Summary
परिसंचारी microRNAs हृदय रोगों और तीव्र रोधगलन infarctions के लिए रिमार्क्स के रूप में वादा दिखाया है । इस अध्ययन में, हम miRNA निष्कर्षण, रिवर्स प्रतिलेखन, और हृदय रोग के साथ रोगियों के सीरम में miRNAs के निरपेक्ष ठहराव के लिए डिजिटल पीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
परिसंचारी सीरम microRNAs (miRNAs) हृदय रोग और तीव्र रोधगलन (अमी) के लिए, हृदय कोशिकाओं से संचलन में जारी किया जा रहा है के लिए रिमार्क्स के रूप में वादा दिखाया है । परिचालित miRNAs अत्यधिक स्थिर होते हैं और quantified जा सकते हैं. विशिष्ट miRNAs की मात्रात्मक अभिव्यक्ति विकृति से जोड़ा जा सकता है, और कुछ miRNAs उच्च ऊतक और रोग विशिष्टता दिखाते हैं । हृदय रोगों के लिए उपंयास जैव मार्क्स खोजना चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्व का है । गौरतलब है कि हाल ही में डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (dPCR) का आविष्कार किया गया है । dPCR, फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ संयुक्त, विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है । dPCR मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) की तुलना में एक कम परिवर्तनशीलता, उच्च रैखिकता, और उच्च संवेदनशीलता सहित बेहतर तकनीकी गुणों को दर्शाती है । इस प्रकार, dPCR के लिए एक अधिक सटीक और reproducible विधि है सीधे miRNAs को बढ़ाता है, विशेष रूप से बड़ी बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए । इस प्रकाशन में, हम वर्णन कैसे प्रभावी ढंग से डिजिटल पीसीआर प्रदर्शन के लिए सीरम नमूनों में निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का आकलन करने के लिए ।
Introduction
परिसंचारी miRNAs हृदय रोग1सहित रोगों की एक संख्या के लिए होनहार मार्कर के रूप में पहचान की गई है । miRNAs छोटे हैं, गैर कोडिंग एकल-असहाय आरएनए अणु (लगभग 22 न्यूक्लियोटाइड लांग) दूत आरएनए अनुवाद के परिवर्तन के माध्यम से पोस्ट transcriptional विनियमन में शामिल है और जीन अभिव्यक्ति2को प्रभावित कर रहे हैं, और दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में संचलन में जारी कर रहे हैं । विशिष्ट miRNAs की मात्रात्मक अभिव्यक्ति विकृति से जोड़ा जा सकता है, और कुछ miRNAs उच्च ऊतक और रोग विशिष्टता1दिखाते हैं । हृदय रोगों में miRNAs उपन्यास के रूप में आकर्षक उम्मीदवार बन गए हैं क्योंकि वे सीरम में उल्लेखनीय रूप से स्थिर हैं और पीसीआर पद्धति3की मदद से आसानी से quantified जा सकता है. रोधगलन के लिए miRNAs के रूप में संभावित मूल्य छोटे अध्ययनों में मूल्यांकन किया गया है, लेकिन बड़े साथियों में मांयता2कमी है । उदाहरण के लिए, मीर-४९९ अत्यधिक रोधगलन में व्यक्त पाया जाता है, और यह काफी एक अमी4,5,6में वृद्धि होने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, यह क्रमादेशित सेल मौत (apoptosis) और cardiomyocytes के भेदभाव को नियंत्रित करता है और इस प्रकार एक अमी7के बाद कई तंत्र में शामिल है । अमी के निदान के लिए miRNAs के एक वरिष्ठता और वृद्धिशील मूल्य रिपोर्टिंग कुछ छोटे अध्ययनों के अलावा, उच्च संवेदनशीलता कार्डियक troponins के लिए श्रेष्ठता या समानता अभी तक बड़े पैमाने पर अध्ययन में सिद्ध नहीं किया गया है2,5 ,6,8. बड़े साथियों में अधिक संभावित अध्ययन कर रहे हैं, इसलिए, miRNAs के संभावित नैदानिक मूल्य का आकलन करने की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, miRNA ठहराव के तरीकों को अनुकूलित और तुलनीय प्रोटोकॉल9का उपयोग मानकीकृत की जरूरत है । मानकीकृत परख असंगत परिणाम कम हो सकता है और miRNAs नियमित नैदानिक आवेदन के लिए संभावित उपमार्क्स बनने के लिए मदद कर सकते हैं, के रूप में एक reproducible तरीके से अपने नैदानिक प्रयोज्यता सुनिश्चित करने के लिए quantified की जरूरत है ।
हाल ही में, dPCR एक अंत सूत्री विश्लेषण के रूप में पेश किया गया है । यह लगभग २०,००० व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं में नमूना विभाजन10। dPCR प्रणाली तो फ्लोरोसेंट संकेतों की एक गणितीय Poisson सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करता है (सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रियाओं), एक मानक वक्र के बिना एक निरपेक्ष ठहराव को सक्षम करने10. जब फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ dPCR संयोजन, miRNAs के अत्यधिक विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव संभव बनाया है । डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया बेहतर तकनीकी गुणों का प्रदर्शन दिखाया गया है (एक कम परिवर्तनशीलता, एक वृद्धि हुई दिन-दिन reproducibility, रैखिकता के एक उच्च डिग्री, और एक उच्च संवेदनशीलता सहित) में miRNA के स्तर को बढ़ाता है के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर10,11की तुलना में संचलन । इन बेहतर तकनीकी गुणों के लिए miRNAs के रूप में परिसंचारी प्रयोग पर वर्तमान सीमाओं को कम करने में मदद मिल सकती है और बड़े बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में और एक नैदानिक विधि के रूप में के रूप में miRNAs की स्थापना के लिए नेतृत्व कर सकते है सामान्य. पिछले एक अध्ययन में, हम हाल ही में एक अमी के साथ रोगियों में परिसंचारी miRNAs के निरपेक्ष ठहराव के लिए dPCR लागू किया गया और बेहतर नैदानिक miRNAs के ठहराव की तुलना में क्षमता का प्रदर्शन करने में सक्षम थे12.
इस प्रकाशन में, हम प्रदर्शित करना चाहते है कि dPCR का उपयोग कर सीधे प्रसारित हृदय miRNAs को बढ़ाता है के लिए एक सटीक और reproducible विधि है । सीरम में miRNA स्तर के निरपेक्ष ठहराव, डिजिटल पीसीआर का उपयोग, बड़ी बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए क्षमता से पता चलता है. इस प्रकाशन में, हम विस्तार में वर्णन कैसे प्रभावी ढंग से डिजिटल पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए और सीरम में निरपेक्ष miRNA प्रतिलिपि संख्या का पता लगाने के लिए कैसे ।
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Protocol
1. प्लाज्मा/सीरम से miRNA का निष्कर्षण
नोट: आदेश में उचित रूप से miRNAs यों तो, प्लाज्मा/सीरम से सही microRNA अलगाव एक महत्वपूर्ण कदम है । एक महत्वपूर्ण बात को ध्यान में रखने के लिए, विशेष रूप से, क्योंकि विभिंन प्रोटोकॉल मौजूद है, एक ही कार्यप्रवाह का पालन करना है, जबकि नमूने प्रसंस्करण । इस प्रोटोकॉल में, miRNA सीरम के ५० µ एल से निकाला जाता है । इस सीमा को सही निष्कर्षण प्रक्रिया के रूप में २०० से अधिक µ l का उपयोग न करें ।
- सीरम या गल जमे हुए नमूने तैयार करें ।
- सीरम के ५० µ एल के लिए २५० µ एल (5 खंड) वाणिज्यिक lysis रिएजेंट जोड़ें । lysis को भंवर कर समर्थन करते हैं । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर lysate के साथ ट्यूब प्लेस ।
- स्पाइक के ३.५ µ एल के साथ lysate कील-नियंत्रण में (१.६ x 107 प्रतियां/µ l) और उन्हें भंवर से मिश्रण.
- क्लोरोफॉर्म के ५० µ एल जोड़ें (यानी, प्रारंभिक सीरम नमूने के रूप में एक बराबर राशि) चरण जुदाई के लिए । शेक ट्यूब के लिए जोरदार 15 एस. 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर ट्यूब प्लेस ।
- चरण जुदाई के लिए, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १२,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
नोट: नमूने अब आरएनए, एक सफेद चरण, और एक कम, गुलाबी कार्बनिक चरण युक्त एक ऊपरी जलीय चरण में अलग कर रहे हैं । - एक नई ट्यूब में आरएनए युक्त ऊपरी जलीय चरण (१०० µ l) स्थानांतरण. इस झूठलाया सही आरएनए गिनती के रूप में किसी भी सफेद दौर सामग्री हस्तांतरण नहीं करते ।
- जोड़ें १५० µ एल (यानी, 1.5 x हस्तांतरित नमूने की मात्रा) १००% इथेनॉल की । सामग्री को pipetting करके उन्हें ऊपर और नीचे से मिलाएं । उंहें केंद्रापसारक मत करो, और जल्दी से अगले कदम पर चलते हैं ।
- पिपेट २५० एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में एक वाणिज्यिक स्पिन कॉलम पर नमूने के µ एल । लिड बंद करें । 15 एस के लिए कमरे के तापमान पर > 8, 000 x g पर कॉलम केंद्रापसारक-प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
- वाणिज्यिक वाशिंग बफर नंबर 1 के स्पिन कॉलम में ७०० µ एल जोड़ें । ढक्कन बंद कर दें और स्तंभ को > 8, 000 x g के लिए कमरे के तापमान पर 15 s. रन-थ्रू धुलाई बफ़र छोड़ें ।
- वाणिज्यिक वाशिंग बफर नंबर 2 के स्पिन कॉलम में ५०० µ एल जोड़ें । ढक्कन बंद कर दें और स्तंभ को > 8, 000 x g के लिए कमरे के तापमान पर 15 s. रन-थ्रू धुलाई बफ़र छोड़ें ।
- पिपेट ५०० स्पिन कॉलम को ८०% इथेनॉल के µ एल । ढक्कन बंद करें, 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर > 8, 000 x g पर कॉलम केंद्रापसारक । प्रवाह के माध्यम से संग्रह ट्यूब त्यागें ।
- स्पिन कॉलम को एक नए 2 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें । एक खोला ढक्कन के साथ पूर्ण गति से स्तंभ केंद्रापसारक झिल्ली सूखी । प्रवाह के माध्यम से संग्रह ट्यूब त्यागें ।
- एक नया १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन कॉलम स्थानांतरण । RNase-मुक्त पानी के ३० µ एल को सीधे झिल्ली के केंद्र में लगाने से आरएनए Elute. लिड बंद करें । 1 मिनट के लिए पूर्ण गति से स्तंभ केंद्रापसारक ।
- -७० ° c पर आरएनए की दुकान ।
नोट:-७० ° c से-20 डिग्री सेल्सियस के बीच RNase-मुक्त पानी में शुद्ध आरएनए का भंडारण 1 वर्ष के लिए आरएनए का कोई क्षरण सुनिश्चित करता है । निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद, आरएनए को पतला करने के लिए RNase-मुक्त पानी की न्यूनतम राशि 10 µ l का उपयोग कर 10 से कम µ l को अपर्याप्त रूप से झिल्ली हाइड्रेट और कुल आरएनए उपज को कम कर सकते हैं ।
2. प्रतिलेखन रिवर्स
नोट: पूरक डीएनए (सीडीएनए) निम्नलिखित 15 µ l रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) प्रोटोकॉल (कुल प्रतिक्रिया मात्रा) का उपयोग कर संश्लेषित किया गया था.
- बर्फ पर आरटी किट गल । फ्रीजर में एंजाइमों के रूप में लंबे समय के रूप में उंहें अपमानजनक से रोकने के लिए और उंहें स्पिन नीचे उपयोग करने से पहले रखें । बर्फ पर गल आरटी प्राइमर और उपयोग करने से पहले उन्हें नीचे स्पिन ।
- तालिका 1में वर्णित के रूप में मास्टर मिश्रण तैयार करें ।
- मास्टर मिक्स के 10 µ एल का मिश्रण है और अच्छी तरह से एक ९६ अच्छी तरह से थाली में निकाले आरएनए के 5 µ एल ।
- 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २,००० x g पर अच्छी तरह से थाली केंद्रापसारक ।
- रिवर्स प्रतिलेखन के लिए तालिका 2 में वर्णित थर्मल चक्र प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
नोट: जैसा कि नीचे वर्णित है, सीडीएनए सीधे डिजिटल पीसीआर मशीन में संसाधित किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें); वैकल्पिक रूप से, यह-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
3. छोटी बूंद पीढ़ी और डिजिटल पीसीआर
नोट: डिजिटल पीसीआर निंनलिखित ४० µ एल प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था ।
- इस कमर्शियल dPCR मिक्स, तैयार सीडीएनए, और बर्फ पर पीसीआर प्राइमरों गल । उंहें शीघ्र ही उपयोग करने से पहले केंद्रापसारक ।
- तालिका 3 में वर्णित के रूप में मास्टर मिश्रण तैयार करें ।
- RT उत्पाद के १.३३ μL/अच्छी तरह जोड़ें और इसे संक्षेप में केंद्रापसारक ।
- पिपेट 8-अच्छी तरह से कैसेट (मध्यम पंक्ति) के प्रत्येक कुआं में नमूने के 20 μL ।
नोट: अगर 8 अच्छी तरह से कैसेट पूरी तरह से भरा नहीं है, गैर के साथ शेष कुओं को भरने-टेंपलेट नियंत्रण (NTCs) है कि सीडीएनए छोड़ (यानी, आरटी उत्पाद निकाली आरएनए के बजाय पानी के साथ उत्पादित) या dPCR वाणिज्यिक बफर । एनटीसी एक संदूषण नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । पानी के शेष कुओं में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि कि छोटी बूंद गठन की गुणवत्ता ख़राब हो जाएगा । - पिपेट ७० तेल कुओं में जांच के लिए छोटी बूंद पीढ़ी के तेल की μL (नीचे पंक्ति) के 8-अच्छी तरह से कैसेट ।
- 8 के शीर्ष पर एक गैसकेट प्लेस-अच्छी तरह से कैसेट और छोटी बूंद जनरेटर में कैसेट जगह है । छोटी बूंद जनरेटर बंद करें । 3 संकेतक रोशनी ठोस हरे है जब तक रुको ।
नोट: अब बूंदें उत्पंन की जा रही हैं । - ध्यान से और धीरे से छोटी बूंद के ४० μL हस्तांतरण-pipetting द्वारा एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट के अलग कुओं में नमूना (शीर्ष पंक्ति) का गठन किया ।
- नमूने पर छोटी बूंद गठन को पूरा करने के बाद, 4 एस के लिए १८० डिग्री सेल्सियस पर एक पियर्सन dPCR पंनी के साथ पीसीआर प्लेट सील ।
- पन्नी-सीलबंद पीसीआर-प्लेट को साइकिल चालक में रखें और यह के रूप में तालिका 4 में वर्णित चक्र, २.५ डिग्री सेल्सियस के एक रैंप दर पर/
4. छोटी बूंद पढ़ने और विश्लेषण
- थर्मल साइकिल चालक से प्लेट धारक के आधार पर स्थानांतरण । पीसीआर प्लेट पर प्लेट होल्डर के ऊपर रखकर पीसीआर प्लेट को कस लें ।
- व्यावसायिक dPCR सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें ।
- नमूना नाम, प्रयोग का नाम, और सेटअप में लक्ष्य दर्ज करें । निरपेक्ष ठहराव चयन करें ।
- भागोक्लिक करके छोटी बूंद पढ़ने शुरू करो । FAM/हेक्स या FAM/विक का पता लगाने रसायन विज्ञान के रूप में चुनें जब hydrolysis जांच के साथ काम कर ।
नोट: वाणिज्यिक dPCR सॉफ्टवेयर तो डेटा ऑटो विश्लेषण करेंगे । - एक सही छोटी बूंद पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए परिणाम तालिका में छोटी बूंद संख्या की जाँच करें ।
- एक ही quantified miRNA के साथ सभी कुओं का चयन और विश्लेषणक्लिक करें । सकारात्मक बूंदों को चिह्नित करने और स्वतः विश्लेषित डेटा (चित्रा 1) को ठीक करने के लिए 2d दाग का उपयोग करें ।
5. नमूने पर सही गणना
- नमूना सामांयीकरण फ़ैक्टर (NF) द्वारा गुणा कर नमूना को सामान्य ।
NF = माध्य [c. एलिगेंस मीर-३९ माप]सभी नमूनों/[c. एलिगेंस मीर-३९]नमूना दिया - अंतिम miRNA सीरम एकाग्रता की गणना, कमजोर पड़ने कारकों (DF) के लिए समायोजन ।
[miRNA] अंतिम = [miRNA]raw मान x dfRT x dfdPCR x dfEx
जहां:
[miRNA] कच्चे मूल्य = miRNA वाणिज्यिक dPCR सॉफ्टवेयर द्वारा quantified;
DFRT = रिवर्स प्रतिलेखन में टेंपलेट के कमजोर पड़ने कारक;
DFdPCR = dPCR में टेंपलेट का कमजोर कारक;
DFपूर्व = निष्कर्षण में कमजोर पड़ने कारक ।
6. सिंथेटिक Oligonucleotide कमजोर पड़ने श्रृंखला
- बर्फ पर गल lyophilized सिंथेटिक oligonucleotide । संक्षेप में इसे केंद्रापसारक ।
- nuclease में lyophilized सिंथेटिक oligonucleotide को पतला-मुक्त पानी 10 pmol/µ एल के अंतिम एकाग्रता के लिए संक्षेप में यह केंद्रापसारक ।
- तालिका 5में वर्णित के रूप में nuclease-मुक्त पानी में यह पतला । 10 एस के लिए ८,००० x g पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के कदम के बीच संक्षेप में कमजोर पड़ने केंद्रापसारक ।
- चरण 2 में वर्णित के रूप में रिवर्स प्रतिलेखन के साथ जारी रखने और चरण 3 और चरण 4 में वर्णित के रूप में डिजिटल पीसीआर के साथ नमूनों का विश्लेषण ।
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Representative Results
डिजिटल फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ संयुक्त पीसीआर को सीधे प्रतियां में विशिष्ट miRNAs की निरपेक्ष मात्रा को मात्रा में बढ़ाता है शोधकर्ताओं/µ l dPCR में नमूना लगभग २०,००० व्यक्तिगत पीसीआर प्रतिक्रियाओं में विभाजित है के रूप में, dPCR तकनीकी प्रतिकृति10की आवश्यकता नहीं है । dPCR प्रणाली फ्लोरोसेंट संकेतों के एक गणितीय Poisson सांख्यिकीय विश्लेषण का इस्तेमाल करता है (सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रियाओं के बीच भिंन) एक मानक वक्र10की आवश्यकता के बिना एक निरपेक्ष ठहराव को सक्षम करने के । आदेश में सही ढंग से सांद्रता की गणना करने के लिए, एक स्वीकार्य छोटी बूंद गिनती (> 15, 000) की जरूरत है । कोई टेम्पलेट नियंत्रण काफी विशिष्ट प्रवर्धन का बहिष्करण सुनिश्चित करते हैं. विश्लेषण में शामिल सभी नमूनों को प्राप्त परिणामों की वैधता को सुदृढ़ करने के लिए समान मात्रा, विधि और पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित किया जाता है. dPCR में प्राप्त सांद्रता सभी नमूनों भर में एक औसत सामांयीकरण प्रक्रिया का उपयोग कर सामान्यीकृत कर रहे है सिंथेटिक नुकीला में सी के साथ विश्लेषण किया- एलिगेंस मीर-३९13। spiked-में C. एलिगेंस मीर की मापा राशि के लिए डेटा को सामान्य-३९ आरएनए निष्कर्षण दक्षता में नमूना करने के लिए नमूना भिन्नता के लिए सही है और एक पीसीआर प्रतिक्रिया नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, आगे परिणामों की वैधता को जोड़ने. सीरम miRNAs को सामान्य करने के लिए कोई स्थापित सोने के मानक नहीं है; हालांकि, exogenous नियंत्रण जैसे नुकीला-में C. एलिगेंस मीर-३९ सामांय प्रक्रियाओं के लिए एक सुरुचिपूर्ण समाधान कर रहे हैं, के रूप में अंतर्जात miRNAs अक्सर विभिंन रोग9राज्यों में बदल रहे हैं ।
विश्लेषण सीरम नमूने एक percutaneous कोरोनरी हस्तक्षेप (pci), एक पीसीआई के बाद 8 एच, और एक pci के बाद 16 ज एक तीव्र अनुसूचित जनजाति-खंड उन्नयन रोधगलन (STEMI) के साथ रोगियों से पहले अधिग्रहीत किए गए थे । STEMI रोगियों को गंभीर ischemia प्रदर्शन और इस तरह नए ischemia के मूल्यांकन के लिए योग्य है । के लिए मीर के कैनेटीक्स-४९९ रिहाई और मीर के संभावित उपयोग-४९९ हृदय रोग के ischemia के लिए एक के रूप में एक-मार्कर का मूल्यांकन करने के लिए, मीर-४९९ तीन अलग समय14अंक के लिए सभी रोगियों में dPCR के साथ विश्लेषण किया गया था ।
चित्रा 1 अंतिम miRNA एकाग्रता सॉफ्टवेयर द्वारा गणना दे सकारात्मक बूंदों के चयन को दर्शाता है. एक नमूने में सकारात्मक के अंश प्रतियां की एकाग्रता निर्धारित करता है/µ एल के रूप में वाणिज्यिक dPCR सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की । परिणाम भी एक 2d साजिश में कल्पना की जा सकती है और सकारात्मक मैंयुअल रूप से हलकों के साथ चिह्नित किया जा सकता है । एकाग्रता केवल अगर वे NTCs के विशिष्ट प्रवर्धन से ऊपर है माना जाता है ।
चित्रा 2 डुप्लिकेट में एक सिंथेटिक miRNA oligonucleotide-मीर-499-5p कमजोर पड़ने श्रृंखला के रैखिकता और अच्छाई के फिट से पता चलता है । एक 8-कदम कमजोर पड़ने श्रृंखला २,५०० प्रतियां/µ एल से 0 प्रतियां/µ एल के लिए किया गया था । परिकलित अपेक्षित प्रतिलिपि/µ l तालिका 5 में वर्णित के रूप में १००% RT और डिजिटल पीसीआर दक्षता मान । इस सेटअप में, डिजिटल पीसीआर रैखिकता के एक उच्च डिग्री (r2 = ०.९९) दर्शाता है । पता लगाने की सीमा (लोद = ०.१२) और ठहराव की सीमा (LoQ = ०.२३) भी चित्र 2में प्रस्तुत कर रहे हैं, दिखा रहा है कि एक भी कम miRNA अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है । इस प्रकार, dPCR के लिए भी कम सीरम परिचालित miRNAs के स्तर मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है । पता लगाने की सीमा (लोद) और ठहराव (LoQ) की सीमा Forootan एट अल के दृष्टिकोण के बाद की गणना कर रहे हैं । 15 और लोद के रूप में परिभाषित कर रहे हैं = lob + १.६४५ x σकमएकाग्रतानमूनाहै, जहां की सीमा के रूप में रिक्त (lob) lob की गणना है =रिक्त + १.६४५ x σरिक्त। LoQ तो मानक घटता15दोहराने चलने का अनुमान है । miRNAs के reproducible ठहराव को सुनिश्चित करने के लिए, केवल miRNA सांद्रता जो लोद और LoQ के ऊपर झूठ बोलते हैं, एक मान्य सटीक मान के रूप में माना जाता है ।
चित्रा 3 मीर के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है-४९९ एक अनुसूचित जनजाति ऊंचाई रोधगलन (STEMI) के साथ रोगियों के स्तर, प्रत्येक समय बिंदु पर n = 16 । नमूने एक percutaneous हस्तक्षेप (PCI) (टी = 0) से पहले लिया गया था, एक पीसीआई के बाद 8 ज (टी = 8), और एक पीसीआई के बाद 16 एच (टी = 16), और मीर-४९९ के स्तर मीर की तुलना में थे-४९९ स्थिर कोरोनरी धमनी की बीमारी के साथ रोगियों के स्तर (सीएडी, एन = 20). मुख्य रोगी विशेषताओं तालिका 6में पाया जा सकता है । एक रोधगलन के बाद पहले 8 में सीरम में मीर-४९९ के प्रारंभिक रिलीज के बाद, मीर-४९९ के स्तर 16 के बाद फिर से कम हो ज । वृद्धि में एक प्रवृत्ति पहले से ही STEMI (टी = 0) की शुरुआत में देखा जा सकता है, और मीर के एक महत्वपूर्ण वृद्धि-४९९ सीएडी के साथ रोगियों की तुलना में स्तर STEMI के बाद 8 ज देखा जा सकता है (टी = 8, पी < 0.01) जब मीर-४९९ के स्तर की तुलना मीर-४९९ स्थिर सीएडी रोगियों के स्तर । रिसीवर ऑपरेटिंग घटता (ROC) एक उपंयास के रूप में एक STEMI के साथ रोगियों के बीच अंतर करने के लिए एक उपन्यास के रूप में मीर के संभावित उपयोगिता दिखाने के लिए सीएडी और मरीजों के साथ रोगियों के बीच (वक्र (ईमेज) के तहत एक percutaneous हस्तक्षेप से पहले लिया नमूनों के लिए ०.६२ = (पीसीआई), ईमेज = ०.७५ एक pci के बाद 8 ज लिया नमूनों के लिए, और ईमेज = ०.७८ के नमूने के लिए 16 घंटे के बाद एक पीसीआई के सीरम स्तर की तुलना में-सीएडी के साथ रोगियों में ४९९].
चित्रा 1: डुप्लिकेट में प्रदर्शन एक कमजोर पड़ने श्रृंखला में सकारात्मक बूंदों का चयन । (A) थ्रेशोल्ड को ऋणात्मक बूंदों के ऊपर मैंयुअली सेट किया गया है । (ख) परिणाम एक 2d दाग में कल्पना कर रहे हैं, चक्कर द्वारा चयनित सकारात्मक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: सिंथेटिक मीर-४९९ oligonucleotide कमजोर पड़ने श्रृंखला । (क) माप डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया गया । डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं लॉग रूपांतरित प्रति निरपेक्ष प्रतियों के रूप में µ l. रैखिक प्रतिगमन और अच्छाई की-फ़िट (r2-value) दिखाए जाते हैं । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । (ख) यह पैनल पता लगाने की सीमा (लोद) और ठहराव (LoQ) की सीमा को दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: परिसंचारी सीरम मीर के ठहराव-499-5p के साथ रोगियों में अनुसूचित जनजाति-ऊंचाई रोधगलन (एन = 16) percutaneous कोरोनरी हस्तक्षेप (pci) से पहले, pci के बाद 8 एच, और 16 ज pci के बाद, स्थिर कोरोनरी धमनी के साथ रोगियों की तुलना में रोग (n = 20) । (क) परिसंचारी सीरम मीर-499-5p के रूप में मतलब के अनुरूप p-value द्वारा परिकलित एक-तरफ़ा ANOVA द्वारा एक Bonferroni पोस्ट हॉक परीक्षण (पी < 0.05 के रूप में माना जाता था के साथ माध्य की मानक त्रुटि के साथ का प्रतिनिधित्व किया है सांख्यिकीय महत्वपूर्ण). (ख) एक रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता वक्र (ROC) विश्लेषण पैनल Aसे डेटा पर किया जाता है । ROC विश्लेषण की संवेदनशीलता और विशिष्टता को दर्शाता है । इसके अलावा, वक्र (ईमेज) मूल्यों के तहत संगत क्षेत्र दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| नमूना राशि | ||||
| n = 1 | /well [μl] | |||
| nuclease-मुफ्त पानी | ४.१६ | |||
| 10x रिवर्स प्रतिलेखन बफर | १.५ | |||
| 100nM dNTP | ०.१५ | |||
| RNAse अवरोधक | ०.१९ | |||
| विशिष्ट आरटी प्राइमर | 3 | |||
| कमर्शियल रिवर्स Transcriptase एंजाइम ५० यू उल/ | 1 | |||
| मास्टर-मिक्स टोटल | 10 | |||
तालिका 1: उल्टा प्रतिलेखन एजेंट मिश्रण ।
| तापमान | समय |
| 16 डिग्री सेल्सियस | 30 मिनट |
| ४२ ° c | 30 मिनट |
| ८५ ° c | 5 मिनट |
| 4 ° c | ∞ |
तालिका 2: रिवर्स प्रतिलेखन के लिए थर्मल सायक्लिंग शर्तों ।
| नमूना राशि | ||||
| n = 1 | /well [μl] | |||
| nuclease-मुफ्त पानी | ७.६७ | |||
| कमर्शियल dPCR मिक्स | 10 | |||
| 20x विशिष्ट hydrolysis प्राइमरी/ | 1 | |||
| मास्टर-मिक्स टोटल | १८.६७ | |||
तालिका 3: डिजिटल पीसीआर रिएजेंट मिक्स ।
| तापमान | समय |
| ९५ ° c | 10 मिनट |
| ९४ ° c | 30 सेकेंड (x40) |
| ६० ° c | 1 min |
| ९८ ° c | 10 मिनट |
| 4 ° c | ∞ |
तालिका 4: डिजिटल पीसीआर के लिए थर्मल सायक्लिंग शर्तों ।
| ट्यूब | हस्तांतरित सिंथेटिक oligonucleotide मीर-४९९ (µ एल) | मंदक (µ l) | miRNA (कॉपियां/µ एल) | RT में µ l की अपेक्षित प्रतियां/ | dPCR में अपेक्षित प्रतियां/µ l |
| मूल | ६.०२२ x 1012 | ||||
| 1 | 10 | ९९० | ६.०२२ x 1010 | ||
| 2 | 10 | ९९० | ६.०२२ x 108 | ||
| 3 | 10 | ९९० | ६.०२२ x 106 | ||
| 4 | १८.७ | ९८१.३ | १.१२८ x 105 | ३७६०० | २५०० |
| 5 | ४० | ६० | ४.५११ x 104 | १५०४० | १००० |
| 6 | ५० | ५० | २.२५६ x 104 | ७५२० | ५०० |
| 7 | ४० | १६० | ४.५११ एक्स 103 | १५०४ | १०० |
| 8 | ५० | ५० | २.२५६ एक्स 103 | ७५२ | ५० |
| 9 | ४० | १६० | ४.५११ एक्स 102 | १५०.४ | 10 |
| 10 | ५० | १५० | १.१२८ एक्स 102 | ३७.६ | २.५ |
| 11 | 0 | ५० | 0 | 0 | 0 |
तालिका 5: मीर के लिए सिंथेटिक कमजोर पड़ने श्रृंखला-४९९ ।
| विशेषता | सभी | स्थिर सीएडी रोगियों (n = 20) | STEMI रोगियों (n = 24) | पी-मान |
| उम्र | ६४.७ ± ११.९ | ६६.७ ± १३.१ | ६२.२ ± ९.९ | ०.२८१० |
| पुरुषों | ७७.८% | ६५% | ९३.८% | ०.०३९२ |
| डीएम | ३३.३% | ४०% | 25 | ०.३४२८ |
| HTN | ६१.१% | ६०% | ६२.५% | ०.८७८५ |
| डिसलिपिडेमिया | ३८.९% | ६५% | ६.३% | ०.०००३ |
| धूम्रपान | ४७.२% | ५५% | ३७.५% | ०.३७९६ |
| परिवार का इतिहास | 25 | ३५% | १२.५% | ०.१२१३ |
| मोटापे | ५८.३% | ५५% | ६२.५% | ०.६५०१ |
| सीरम क्रिएटिनिन (mg/ | ०.९४ (०.८३-1) | ०.९८ (०.८२-१.०१) | ०.९३ (०.८३-1) | ०.७२५५ |
| CK चोटी (यू/ | १६१ (१०२-६११) | १२६ (८१-१६१) | ४९२ (२२८-३२०८) | ०.०००४ |
| cTnT चोटी (एनजी/ | ३२२.५ (२३.८-४५३३) | 18 (7-२५.३) | २४९२ (२४०-५५८६) | ०.०००२ |
| LVEF% | ४५% (४०%-५०%) | ४५% (३२.५%-५५%) | ४५% (४५%-५०%) | ०.९५९६ |
| मान ± एसडी मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; माध्य मान (25 से 75 शतमक श्रेणी तक) या% | ||||
| डीएम: मधुमेह | ||||
| HTN: उच्च रक्तचाप | ||||
| CK: Creatine कळेनासे | ||||
| cTnT: कार्डिएक ट्रोपोनिन टी | ||||
| LVEF: बायां वेंट्रिकुलर बेदखली अंश | ||||
तालिका 6: मुख्य रोगी लक्षण ।
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Discussion
डिजिटल पीसीआर एक अपेक्षाकृत उपंयास है कि पीसीआर के अंत बिंदु विधि है कि एक नमूने के भीतर न्यूक्लिक एसिड की प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव की अनुमति देता है । विधि एक कम परिवर्तनशीलता, एक वृद्धि हुई दिन-दिन reproducibility, और एक बेहतर संवेदनशीलता11,12सहित विशेष लाभ, के पास । इसके अलावा, लगभग २०,००० एकल प्रतिक्रियाओं और समापन बिंदु विश्लेषण में नमूना के विभाजन के कारण, dPCR मात्रात्मक आरटी की तुलना में पीसीआर में पदार्थ हस्तक्षेप करने के लिए और अधिक मजबूत है-पीसीआर16। dPCR में ये गुण यह ठहराव के लिए एक नैदानिक उपकरण के रूप में मात्रात्मक आरटी-पीसीआर के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाते हैं । के रूप में परिसंचारी miRNAs अक्सर कम सीरम सांद्रता पर मौजूद हैं, अब तक, वैज्ञानिकों ने miRNAs9पीसीआर द्वारा उचित मात्रा में चुनौती दी गई है । दूसरी ओर, dPCR उचित भी सीरम में एक कम miRNA अभिव्यक्ति है, कम गिनती miRNA ठहराव17में मनाया समस्याओं का शमन कर सकते हैं । dPCR की क्षमता सीधे गिनती/µ एल देने के लिए, यहां तक कि एक बहुत कम miRNA अभिव्यक्ति में, इस प्रकार यह miRNA में हृदय अनुसंधान समुदाय के लिए एक आकर्षक नैदानिक उपकरण बनाता है । के रूप में गिनती में दिया एकाग्रता/µ एल कमजोर पड़ने के लिए निष्कर्षण में इस्तेमाल किया कारक से गुणा किया जा सकता है, भ-प्रतिक्रिया, और dPCR, यह सीरम के 1 µ एल में प्रतियां की सही संख्या को प्राप्त करने के लिए संभव है. यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह एक थाली पर अप करने के लिए ९६ नमूनों में प्रदर्शन किया जा सकता है, इसलिए बड़े हृदय अध्ययन के लिए एक उपकरण प्रदान । हालांकि dPCR मात्रात्मक आर सी-पीसीआर पर कई लाभ दर्शाती है, यह अभी तक नियमित रूप से हृदय परीक्षण में miRNAs के ठहराव के लिए लागू नहीं है । इसके अलावा, मानकीकृत डेटा सामांयीकरण प्रक्रियाओं की कमी है ।
इस दृष्टिकोण में, हम है कि dPCR, फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ संयुक्त प्रदर्शित करता है, हृदय रोग से जुड़े miRNAs घूम के विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है । इस रिपोर्ट के साथ, हम दोनों dPCR के माध्यम से miRNA का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर पर dPCR के लाभों की पुष्टि के उद्देश्य से ।
हम अच्छा रैखिकता dPCR प्रदर्शन और पता लगाने और miRNAs के लिए dPCR के ठहराव की कम सीमा की पुष्टि की । नमूना एक सिंथेटिक oligonucleotide के साथ spiking द्वारा, नमूना का सामान्यीकरण, निष्कर्षण दक्षता और नमूना करने के लिए नमूना भिन्नता के लिए समायोजन संभव है.
अंत में, डिजिटल पीसीआर, के रूप में यह दोनों तकनीकी प्रवीणता और नैदानिक क्षमता में श्रेष्ठता दर्शाती है, miRNA ठहराव के लिए सबसे अच्छा वर्तमान विधि है और आगे बड़ी बहु केंद्र हृदय miRNA के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों की कोई पावती नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
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