Summary
Cirkulerande mikroRNA har visat lovande resultat som biomarkörer för hjärt-kärlsjukdomar och akut hjärtinfarkt. I denna studie beskriver vi ett protokoll för miRNA utvinning, omvänd Transkription och digital PCR för absolut kvantifiering av MicroRNA i serum hos patienter med kardiovaskulär sjukdom.
Abstract
Cirkulerande serum mikroRNA (Mirna) har visat lovande resultat som biomarkörer för kardiovaskulär sjukdom och akut hjärtinfarkt (AMI), släpps ut från hjärt-celler i cirkulationen. Cirkulerande MicroRNA är mycket stabila och kan kvantifieras. Det kvantitativa uttrycket för specifika MicroRNA kan kopplas till patologi, och vissa MicroRNA Visa hög vävnad och sjukdom specificitet. Att finna nya biomarkörer för hjärt-kärlsjukdomar är av betydelse för medicinsk forskning. Digitala polymeras-kedjereaktion (dPCR) har helt nyligen uppfunnits. dPCR, kombinerat med fluorescerande hydrolys sonder, kan särskild direkt absolut kvantifiering. dPCR uppvisar överlägsna tekniska egenskaper, inklusive en låg variabilitet, hög linjäritet och hög känslighet jämfört med kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR). DPCR är således en mer exakt och reproducerbar metod för direkt kvantifiering MicroRNA, särskilt för användning i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar. I denna publikation beskriver vi hur du effektivt utför digital PCR för att bedöma antalet absoluta kopia i serumprov.
Introduction
Cirkulerande MicroRNA har identifierats som lovande markörer för ett antal sjukdomar, däribland hjärt-kärlsjukdom1. MicroRNA är små, icke-kodande enkelsträngat RNA molekyler (cirka 22 nukleotider långa) är inblandade i den post-transcriptional förordning via ändring av budbärar-RNA översättning och påverkande gene expression2, och släpps ut i cirkulationen i både fysiologiska och patologiska stater. Det kvantitativa uttrycket för specifika MicroRNA kan kopplas till patologin och vissa MicroRNA Visa hög vävnad och sjukdom specificitet1. I hjärt-kärlsjukdomar, har MicroRNA blivit attraktiva kandidater som nya biomarkörer eftersom de är anmärkningsvärt stabil i serum och kan enkelt kvantifieras med hjälp av PCR-metod3. Det potentiella värdet av MicroRNA som biomarkörer för hjärtinfarkt har utvärderats i mindre studier, men en validering i stora kohorter saknas2. Till exempel miR-499 finns starkt uttryckt i hjärtinfarkt muskeln, och det har visat sig öka avsevärt i en AMI4,5,6. Ytterligare, det reglerar programmerad celldöd (apoptos) och differentiering av hjärtmuskelceller och således är involverad i flera mekanismer efter en AMI7. Bortsett från några små studier rapporterar en överlägsenhet och tillkommande värdet av MicroRNA för diagnos av AMI, har den överlägsenhet eller jämställdhet till hög känslighet hjärt troponins inte ännu bevisat i storskaliga studier2,5 ,6,8. Fler prospektiva studier i stora kohorter, därför behövs för att bedöma potentiella diagnostiska värdet av microRNA. Dessutom metoder miRNA rapporteringsgräns behöver optimeras och standardiserade med jämförbara protokoll9. Standardiserade analyser kan minska inkonsekventa resultat och kan hjälpa MicroRNA att bli potentiella biomarkörer för rutinmässig klinisk tillämpning, som biomarkörer behöver kvantifieras på ett reproducerbart sätt att säkerställa deras kliniska tillämpligheten.
DPCR har nyligen införts som en slutpunkt analys. Det partitioner provet till ungefärligt 20.000 enskilda reaktioner10. DPCR systemet utnyttjar sedan en matematisk Poisson statistisk analys av fluorescerande signaler (positiva och negativa reaktioner), möjliggör en absolut kvantifiering utan en standardkurva10. När man kombinerar dPCR med fluorescerande hydrolys sonder, är mycket specifika direkt absolut kvantifiering av MicroRNA möjlig. Digitala polymeraskedjereaktion har visat för att uppvisar överlägsna tekniska egenskaper (inklusive en minskad variabilitet, en ökad dagliga reproducerbarhet, en hög grad av linjäritet och hög känslighet) för att kvantifiera miRNA nivåer i den omsättning jämfört med kvantitativ realtids PCR-10,11. Dessa överlägsna tekniska egenskaper kan bidra till att mildra nuvarande begränsningar med cirkulerande MicroRNA som biomarkörer och kan leda till inrättandet av MicroRNA som biomarkörer i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar och som en diagnostisk metod i Allmänt. I en tidigare studie, vi nyligen tillämpas dPCR för absolut kvantifiering av cirkulerande MicroRNA hos patienter med en AMI och kunde påvisa överlägsen diagnostisk potential jämfört med kvantifiering av MicroRNA av qPCR12.
I denna publikation vill vi visa att använda dPCR är en exakt och reproducerbar metod för direkt kvantifiering av cirkulerande kardiovaskulära microRNA. Absolut kvantifiering av miRNA nivåer i serum, använder digital PCR, visar potential för användning i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar. I den här skriften beskriver vi i detalj hur du effektivt utför digital PCR och hur man upptäcker absoluta miRNA kopienumret i serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utvinning av miRNA från Plasma/Serum
Obs: För att kvantifiera MicroRNA på lämpligt sätt, rätt mikroRNA isolering från plasma/serum är ett avgörande steg. En viktig sak att komma ihåg, särskilt eftersom olika protokoll finns, är att följa samma arbetsflöde vid bearbetning av proverna. I detta protokoll ur miRNA 50 µL serum. Använd inte mer än 200 µL som denna gräns rätta extraheringen.
- Förbereda serum eller Tina frysta prover.
- Lägga till 250 µL (5 volymer) kommersiella lysis reagens 50 µL serum. Stödja lys av vortexa. Placera röret med den lysate på bänken i rumstemperatur i 5 min.
- Spika den lysate med 3,5 µL av spike-i kontroll (1,6 x 107 kopior/μl) och blanda dem genom vortexa.
- Tillsätt 50 µL av kloroform (d.v.s., lika mycket om start serumprovet) för fasseparation. Skaka tuben kraftigt för 15 s. plats röret på bänken i rumstemperatur i 2-3 min.
- För fasseparation, Centrifugera röret vid 12 000 x g vid 4 ° C under 15 minuter.
Obs: Proverna delas nu in i en övre vattenfas som innehåller RNA, en vit interphase och en lägre, rosa organiska fasen. - Överföra övre vattenfasen (100 µL) som innehåller RNA till en ny tub. Över inte vita interphase material som detta förfalskar rätt RNA räkna.
- Tillsätt 150 µL (dvs1,5 x volymen av överförda provet) 100% etanol. Blanda material genom pipettering dem upp och ner. Inte Centrifugera dem och snabbt gå vidare till nästa steg.
- Pipettera 250 µL av provet på en kommersiell spin kolumn i en 2 mL collection tube. Stäng locket. Centrifugera kolumnen > 8000 x g i rumstemperatur i 15 s. Kassera genomflöde.
- Lägga till 700 µL av kommersiella tvätt buffert nummer 1 i kolumnen spin. Stäng locket och centrifugera kolumnen > 8000 x g i rumstemperatur i 15 s. kasta genomgång tvätt bufferten.
- Tillsätt 500 µL av kommersiella tvätt buffert nummer 2 till kolumnen spin. Stäng locket och centrifugera kolumnen > 8, 000 x g i rumstemperatur i 15 s. kasta genomgång tvätt bufferten.
- Pipettera 500 µL av 80% etanol till kolumnen spin. Stäng locket, Centrifugera kolumnen > 8, 000 x g i rumstemperatur i 2 min. Kassera samling röret med genomflöde.
- Överföra den spin kolumnen till en ny 2 mL samling tub. Centrifugera kolumnen i full fart med öppnat lock torka membranet. Kassera samling röret med genomflöde.
- Över den spin kolumnen till en ny 1,5 mL samling tub. Eluera RNA genom att tillämpa 30 µL RNase-fritt vatten direkt till centrum av membranet. Stäng locket. Centrifugera kolumnen i full fart för 1 min.
- Store RNA vid-70 ° C.
Obs: Lagring av renat RNA i RNase-fritt vatten mellan-70 ° C till-20 ° C garanterar ingen nedbrytning av RNA för 1 år. Efter tillverkarens protokollet är den minsta mängden RNase-fritt vatten för att späda ut RNA 10 µL. använder mindre än 10 µL kan otillräckligt återfukta membranet och minska den totala RNA avkastningen.
2. omvänd Transkription
Obs: Kompletterande DNA (cDNA) syntetiserades med hjälp av följande 15 µL omvänd Transkription (RT) protokollet (total reaktionsvolym).
- Tina i RT kit på is. Hålla enzymerna i frysen så länge som möjligt att hindra dem från att förnedrande och snurra dem ner före användning. Tina RT grundfärger på isen och snurra dem ner före användning.
- Förbereda huvudmixen som beskrivs i tabell 1.
- Kombinera 10 µL master mix och 5 µL av extraherade RNA per brunn i en 96 väl-plattan.
- Centrifugera väl plattan på 2 000 x g vid 4 ° C i 2 min.
- Använda protokollet termisk cykel beskrivs i tabell 2 för omvänd Transkription.
Obs: Som beskrivs nedan, cDNA kan direkt bearbetas i digital PCR-maskinen (se Tabell för material). Alternativt, det kan förvaras vid-20 ° C.
3. droplet Generation och Digital PCR
Obs: Digital PCR utfördes med hjälp av följande 40 µL protokoll.
- Tina den kommersiella dPCR mix, den förberedda cDNA och PCR primers på is. Centrifugera dem strax före användningen.
- Förbereda huvudmixen som beskrivs i tabell 3.
- Lägg till 1,33 μL/brunn av produktens RT och centrifugera det kortfattat.
- Överför med pipett 20 μL av provet till varje brunn 8-väl kassetten (medium raden).
Obs: Om 8-väl kassetten inte är helt fylld, fylla upp återstående brunnarna med icke-mall kontroller (NTCs) som utelämnar cDNA (dvs.den RT-produkt som tillverkas med vatten istället för extraherade RNA) eller dPCR kommersiella buffert. NTC fungerar som en kontaminering. Vatten skall inte användas i återstående brunnarna, eftersom det kommer att försämra kvaliteten på droplet bildandet. - Pipettera 70 μL av droplet generation olja för sonderna i oljekällor (nedersta raden) i 8-väl kassett.
- Placera en packning ovanpå 8-väl kassetten och placera kassetten i droplet generator. Stäng den droplet-generatorn. Vänta tills 3 indikatorlamporna har fast grönt sken.
Obs: Det är nu som genereras droppar. - Försiktigt och långsamt överföra 40 μl av droplet-bildade provet (översta raden) i separata brunnar i en plattan med 96 brunnar genom pipettering.
- Efter avslutad droplet bildandet av prov, försegla PCR-plattan med en tallrester dPCR folie vid 180 ° C för 4 s.
- Placera förslutna folie PCR-plattan i apparat och cykla det som beskrivs i tabell 4, ramp uppgå till 2,5 ° C/s.
4. droplet läsning och analysera
- Överföra plattan från termocykel till basen av innehavaren av plattan. Dra åt PCR-plattan genom att placera toppen av plattan innehavaren på PCR-plattan.
- Starta programvaran kommersiella dPCR.
- Ange exempel namn, namnet på experimentet, och målet i setup. Välj absolut kvantifiering.
- Starta droplet-programmet läsa genom att klicka på Kör. Välj FAM/HEX eller FAM/VIC som upptäckt kemi när du arbetar med hydrolys sonder.
Obs: Programvaran kommersiella dPCR kommer sedan auto-analysera data. - Kontrollera droplet siffrorna i resultattabellen för att säkerställa en korrekt droplet-generation.
- Välj alla brunnar med den samma kvantifierade miRNA och klicka på analysera. Använd 2D blot att markera positiva droppar och manuellt rätta auto-analyseras data (figur 1).
5. korrekta beräkningar på prov
- Normalisera provet genom att multiplicera provet med den normalisering faktorn (NF).
NF = Median [C. elegans miR-39 mätningar]alla prover/ [C. elegans miR-39]givet prov - Beräkna den slutliga miRNA serumkoncentration, justering för utspädningsfaktorer (DF).
[miRNA] slutliga = [miRNA]raw värde x DFRT x DFdPCR x DFEx
Var:
[miRNA] råa värdet = den miRNA kvantifieras med kommersiella dPCR programvara;
DFRT = utspädningsfaktorn för mallen i omvänd Transkription;
DFdPCR = utspädningsfaktorn för mallen i dPCR;
DFEx = spädningsfaktorn i utvinning.
6. syntetiska oligonukleotiden spädningsserien
- Tina frystorkade syntetiska oligonukleotiden på is. Kort Centrifugera det.
- Späd den frystorkade syntetiska oligonukleotiden i nuclease-fritt vatten till en slutlig koncentration av 10 pmol / µL. kort Centrifugera det.
- Späd den i nuclease-fritt vatten som beskrivs i tabell 5. Centrifugera utspädning kort mellan varje utspädningssteg vid 8000 x g i 10 s.
- Fortsätt med omvänd Transkription enligt beskrivningen i steg 2 och analysera proverna med digital PCR som beskrivs i steg 3 och 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Digital PCR kombinerat med fluorescerande hydrolys sonder gör det möjligt för forskare att direkt beräkna den absoluta mängden särskilda MicroRNA i kopior/μl. Som provet i dPCR är partitionerad i ungefärligt 20.000 enskilda PCR-reaktioner, dPCR inte kräver tekniska replikerar10. DPCR systemet utnyttjar en matematisk Poisson statistisk analys av fluorescerande signaler (skiljer sig mellan positiva och negativa reaktioner) möjliggör en absolut kvantifiering utan behovet av en standard kurva10. För att korrekt beräkna koncentrationerna, behövs en godtagbar droplet-räkna (> 15 000). Ingen mall kontroller säkerställa uteslutandet av betydande ospecifik förstärkning. Alla prover ingår i analysen bearbetas med samma volym, metod och PCR-protokoll för att stärka giltigheten av de erhållna resultaten. Erhållna halterna i dPCR är normaliserade med en median normalisering över alla prover analyseras med de syntetiska spetsade-i C. elegans miR-3913. Normalisera data till den uppmätta mängden spetsade-i C. elegans miR-39 korrigerar för prov till prov variation i RNA utvinning effektivitet och fungerar som en PCR-reaktion kontroll, vilket stärker giltigheten av resultaten. Det finns ingen etablerad guld-standard för att normalisera serum MicroRNA; dock exogena kontroller såsom den spetsade-i C. elegans miR-39 är en elegant lösning för normalisering förfaranden, som endogena MicroRNA är ofta ändras i olika sjukdom stater9.
De analyserade serumprover förvärvades före en perkutan koronar intervention (PCI), 8 h efter en PCI, och 16 h efter en PCI, från patienter med en akut ST-höjningsinfarkt (STEMI). STEMI patienter uppvisar svår ischemi och därmed kvalificera för utvärdering av nya ischemi biomarkörer. För att utvärdera kineticsen av miR-499 release och den potentiella användningen av miR-499 som en biomarkör för ischemi i hjärt-kärlsjukdom, analyserades miR-499 med dPCR över alla patienter för tre olika tid punkter14.
Figur 1 visar valet av positiva droppar ger den slutliga miRNA koncentrationen beräknas av programvaran. Andelen positiva i ett prov bestämmer koncentrationen av kopior/μl beräknat av kommersiella dPCR programvara. Resultaten kan också visualiseras i en 2D tomt och positiva kan markeras manuellt med cirklar. Koncentrationer anses endast om de är ovanför ospecifik förstärkning av NTCs.
Figur 2 visar linjäritet och godhet-av-fit i en syntetisk miRNA oligonukleotiden har-miR-499-5 p utspädning serie i dubbletter. En 8-stegs spädningsserien utfördes från 2.500 kopior/μl till 0 kopior/μl. Den beräknade förväntade kopior/μl anta som beskrivs i tabell 5 100% RT och digital PCR effektivitet. I den här installationen digital PCR visar en hög grad av linearitet (r2 = 0,99). Detektionsgränsen (LoD = 0,12) och kvantifieringsgränsen (LoQ = 0,23) också presenteras i figur 2, visar att även en låg miRNA uttryck kan detekteras framgångsrikt. DPCR kan således användas för att kvantifiera även låga serumnivåer av cirkulerande microRNA. Detektionsgränsen (LoD) och kvantifieringsgränsen (LoQ) beräknas enligt metoden av Forootan et al. 15 och är definierad som LoD = LoB + 1,645 x σlågakoncentrationprov, där gränsen för tomt (LoB) beräknas som LoB = genomsnittligtomt + 1,645 x σtomt. Kvantifieringsgränsen är då uppskattningsvis kör replikera standard kurvor15. För att säkerställa reproducerbar kvantifiering av MicroRNA, betraktas endast miRNA koncentrationer som ligger ovanför både av LoD och kvantifieringsgränsen som ett giltigt exakta värde.
Figur 3 visar representativa resultat av miR-499 nivåer av patienter med en ST-elevation myokardinfarkt (STEMI), n = 16 vid varje tidpunkt. Prover togs innan en perkutan intervention (PCI) (t = 0), 8 h efter en PCI (t = 8), och 16 h efter en PCI (t = 16), och nivån på miR-499 var jämfört miR-499 nivåer av patienter med stabil kranskärlssjukdom (CAD, n = 20). De huvudsakliga patientens egenskaperna återfinns i tabell 6. Efter den första utgåvan av miR-499 in serumet i första 8 h efter en hjärtinfarkt, minska miR-499 nivåer igen efter 16 h. En trend i ökning syns redan i början av STEMI (t = 0), och en betydande ökning av miR-499 nivåer jämfört med patienter med CAD kan ses 8 h efter STEMI (t = 8, p < 0,01) när man jämför miR-499 nivåer att miR-499 nivåer av stabil CAD patienter. Mottagaren fungerar kurvor (ROC) Visa möjliga nyttan av miR-499 som en roman biomarkör att skilja mellan patienter med CAD och patienter med en STEMI [arean under kurvan (AUC) = 0,62 för prover som tagits före en perkutan intervention (PCI), AUC = 0,75 för prover 8 h efter PCI, och AUC = 0,78 för prover tagna 16 h efter en PCI jämfört med serumnivåer av miR-499 patienter med CAD].
Figur 1: val av positiva droppar i en spädningsserien utförs i dubbletter. (A) tröskeln har angetts manuellt ovan negativa dropparna. (B) resultatet visualiseras i en 2D blot, det positiva som valts av cirklande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: syntetiska miR-499 oligonukleotiden spädningsserien. (A) Mätningarna utfördes i två exemplar. Uppgifterna presenteras log förvandlas som absolut kopior per µL. linjära regressioner och godhet-av-fit (r2-värde) visas. Data presenteras som medelvärde ± SEM. (B) denna panel visar detektionsgränsen (LoD) och kvantifieringsgränsen (LoQ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av cirkulerande serum miR-499-5 p hos patienter med ST-elevation myocardial infarkt (n = 16) innan perkutan koronar intervention (PCI), 8 h efter PCI och 16 h efter PCI, jämfört med patienter med stabil kranskärlssjukdom som står sjukdom (n = 20). (A) de cirkulerande serum miR-499-5 p föreställs som medelvärdet med standardavvikelsen för medelvärdet med motsvarande p-värde beräknas genom envägs ANOVA följt av ett Bonferroni post hoc test (p < 0.05 ansågs som statistiskt signifikant). (B) en mottagare verksamma karakteristiska kurva (ROC) analys utförs på data från panel A. ROC analysen visar sensitivitet och specificitet av biomarkören. Ytterligare, motsvarande arean under kurvan (AUC) värdena visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Provmängd | ||||
| n = 1 | / väl [μl] | |||
| Nuclease-gratis vatten | 4.16 | |||
| 10 x omvänd Transkription buffert | 1.5 | |||
| 100nM dNTP | 0,15 | |||
| RNAse inhibitor | 0,19 | |||
| specifika RT Primer | 3 | |||
| Kommersiella Omvänt transkriptas enzym 50 U/ul | 1 | |||
| Master-Mix totalt | 10 | |||
Tabell 1: Omvänd Transkription reagenser Mix.
| Temperatur | Tid |
| 16 ° C | 30 min |
| 42 ° C | 30 min |
| 85 ° C | 5 min |
| 4 ° C | ∞ |
Tabell 2: Termisk cykling villkor för omvänd Transkription.
| Provmängd | ||||
| n = 1 | / väl [μl] | |||
| Nuclease-gratis vatten | 7,67 | |||
| kommersiella dPCR mix | 10 | |||
| 20 x specifika hydrolys primer/sond | 1 | |||
| Master-Mix totalt | 18.67 | |||
Tabell 3: Digital PCR reagens Mix.
| Temperatur | Tid |
| 95 ° C | 10 minuter |
| 94 ° C | 30 SEK (x40) |
| 60 ° C | 1 min |
| 98 ° C | 10 minuter |
| 4 ° C | ∞ |
Tabell 4: Termisk cykling villkor för digital PCR.
| Tube | Överförda syntetiska oligonukleotiden miR-499 (µL) | Spädningsvätska (µL) | miRNA (kopior/μl) | Förväntade kopior/μl i RT | Förväntade kopior/μl i dPCR |
| Ursprungliga | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18,7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150,4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37,6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 5: Syntetiska spädningsserien för miR-499.
| Kännetecken | Alla | Stabila CAD patienter (n = 20) | STEMI patienter (n = 24) | p-värde |
| Ålder | 64,7 ± 11,9 | 66,7 ± 13,1 | 62,2 ± 9,9 | 0.2810 |
| Män | 77,8% | 65% | 93,8% | 0.0392 |
| DM | 33,3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61,1% | 60% | 62,5% | 0.8785 |
| Höga blodfetter | 38,9% | 65% | 6,3% | 0.0003 |
| Rökaren | 47,2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| Familjehistoria | 25% | 35% | 12,5% | 0.1213 |
| Övervikt | 58,3% | 55% | 62,5% | 0.6501 |
| Serumkreatinin (mg/dL) | 0,94 (0,83 - 1) | 0,98 (0,82 - 1,01) | 0,93 (0,83 - 1) | 0.7255 |
| CK Peak (U / I) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0,0004 |
| cTnT Peak (ng/L) | 322,5 (23,8-4533) | 18 (7-25,3) | 2492 (240-5586) | 0,0002 |
| LVEF % | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45-50%) | 0.9596 |
| Värden presenteras som genomsnitt ± SD; Median värde (25: e till 75: e percentilen intervall) eller % | ||||
| DM: Diabetes mellitus | ||||
| HTN: hypertoni | ||||
| CK: kreatinkinas | ||||
| cTnT: hjärt troponin T | ||||
| LVEF: Ejektionsfraktion | ||||
Tabell 6: Main patientens egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digital PCR är en relativt ny slutpunkten metod av PCR som tillåter direkt absolut kvantifiering av nukleinsyror inom ett urval. Metoden besitter speciella fördelar, inklusive en minskad variabilitet, en ökad dagliga reproducerbarhet och en överlägsen känslighet11,12. Vidare, på grund av uppdelningen av provet till ungefärligt 20.000 enda reaktioner och endpoint analyser, dPCR är mer robust till interfererande substanser i PCR jämfört med kvantitativ RT-PCR-16. Dessa kvaliteter i dPCR gör det till ett attraktivt alternativ till kvantitativ RT-PCR som ett diagnostiskt verktyg för kvantifiering. Som cirkulerar MicroRNA är ofta närvarande vid låga serumkoncentrationer, hittills forskare har ifrågasatts att på lämpligt sätt kvantifiera MicroRNA av PCR-9. DPCR kan däremot, lämpligt kvantifiera även en låg miRNA uttryck i serum, mildra de problem som observerats i lågt antal miRNA kvantifiering17. DPCR förmåga att direkt ge räknas/µL, även i en mycket låg miRNA uttryck, således gör det en attraktiv diagnostikverktyg för kardiovaskulär forskning gemenskapen i miRNA biomarkör studierna. Som koncentrationen i räknas/µL kan multipliceras utspädningsfaktorn används i utvinning, RT-reaktionen och dPCR, är det möjligt att uppnå det exakta antalet kopior i 1 µL serum. Det arbetsflöde som presenteras här kan utföras i upp till 96 prover på en tallrik, därav ger ett verktyg för stora hjärt-studier. Även om dPCR uppvisar flera fördelar jämfört med kvantitativ RT-PCR, används det ännu rutinmässigt inte för kvantifiering av MicroRNA i hjärt-prövningar. Ytterligare, standardiserade data normalisering procedurer saknas.
I denna strategi visar vi att dPCR, kombinerat med fluorescerande hydrolys sonder, möjliggör specifika direkt absolut kvantifiering av cirkulerande MicroRNA kopplad till hjärt-kärlsjukdom. Med detta betänkande att vi både demonstrera ett optimerat protokoll för miRNA upptäckt via dPCR och bekräftar fördelarna med dPCR över kvantitativ RT-PCR.
Vi bekräftade bra linjäritet dPCR utställningar och låg gränserna för detektion och kvantifiering av dPCR för att kvantifiera microRNA. Av tillsatta provet med en syntetisk oligonukleotiden, är normalisering av provet möjligt, justering för utvinning effektivitet och prov till prov variation.
Sammanfattningsvis, digital PCR, som den uppvisar överlägsenhet i både tekniska färdigheter och diagnostiska potential, är den bästa nuvarande metoden för miRNA kvantifiering och ytterligare kan användas för stora multicenter kardiovaskulära miRNA biomarkör studierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
