로운 관으로 이동. 이 올바른 RNA 수 위조로 흰색 interphase 자료를 전송 하지 않습니다.
- µ 150 L (즉, 전송된 샘플의 볼륨 x 1.5) 100% 에탄올을 추가 합니다. 그들을 아래로 pipetting으로 재료를 믹스. 그들, 원심 고 신속 하 게 다음 단계로 이동 하지.
- 2 mL 컬렉션 튜브에서 상업 회전 열에 샘플의 250 µ L 플라스틱 뚜껑을 닫습니다. 원심에서 열 > 흐름 통해 15 미 삭제에 대 한 실 온에서 8000 x g.
- 스핀 열에 상업적인 세척 버퍼 번호 1의 700 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고 원심에서 열 > 8000 x g 15 미 삭제 실행을 통해 세척 버퍼에 대 한 실내 온도에.
- 스핀 열에 상업적인 세척 버퍼 번호 2의 500 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 닫고 원심에서 열 > 8, 000 15 미 삭제 실행을 통해 세척 버퍼에 대 한 실 온에서 g x.
- 스핀 열 80% 에탄올 500 µ L 플라스틱 뚜껑을 닫고, 원심에서 열 > 8, 000 x g 2 분에 대 한 실 온에서 흐름 통해와 수집 튜브 삭제.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브를 회전 열을 전송 합니다. 열 건조는 막 열린된 뚜껑 최고 속도로 원심 플로우 스루와 수집 튜브를 삭제 합니다.
- 새로운 1.5 mL 컬렉션 튜브로 스핀 열을 전송 합니다. 막의 센터에 직접 RNase 무료 물 30 µ L을 적용 하 여 RNA을 elute. 뚜껑을 닫습니다. 1 분에 대 한 최고 속도로 열 원심
- -70 ° c.에 RNA를 저장
참고: RNase 무료 물-70 ° C ~-20 ° C 사이에서 순화 된 RNA의 저장 하면 1 년에 대 한 RNA의 저하 없이. 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNase 무료 물 희석 RNA의 최소 금액은입니다 10 µ L. 10 µ L 수 있습니다 충분히 수 화 막 그리고 총 RNA 수확량 감소를 사용 하 여.
2. 반전 녹음 방송
참고: 보완 DNA (cDNA) 다음 15 µ L 반전 녹음 방송 (RT) 프로토콜 (총 반응 볼륨)를 사용 하 여 합성 되었다.
- RT 키트 얼음에 녹여 냉장고 만큼 저하에서 그들을 방지 하 고 사용 하기 전에 그들을 아래로 회전 수에 효소를 유지. 얼음에 RT 뇌관을 해 동 하 고 사용 하기 전에 그들을 아래로 회전.
- 표 1에 설명 된 대로 마스터 믹스를 준비 합니다.
- 믹스 마스터의 10 µ L 당 96 잘 접시에 잘 추출 된 RNA의 5 µ L을 결합.
- 2 분 동안 4 ° C에서 2000 x g에 잘 접시 원심
- 반전 녹음 방송에 대 한 표 2 에 설명 된 열 주기 프로토콜을 사용 합니다.
참고: 아래 설명 된 대로 cDNA 직접 처리 될 수 있습니다 디지털 PCR 기계에 ( 재료의 표참조). 또는, 그것은-20 ° c.에 저장 될 수 있습니다.
3. 물방울 생성 및 디지털 PCR
참고: 디지털 PCR 다음 40 µ L 프로토콜을 사용 하 여 수행 되었다.
- 해 동 상업 dPCR 믹스, 준비 된 cDNA 및 얼음에 PCR 뇌관. 사용 하기 전에 잠시 그들을 원심.
- 에 설명 된 대로 마스터 믹스를 준비 표 3.
- RT 제품의 1.33 μ/잘 추가 하 고 간단히 원심.
- 8 잘 카세트 (중간 행)의 각 음에 샘플의 20 μ를 플라스틱.
참고: 8 잘 카세트 완전 하 게 채워지지 경우 채울 cDNA (즉, 추출 된 RNA 대신 물으로 생산 하는 실시간 제품)을 생략 하는 템플릿이 아닌 컨트롤 (NTCs)와 나머지 우물 또는 dPCR 상업 버퍼. NTC는 오염 제어 역할을 합니다. 물 그 방울 형성의 품질에 악영향을 줄 것입니다 때문에 나머지 우물에서 사용할 수 없습니다. - 8 잘 카세트의 유 정 (아래쪽 행)으로 프로브에 대 한 작은 물방울 생성 기름의 70 μ를 플라스틱.
- 8 잘 카세트 위에 가스 켓을 놓고 방울 생성기에서 카세트를 배치 합니다. 드롭릿 생성기를 닫습니다. 3 표시등은 녹색으로 고정 될 때까지 기다립니다.
참고: 방울 지금 생성 되고있다. - 신중 하 고 천천히 pipetting으로 96 잘 접시의 별도 우물으로 물방울 형성 샘플 (맨 윗줄)의 40 μ를 전송.
- 샘플에 작은 물방울 대형을 완료 한 후 인감 4 180 ° C에서 pierceable dPCR 호 PCR 플레이트 s.
- 호 봉인 PCR-접시는 cycler 놓고 2.5의 경사로 속도로 표 4 에 설명 된 대로 주기 ° C/s.
4. 물방울 읽기 및 분석
- 플레이트 홀더 베이스에 열 cycler에서 접시를 전송. 상단의 PCR 플레이트에 플레이트 홀더를 배치 하 여 PCR 접시를 조입니다.
- 상업적인 dPCR 소프트웨어를 시작 합니다.
- 설정에서 샘플 이름, 실험, 그리고 대상의 이름을 입력 합니다. 절대 정량화를 선택 합니다.
- 실행을 클릭 하 여 읽기 방울을 시작 합니다. 가수분해 프로브를 작업할 때 탐지 화학으로 팸/HEX 또는 팸/빅 을 선택 합니다.
참고: 상업 dPCR 소프트웨어 다음 자동-분석 데이터. - 올바른 물방울 생성 되도록 결과 테이블에 물방울 번호를 확인 하십시오.
- 같은 정량된 miRNA와 모든 우물을 선택 하 고 분석을 클릭 합니다. 2D 오를 사용 하 여 긍정적인 물방울 표시 하 고 수동으로 수정 자동 분석 데이터 (그림 1).
5. 올바른 샘플 계산
- 샘플 샘플 정규화 인자 (NF)를 곱하여 정규화.
NF = 중간 [C. 선 충 미르-39 측정]모든 샘플/ [선 충 C. 미르-39]주어진된 샘플 - 마지막 미르 혈 청 농도, 희석 요인 (DF)에 대 한 조정 계산 합니다.
[미르] 마지막 = [미르]원시 값 DFRT DFdPCR DFEx x x x
장소:
[미르] 원시 값 = 상업 dPCR 소프트웨어에 의해 계량 미르
DFRT 반전 녹음 방송;에 서식 파일의 희석 비율 =
DFdPCR = dPCR;에 서식 파일의 희석 비율
Ex DF = 희석 요인 추출에서.
6. 합성 Oligonucleotide 희석 시리즈
- 동결 건조 된 합성 oligonucleotide 얼음에 녹여 짧게 원심 그것.
- 동결 건조 된 합성 oligonucleotide nuclease 무료 물 10 pmol의 최종 농도에 희석 / µ L. 간단히 원심 그것.
- 표 5에 설명 된 대로 nuclease 무료 물에 희석. 8000 x g 10에 각 희석 단계 사이 짧게 희석 원심 s.
- 2 단계에서 설명한 대로 반전 녹음 방송으로 계속 하 고 3 단계와 4 단계에서 설명한 대로 디지털 PCR와 샘플을 분석.
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Representative Results
디지털 PCR 형광 가수분해 프로브와 함께 연구를를 직접 복사본 / µ L에서 특정 miRNAs의 절대 금액을 정할 수 있습니다. DPCR에서 샘플 dPCR 기술 하지 않아도 약 20000 개별 PCR 반응에서 분할로10을 복제 합니다. DPCR 시스템 활용 통계 분석 형광 신호 (긍정적이 고 부정적인 반응 사이 다른)의 푸아송의 수학 곡선10의 표준에 대 한 필요 없이 절대 정량화를 사용. 허용 물방울 수 농도 제대로 계산 하기 위해 필요 (> 15000). 아니 템플릿 컨트롤 상당한 일반적인 증폭의 제외를 확인합니다. 분석에 포함 된 모든 샘플 같은 볼륨, 방법, 및 PCR 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 유효성을 강화 하기 위해 처리 됩니다. DPCR에서 얻은 농도 아군에 합성으로 분석 하는 모든 샘플에서 중간 정상화 절차를 사용 하 여 정규화는 선 충 C. 미르-3913. 아군에서 선 충 C. 측정 된 양의 데이터 정규화 미르-39 RNA 추출 효율에서 샘플 샘플 변형에 대 한 수정 및 추가 결과의 타당성에 추가 PCR 반응 제어 역할. 혈 청 miRNAs; 정상화 위한 설립된 골드 표준입니다. 그러나, 아군에 같은 exogenous 컨트롤 선 충 C. 미르-39는 정규화 절차에 대 한 우아한 솔루션으로 다양 한 질병 상태9에서 자주 변경 되는 내 생 miRNAs.
분석 된 혈 청 샘플 급성 ST 세그먼트 고 각 심근 경색 (STEMI) 환자에서 PCI 후는 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI), 8 h는 PCI 후 전과 16 h를 인수 했다. STEMI 환자는 심각한 허 혈을 전시 하 고 따라서 새로운 허 혈 biomarkers의 평가 대 한 자격. 미르-499 출시의 활동 및 심혈 관 질환에서 허 혈에 대 한 한 biomarker로 미르-499의 잠재적인 사용을 평가, 하 미르-499 3 다른 시간 포인트14에 대 한 모든 환자에서 dPCR와 함께 분석 했다.
그림 1 에 소프트웨어에 의해 계산 된 최종 미르 농도 주는 긍정적인 방울의 선택 방법을 보여 줍니다. 샘플에서 되었다면 분수 상업 dPCR 소프트웨어에 의해 계산한 복사본 / µ L의 농도를 결정합니다. 결과 또한 2D 플롯에 구상 될 수 있다 고 긍정적 서클으로 수동으로 표시할 수 있습니다. 농도 NTCs의 일반적인 증폭 위의 경우에 간주 됩니다.
그림 2 는 중복에 선형성 및 합성 미르 oligonucleotide 있다-미르-499-5 p 희석 시리즈의 적합의 세상을 보여준다. 8 단계 희석 시리즈 0 복사본 / µ L를 2500 복사본 / µ L에서 수행 되었다. 표 5 에 설명 된 대로 계산 된 예상된 복사본 / µ L 가정 100% 실시간 및 디지털 PCR 효율. 이 설치 프로그램에서 디지털 PCR 선형성의 높은 학위를 보여줍니다 (r2 = 0.99). 탐지의 한계 (LoD 0.12 =) 및 정량화의 한계 (LoQ = 0.23) 그림 2도 낮은 미르 식을 성공적으로 검출 될 수 있다 표시도 제공 됩니다. 따라서, dPCR는 miRNAs 순환의 더 낮은 혈 청 수준 척도를 사용할 수 있습니다. Forootan 그 외 여러분 의 접근에 따라 탐지 (LoD)의 제한 및 정량화 (LoQ)도 계산 LoD로 15 및가 정의 = LoB + 1.645 x σ낮은농도샘플, 공백 (LoB)의 제한으로 LoB 계산 됩니다 의미빈 + 1.645 x σ빈=. LoQ는 예상된 실행 복제 표준 곡선15이다. MiRNAs의 재현 정량화를 위해 LoD와는 LoQ 위에 있는 miRNA 농도만 유효한 정확한 값으로 간주 됩니다.
그림 3 은 환자는 ST 상승 심근 경색 (STEMI), n 의 미르-499 레벨의 대표적인 결과 = 각 시간 지점에서 16. 경 피 적인 내정간섭 (PCI) 전에 찍은 사진 샘플 (t = 0), PCI 후 8 h (t = 8), 그리고 PCI 후 16 h (t = 16), 미르-499 레벨 안정 되어 있는 관상 동맥 질환 (CAD, n 환자의 미르-499 수준에 비교 했다 = 20). 표 6에 주요 환자 특성을 찾을 수 있습니다. 심근 경색을 다음과 같은 첫 번째 8 h 혈 청으로 미르-499의 초기 릴리스, 이후 미르-499 레벨 16 h 후 다시 감소. 증가 추세는 STEMI의 시작 부분에 이미 보일 수 있다 (t = 0), 미르-499 수준의 cad 환자에 비해 크게 증가 STEMI 후 볼된 8 h 수 (t = 8, p < 0.01) 미르-499 레벨을 비교 하는 경우 미르-499 안정 CAD 환자 수준입니다. 수신기를 운영 곡선 (ROC) 표시 cad 환자 및 환자는 STEMI 구별할 새로운 biomarker로 미르-499의 가능한 유틸리티 [곡선 (AUC) 아래 지역 0.62 경 피 적인 내정간섭 (PCI), AUC 전에 샘플에 대 한 = = 샘플 후 PCI, 및 AUC 8 h 0.75 = 0.78 샘플 cad 미르-499 환자에서의 혈 청 수준에 비해 PCI 후 16 h에 대 한].
그림 1: 긍정적인 방울 희석 시리즈에서의 선택에서 중복 수행. (A) 임계값 설정 수동으로 부정적인 방울 위에. (B) 결과 2D 오, 돌고 선정 긍정적 시각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 합성 미르-499 oligonucleotide 희석 시리즈. (A) 측정 중복에서 수행 했다. 데이터 로그 µ L. 선형 회귀 및 맞춤 선 절대 복사본으로 변형 되 게 됩니다 (r2-값) 표시 됩니다. 데이터에는 평균 ± SEM. (B)이이 패널 표시 검출 (LoD)의 제한 및 정량화 (LoQ) 제한 되 게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 순환 ST 상승 심근 경색 환자에서 혈 청 미르-499-5 p의 정량화 (n = 16) 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI), PCI, 후 8 h 16 h PCI 후 전에 비해 환자에 게 안정 되어 있는 관상 동맥 질병 (n = 20). (A)는 순환 혈 청 미르-499-5 p p해당 의미의 표준 오차와 의미로 표현 됩니다-일방통행 ANOVA 계산 값 다음 Bonferroni 게시물 임시 테스트 (p < 0.05로 간주 되었다 통계적으로 뜻깊은). (B) A 수신기 작동 특성 곡선 (ROC) 분석 패널 A에서 데이터에 대해 수행 됩니다. ROC 분석 감도 및 특이성은 biomarker의 보여 줍니다. 또한, 곡선 (AUC) 값에 따라 해당 영역에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 샘플 크기 | ||||
| n = 1 | / [μ] 잘 | |||
| nuclease 무료 물 | 4.16 | |||
| 반전 녹음 방송 버퍼 x 10 | 1.5 | |||
| 100nM dNTP | 0.15 | |||
| RNAse 억제제 | 0.19 | |||
| 특정 RT 뇌관 | 3 | |||
| 상업 역전사 효소 50 U/ul | 1 | |||
| 믹스 마스터 총 | 10 | |||
표 1: 역방향 전송 시 약 혼합입니다.
| 온도 | 시간 |
| 16 ° C | 30 분 |
| 42 ° C | 30 분 |
| 85 ° C | 5 분 |
| 4 ° C | ∞ |
표 2: 반전 녹음 방송에 대 한 열 순환 조건.
| 샘플 크기 | ||||
| n = 1 | / [μ] 잘 | |||
| nuclease 무료 물 | 7.67 | |||
| 상업적인 dPCR 믹스 | 10 | |||
| 특정 가수분해 뇌관/프로브 x 20 | 1 | |||
| 믹스 마스터 총 | 18.67 | |||
표 3: 디지털 PCR 시 약 혼합입니다.
| 온도 | 시간 |
| 95 ° C | 10 분 |
| 94 ° C | 30 초 (x40) |
| 60 ° C | 1 분 |
| 98 ° C | 10 분 |
| 4 ° C | ∞ |
표 4: 열 순환 조건 디지털 PCR 위한.
| 튜브 | 합성 oligonucleotide 미르-499 (µ L) 전송 | 희석제 (µ L) | 미르 (복사본 / µ L) | RT에 예상된 복사본 / µ l | DPCR에서 예상된 복사본 / µ l |
| 원문 언어 | 6.022 × 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18.7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150.4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37.6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
표 5: 합성 희석 시리즈 미르-499.
| 특성 | 모든 | 안정 CAD 환자 (n = 20) | STEMI 환자 (n = 24) | p-값 |
| 나이 | 64.7 ± 11.9 | 66.7 ± 13.1 | 62.2 ± 9.9 | 0.2810 |
| 남성 | 77.8% | 65% | 93.8% | 0.0392 |
| DM | 33.3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61.1% | 60% | 62.5% | 0.8785 |
| Dyslipidemia | 38.9% | 65% | 6.3% | 0.0003 |
| 흡연 자 | 47.2% | 55% | 37.5% | 0.3796 |
| 가족 역사 | 25% | 35% | 12.5% | 0.1213 |
| 과 체중 | 58.3% | 55% | 62.5% | 0.6501 |
| 혈 청 크 (mg/dL) | 0.94 (0.83-1) | 0.98 (0.82-1.01) | 0.93 (0.83-1) | 0.7255 |
| CK 피크 (U / I) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0.0004 |
| cTnT 피크 (ng/L) | 322.5 (23.8-4533) | 18 (7-25.3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| LVEF % | 45% (40%-50%) | 45% (32.5%-55%) | 45% (45%-50%) | 0.9596 |
| 값 ± SD; 의미 하는 대로 표시 됩니다. 중간 값 (25 75 백분위 수 범위) 또는 % | ||||
| DM: 당뇨병 | ||||
| HTN: 고혈압 | ||||
| CK: 크 레 아 틴 키 니 아 제 | ||||
| cTnT: 심장 분 T | ||||
| LVEF: 좌 심 실 방출 조각 | ||||
표 6: 메인 환자 특성입니다.
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Discussion
디지털 PCR PCR는 샘플 내에서 핵 산의 직접 절대 정량화를 허용 하는 상대적으로 새로운 끝점 방법입니다. 메서드를 사용 하면 감소 변화, 증가 일상적인 재현성 및 우수한 감도11,12를 포함 하 여 특정 장점을 있습니다. 또한, 분할 샘플의 약 20000 단일 반응 및 끝점 분석으로, 때문에 dPCR는에 더 강력한 PCR 양적 RT-PCR16에 비해 간섭 물질. DPCR에서 이러한 자질 정량화에 대 한 진단 도구로 서 양적 RT-PCR에 매력적인 대안 만들. MiRNAs 순환으로 종종 낮은 혈 청 농도 지금까지 과학자 도전을 받고 적절 하 게 PCR9miRNAs 계량입니다. 다른 한편으로, dPCR는 낮은 수 미르 정량화17에서 관찰 하는 문제를 완화 하는 혈 청에도 낮은 미르 식을 계량 적절 하 게 수 있습니다. 직접 카운트 / µ L에 게는 매우 낮은 미르 식에도 dPCR의 능력 따라서 사용 하는 매력적인 진단 도구 미르 바이오 마커 연구에서 심혈 관 연구 커뮤니티 있습니다. 로 건의 / µ L에 주어진 농도 추출, RT-반응, 및 dPCR에서 사용 하는 희석 요인에 의해 곱할 수, 혈 청의 1 µ L에서 정확한 수를 달성 가능 하다. 여기에 제시 된 워크플로 접시에, 큰 심장 혈관 연구를 위한 도구를 제공 따라서 최대 96 샘플에서 수행할 수 있습니다. DPCR 전시 양적 RT-PCR에 몇몇 이점이, 비록 그것은 적용 되지 않습니다 아직 정기적으로 심장 혈관 시험에서 miRNAs의 정량화에 대 한. 또한, 표준화 된 데이터 정규화 절차는 부족 합니다.
이 방법에서는, 형광 가수분해 프로브와 결합 하는 dPCR 순환 심장 혈관 질병에 연결 된 miRNAs의 특정 직접 절대 정량화 수 있습니다 설명 합니다. 이 보고서와 함께 우리 모두 미르 검색을 통해 dPCR에 대 한 최적화 된 프로토콜을 설명 하 고 양적 RT-PCR dPCR의 장점이 확인 목적입니다.
우리는 좋은 선형성 dPCR 전시 및 낮은 검출 한계 및 정량화 miRNAs 측정에 대 한 dPCR의 확인 했다. 급상승 합성 oligonucleotide와 샘플, 샘플의 정규화, 추출 효율 및 샘플 샘플 변형에 대 한 조정 가능 하다.
결론적으로, 디지털 PCR 기술 능력 및 진단 가능성에 우위를 전시 미르 정량화에 대 한 현재 최고의 방법 이며 더 큰 멀티 센터 심장 혈관 미르 바이오 마커 연구에 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 아무 승인 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
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