Summary
Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.
Abstract
Controlar las convulsiones, sigue siendo un tema difícil para la comunidad médica. Para avanzar, los investigadores necesitan una forma de estudiar dinámica del asimiento e investigar sus mecanismos subyacentes. Convulsión aguda modelos son convenientes, ofrecen la posibilidad de realizar grabaciones electrofisiológicas y pueden generar un gran volumen de electrográficas asimiento-como acontecimientos (ictal). Los resultados prometedores de los modelos de la convulsión aguda luego pueden avanzar a modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos. Así, estudiando convulsiones en aguda modelos que reproducen fielmente las firmas electrográficas y dinámicas de un ataque clínico será esencial para hacer los resultados clínicamente relevantes. Estudiar acontecimientos ictales en convulsión aguda modelos preparados a partir de tejido humano también es importante para hacer conclusiones que son clínicamente relevantes. El objetivo primordial en este trabajo es en el modelo cortical de la 4-AP debido a su versatilidad en la generación de acontecimientos ictales en estudios tanto en vivo como en vitro , así como en ratón y tejido humano. Los métodos en este artículo también describe un método alternativo de la inducción de convulsiones mediante el modelo de cero Mg2 + y proporcionar una descripción detallada de las ventajas y limitaciones de la actividad epileptiforme generada en las distintas aguda modelos de convulsiones. Por otra parte, aprovechando comercialmente disponible optogenetic cepas de ratón, un pulso de luz breve (30 ms) puede utilizarse para activar un evento ictal idéntico a las que ocurren espontáneamente. Asimismo, ms de 30-100 bocanadas de neurotransmisores (Ácido Gamma Amino butírico o glutamato) pueden aplicarse a tejido humano para desencadenar eventos ictales que son idénticos a las que ocurren espontáneamente. La capacidad de desencadenar acontecimientos ictal en demanda en modelos de convulsiones agudas ofrece la recién descubierta capacidad de observar la secuencia exacta de eventos que subyacen la dinámica de la iniciación de asimiento y evaluar eficientemente potenciales terapias anticonvulsivas.
Introduction
Modelos de crisis aguda pueden reproducir con éxito firmas electrográficas ictales eventos observados en el electroencefalograma (EEG) de las personas que experimentan una convulsión recuerdas. Los investigadores utilizan estos acontecimientos ictal como (en adelante 'ictales eventos') como sustitutos para el evento de decomiso1. Clínico, ictales eventos sirven como un proxy confiable para los eventos de crisis puesto que las convulsiones son un trastorno neurológico que se origina en el cerebro. En la unidad de monitoreo de epilepsia, neurólogos se basan en la detección de eventos ictales para confirmar la región epileptógena del cerebro y aislarlo para resección2. En la unidad de cuidados intensivos, los médicos monitorear actividad ictal evaluar si persiste cualquier actividad convulsiva en pacientes sedados3. Controlar las convulsiones queda un tema desafiante para la comunidad médica, como 30% de pacientes con epilepsia son resistentes a los fármaco a la medicación disponible4,5, y 10% de casos médicos de convulsiones inducidas por drogas no responde al tratamiento estándar3. Esto presenta una seria preocupación para la sociedad, como 10% de la población estadounidense es prospectado para experimentar un episodio de convulsión en su vida y se espera que el 3% desarrollan epilepsia6.
Estudiando las convulsiones en modelos de epilepsia crónica es caro, laborioso y a menudo toma meses para preparar7. También es difícil realizar las grabaciones electrofisiológicas en animales en libre movimiento. Ensayos clínicos en humanos enfrentan a problemas similares, así como complicaciones adicionales relacionadas con el consentimiento del paciente, variabilidad de orígenes de los participantes y las consideraciones Morales y éticas involucradas8. Modelos de crisis aguda, por el contrario, son favorables porque son relativamente cómoda para prepararse, rentable y capaz de generar grandes volúmenes de eventos ictales de estudio9. Además, el tejido se fija en una posición estable, por lo que las condiciones son ideales para realizar las grabaciones electrofisiológicas necesarias para estudiar la dinámica de la crisis y la patofisiología subyacente relacionada. Modelos de convulsión aguda siguen siendo favorables sobre modelos en silico (PC) porque se basan en material biológico compuesto por constituyentes red neuronal del cerebro con todos sus factores inherentes y conectividad sináptica, que no puede ser capturado por la computadora más detallada de los modelos10. Estas características hacen de modelos de convulsión aguda preparados para ser eficiente en la detección de potenciales terapias anticonvulsivas y que resultados preliminares antes de avanzar para la posterior investigación en modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos.
Por lo general, modelos de convulsión aguda se derivan el tejido normal del cerebro que ha sido sometido a condiciones hiper excitable. Para inducir acontecimientos ictales clínicamente relevantes en el tejido cerebral sano, es importante entender que el cerebro funcione óptimamente en un estado crítico11 donde (E) de la excitación y la inhibición (I) son equilibrados12. Una interrupción de la E-I equilibrio puede llevar al estado de crisis hiper excitable que precipitan acontecimientos ictales. Por consiguiente, dentro de este marco conceptual, existen dos estrategias principales para generar eventos de ictales en rebanadas de cerebro (en vitro) o en preparaciones de todo el cerebro (en vivo): aumento o disminución de la inhibición ("desinhibición") excitación ("no-desinhibición"). Sin embargo, acontecimientos ictales son altamente ordenados y sincronización eventos que requieren de la influencia de interneuronas GABAérgicas para organizar la red de los nervios actividad13,14. Por esta razón, modelos de desinhibición no son los más efectivos para generar acontecimientos ictales en redes neuronales aisladas, como en una en vitro cerebro rebana15, mientras que en vitro modelos desinhibición comúnmente clavar actividad recuerda a clavar interictal-como. Además, dentro de este marco conceptual, un evento momentáneo de sincronización también fiable puede desencadenar un evento ictal16. De hecho, un evento ictal puede ser desencadenado por cualquier perturbación menor aplicada a los sistemas neuronales17 cuando se encuentra en un estado crítico de punto de transición ("bifurcación")18. Tradicionalmente, estas perturbaciones fueron inducidas por estimulación eléctrica. Sin embargo, el reciente desarrollo de optogenetics en neurociencia, ofrece ahora una estrategia más elegante para inducir transiciones de estado crítico16.
Los métodos descritos en este artículo muestran cómo generar acontecimientos ictal en demanda en modelos de convulsiones agudas en vitro (paso 1 del Protocolo) y estudios en vivo (paso 2 del Protocolo). Implican la elección de la región del cerebro, método de inducción de convulsiones, tipo de estudio y especies; sin embargo, nos centraremos en la opción recomendada de un modelo agudo 4-AP corticales convulsiones debido a su versatilidad en una amplia variedad de tipos de estudios. El modelo de 4 AP convulsiones agudas en vitro se basa en el protocolo estándar para preparar rodajas de cerebro de alta calidad para grabaciones electrofisiológicas y la proyección de imagen estudia19. Estos protocolos ya han sido utilizados para hacer en vitro cerebro coronales rebanadas de la corteza somáticosensorial-motor de ratones16,20 y seres humanos21. Modificaciones para generar acontecimientos ictales en estos tipos de rebanadas del cerebro han demostrado previamente16 y todos los detalles se describen en el Protocolo a continuación. El modelo agudo en vivo 4-AP convulsiones corticales se basa en el protocolo estándar para preparar una craneotomía para la proyección de imagen estudios22. La modificación es que no hay ventana (portaobjeto) está instalada después de la craneotomía. En cambio, agentes proconvulsant (4-AP) se aplican tópicamente a la corteza expuesta para inducir acontecimientos ictales mientras el animal está bajo anestesia general. A nuestro conocimiento, nuestro grupo fue el primero en desarrollar este modelo de crisis cortical aguda en vivo en ratones16,23. El modelo de crisis cortical 4-AP aguda en vivo preparado a partir de ratones adultos fue desarrollado para complementar el modelo de corte en vitro del tejido juvenil. La replicación de los resultados en el modelo adulto en vivo ataque ayuda a generalizar los resultados de los modelos de la rebanada por atender las preocupaciones inherentes en cuanto a las condiciones no fisiológicas de un trozo de cerebro 2D (frente a un 3-d todo el cerebro estructura) y las diferencias fisiológicas entre juvenil y adulta del tejido.
El método de iniciación de evento ictal en la demanda se demuestra utilizando cualquiera de los dos soplos de neurotransmisores con estrategias de picospritzer o optogenetic. A lo mejor de nuestro conocimiento, nuestro grupo es el primero en iniciar acontecimientos ictales en tejido humano mediante neurotransmisores a través de un picospritzer16. Estrategias de optogenetic, la cepa de ratones C57BL/6 es la tensión convencional utilizada para la expresión de los transgenes. La expresión de channelrhodopsin-2 (ChR2) en interneuronas GABAérgicas o las células piramidales glutamatérgica proporcionará la capacidad opcional para generar acontecimientos ictal en demanda con pulsos breves de luz. Cepas de ratones de optogenetic conveniente incluyen la variante disponible en el mercado de C57BL/6 que expresa ChR2 en o interneuronas, utilizando el ratón vesicular GABA transporter promotor (VGAT)24, o las células piramidales, usando el antígeno de la célula de ratón timo 1 promotor (Thy1)25. Estos ratones VGAT ChR2 y Thy1-ChR2 comercialmente disponibles ofrecen la oportunidad de activar las neuronas GABAérgicas o neuronas glutamatérgica, respectivamente, en el neocortex con azul (470 nm) luz. La capacidad de generar eventos ictales en demanda en modelos de convulsiones agudas puede ofrecer oportunidades novela estudio convulsión iniciación dinámica y eficientemente evaluar potenciales terapias anticonvulsivas.
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Protocol
Todas las investigaciones con pacientes fue realizada bajo un protocolo aprobado por el Consejo Universitario salud red investigación ética conforme a la declaración de Helsinki. Procedimientos que involucran animales estaban de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense en el cuidado Animal y aprobaron por el Krembil Instituto Animal cuidado Comité de investigación.
1. el Protocolo I: aguda In vitro asimiento modelo
- Preparación de soluciones de disección y de líquido cefalorraquídeo artificial
- Agua ultrapura Carbogenate (que es el agua filtrada con una resistividad de 18,2 MΩ·cm) con carbogen (95% O25% CO2) durante 5 minutos usando aire difusores de burbuja de piedra (aireadores para acuarios).
Nota: Piedras del aire pueden conectarse el depósito carbogen regulador vía estándar tubo de silicona. Si no hay piedras de aire, cerrar el extremo de la tubería de silicona y meter pequeños agujeros en el sello para permitir que el gas de carbogen a burbujear hacia fuera y carbogenate la solución. - Preparar una solución de disección mediante la disolución de los solutos del cuadro 1 en agua ultrapura. Añadir CaCl2 a una solución que ha sido carbogenated por al menos 5 min ayudar a disolver.
Nota: Como alternativa, añadir CaCl2 en primer lugar, por lo que puede disolver fácilmente en una solución no saturada. La solución, en forma líquida, debe ser de 300-320 mOsm/L y tiene un pH de 7.4 después de estar saturada de carbogen.- Enfríe la solución de disección a 0 - 4 ° C. Dejar la solución en la nevera durante la noche o coloque la solución en el congelador durante 1 hora y controla continuamente la temperatura.
Nota: La solución de disección puede conservarse hasta 3 noches; descartar después. - Carbogenate la solución de disección de 5-10 minutos antes de su uso.
Nota: Idealmente, la solución debe aparecer ya sea como granizados o transición para aguanieve antes de su uso.
- Enfríe la solución de disección a 0 - 4 ° C. Dejar la solución en la nevera durante la noche o coloque la solución en el congelador durante 1 hora y controla continuamente la temperatura.
- Preparar roedor líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) mediante la disolución de los solutos de tabla 2 (o 3 tabla para humano ACSF) en agua ultrapura. Carbogenate la solución de la ACSF mientras está en un baño de agua calentado a 35 ° C hasta su uso. Añadir CaCl2 a una solución que ha sido carbogenated por al menos 5 min ayudar a disolver.
Nota: También puede añadir CaCl2 primero por lo que puede disolver más fácilmente en una solución no saturada. La solución, en forma líquida, debe ser de 290-320 mOsm/L y tiene un pH de 7.4 después de estar saturada de carbogen. Soluciones deben hacerse en volúmenes de 1, 2 ó 4 L dependiendo de la duración de los experimentos. Hacer 4 L para un día completo (8 h) de experimentos. La ACSF debe hacerse fresco cada día; no almacenar por más de 1 d.
- Agua ultrapura Carbogenate (que es el agua filtrada con una resistividad de 18,2 MΩ·cm) con carbogen (95% O25% CO2) durante 5 minutos usando aire difusores de burbuja de piedra (aireadores para acuarios).
- Disección de ratón para recoger el tejido fino del cerebro
Nota: Para el tejido humano, proceder al siguiente paso (paso 1.3) en hacer rebanadas de cerebro con el vibratome. Los bloques en forma de cubo (1 cm3) del tejido de cerebro deben obtenerse el neurocirujano con procedimientos previamente descritos26,27.- Recoger todas las herramientas y materiales necesarios para disecciones de animales. Configurar el espacio de trabajo para prepararse para disecciones de animales.
- Compruebe el depósito de carbogen (95 %O2/5%CO2) para asegurarse de que no está vacío. Sustituya el cilindro de gas antes de experimentos si hay menos de 500 psi de presión restante.
- Calibrar el vibratome (cortadora de tejido de lámina vibrante) según manual de instrucciones del fabricante. Ajustar el vibratome a tener una amplitud de corte de 1 mm y una velocidad de corte de 0.12 mm/s.
Nota: La configuración óptima puede ser diferente para cada individuo vibra tejido cuchilla; sin embargo, en general, la amplitud debe ser alta y la velocidad de corte debe ser baja. - Llene la cámara de incubación de rebanada del cerebro (es decir, el encargado de rebanada del cerebro) con ACSF y burbuja con carbogen. Luego coloque la cámara de incubación en baño de agua a 35 ° C.
Nota: Use roedor ACSF para rebanadas de cerebro de roedores y humano ACSF para rebanadas de cerebro humano.
- Obtener un ratón juvenil de ambos sexos, entre la edad de 13 d (p13) a 21 d (p21, donde p0 es la fecha de nacimiento).
- Anestesiar el ratón con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (55 mg/kg de peso corporal). Una vez que el ratón está profundamente anestesiado, como se indica por la ausencia del reflejo del pellizco del dedo del pie, inmediatamente utilice un instrumento veterinario aprobado guillotina para decapitar el ratón en un movimiento rápido.
Nota: Preparar la inyección de pentobarbital de sodio según los procedimientos recomendados por las directrices. - Sostenga la nariz de ratón para estabilizar la cabeza decapitada y suavemente haga una incisión de línea media a partir de entre los ojos del ratón y a lo largo de toda la longitud del cuero cabelludo para exponer el cráneo. Asegúrese de que el cráneo no es comprimido por la presión ejercida por la maquinilla de afeitar. Usar la esquina del filo de la navaja para aumentar la precisión de corte.
- Separados los colgajos de cuero cabelludo del ratón usando los dedos para exponer el cráneo. A continuación, utilice la nueva esquina del filo de la navaja para hacer una incisión a lo largo de la línea media del cráneo; prestar especial atención a evitar el contacto con la corteza cerebral.
- Insertar fórceps de la astilla en los zócalos del ojo de ratón para estabilizar la cabeza decapitada y coloque en un plato de Petri llenan de frío (0 - 4 ° C) solución de disección. Asegúrese de que la cabeza esté completamente sumergida en la solución de la disección.
- Utilice un segundo conjunto de fórceps de la astilla para despegar el cuero cabelludo del ratón suavemente, retirar el hueso de la nariz por lo pelado y retire la parte posterior (caudal lateral) del cráneo.
Nota: El hueso de la nariz de los ratones juveniles es muy suave y fácilmente rotos. - Micro espátula para cortar los nervios ópticos, nervios de trigeminal y médula espinal. A continuación, utilice la espátula micro suavemente separar el cerebro del cráneo. Deje el cerebro totalmente sumergido en el plato de Petri con solución de disección.
- Recoger todas las herramientas y materiales necesarios para disecciones de animales. Configurar el espacio de trabajo para prepararse para disecciones de animales.
- Preparación de láminas corticales de la corteza somáticosensorial-motor
- Llenar la bandeja de búfer de vibratome con aproximadamente 150 mL de frío (0 - 4° C) solución de disección.
Nota: Opcionalmente, mantener la bandeja de búfer en el congelador hasta que se necesite para mantener una temperatura baja durante el proceso de corte. - El pegamento del tejido de cerebro de ratón o de humano en el escenario de vibratome (bandeja de muestra) con pegamento adhesivo instantáneo. Para los ratones, corte una pequeña porción caudal del cerebro (es decir, el cerebelo) que pueden ser fácilmente pegado plana sobre el soporte de muestras (que permite la parte rostral del cerebro hacia el techo).
Nota: Como alternativa, rodajas de cerebro de ratón horizontal pueden ser preparados por pegar el lado dorsal del cerebro sobre el soporte de la muestra (el lado ventral del cerebro debe mirar el techo)28. - Coloque suavemente el soporte de muestras (con tejido cerebral) en la bandeja del almacenador intermediario. Asegúrese de que la porción dorsal del cerebro es hoja de vibratome.
Nota: Es crítico para reducir al mínimo la cantidad de tiempo que el cerebro es expuesto al aire.
- Llenar la bandeja de búfer de vibratome con aproximadamente 150 mL de frío (0 - 4° C) solución de disección.
- Secciones de tejido de cerebro y colección
- Cortar el cerebro en 450 μm trozos gruesos en la dorsal hacia ventral el vibratome. Asegúrese de que el cerebro sigue siendo completamente anclado a la bandeja de la muestra mientras que la lo corte.
- Hacer el primer corte en el cerebro de ratón para quitar el bulbo olfatorio. Luego, realizar los cortes sucesivos hasta que se observe el área somatosensorial-motor (situado aproximadamente a medio camino entre el bulbo olfatorio y el vértice).
Nota: Opcionalmente, cortar el cerebro en cortes más delgados (200 μm) hasta que el cuerpo calloso aparece en la vista coronal del cerebro, que indica que el área somatosensorial motor es estrecha.
- Hacer el primer corte en el cerebro de ratón para quitar el bulbo olfatorio. Luego, realizar los cortes sucesivos hasta que se observe el área somatosensorial-motor (situado aproximadamente a medio camino entre el bulbo olfatorio y el vértice).
- Usar una pipeta de ancha para recoger cortes coronales (450 μm) que contienen el área somatosensorial motor y sumergen en una placa Petri que contiene el frío (0 - 4 ° C) solución de disección.
- Utilice una cuchilla nueva y corte cualquier exceso de tejido de las rebanadas. Para rebanadas coronales de los ratones, realizar un corte justo debajo de la comisura neocortical (es decir, cuerpo calloso) transversal. No corte con un movimiento de Sierra; simplemente aplique presión sobre la hoja en el tejido y use un cepillo que para separar suavemente el tejido. Asegúrese de que reducir al mínimo el movimiento del segmento coronal.
- Uso una pipeta ancha para transferir la porción dorsal de las rebanadas coronales que contienen el neocortex (capa 1-6) para un segundo plato de Petri lleno de caliente (35 ° C) ACSF por un momento (~ 1 s). Entonces, puntualmente traslado las rebanadas a una cámara de incubación con carbogenated caliente (35 ° C) ACSF.
Nota: El propósito de la transferencia en la caja Petri con ACSF es reducir al mínimo a la transferencia de solución de disección a la cámara de incubación durante la transferencia de rebanadas de cerebro con la pipeta de ancha. Utilizar la cámara de incubación varios pozos para mantener sectores diferentes del cerebro organizados. - Desechar el resto del cerebro y el animal en canal según las directrices institucionales.
- Cortar el cerebro en 450 μm trozos gruesos en la dorsal hacia ventral el vibratome. Asegúrese de que el cerebro sigue siendo completamente anclado a la bandeja de la muestra mientras que la lo corte.
- Incubación y mantenimiento
- Deje las rebanadas de cerebro ligeramente sumergidas en la cámara de incubación a 35 ° C durante 30 minutos. Luego, extraiga la cámara de incubación de la bañera de agua y permita que regrese a temperatura ambiente (20-25 ° C). Esperar 1 h para las rebanadas de cerebro para recuperarse antes de realizar las grabaciones electrofisiológicas.
Nota: Asegúrese de que no hay burbujas de aire que se acumulan debajo de las rebanadas de cerebro en la cámara de incubación. Burbujas de aire son interfaces de aire que provocan daño tisular. Las rebanadas de cerebro de ratón se pueden mantener durante 6-8 h, mientras que el tejido de cerebro humano puede almacenar hasta 24 h en una cámara de incubación bien carbogenated con la ACSF apropiado.
- Deje las rebanadas de cerebro ligeramente sumergidas en la cámara de incubación a 35 ° C durante 30 minutos. Luego, extraiga la cámara de incubación de la bañera de agua y permita que regrese a temperatura ambiente (20-25 ° C). Esperar 1 h para las rebanadas de cerebro para recuperarse antes de realizar las grabaciones electrofisiológicas.
- Grabaciones electrofisiológicas de la capa cortical superficial
Nota: Eventos Ictal se observan en las grabaciones de (LFP) potenciales de campo local extracelular de rebanadas cerebrales. La LFP de la rebanada del cerebro puede observarse y registrarse con una interfaz tipo cámara29 o un sistema de matriz multi-electrodo sumergida (MEA)16. El procedimiento ha sido descrito previamente16 y detalles adicionales se describen a continuación.- Utilice una pipeta de transferencia ancha o un cepillo que para mover un trozo de cerebro en papel de lente corta un poco más grande que se lleva a cabo utilizando una pinza dental. Transferir el papel de la lente (que descansa sobre la rebanada del cerebro) a la cámara de grabación y asegúrela en posición con una pantalla de arpa.
- Funcionamiento caliente (35 ° C), carbogenated ACSF solución a través de la cámara de grabación sobre la rebanada del cerebro a una velocidad de 3 mL/min (~ 1 goteo/s). Uso de un termómetro digital para que la sala de grabación es de 33-36° C.
- Tire de electrodos de cristal con una impedancia de 1-3 MΩ de tubos de vidrio borosilicato (con un diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un tirador. Rellenar los electrodos de vidrio con ACSF (~ 10 μl) utilizando una jeringa Hamilton. Deseche de inmediato el electrodo si la punta está dañada.
Nota: Bleach el alambre de plata (5 min) y permitir sólo una porción mínima (es decir, la punta) de alambre de plata para sumergirse en los electrodos de vidrio rellenada ACSF para minimizar el ruido y la deriva durante las grabaciones. Quite cualquier exceso ACSF desde el electrodo de vidrio con una jeringa Hamilton si es necesario. - Uso un microscopio estéreo de 20 X con precisión la guía del grabación de electrodo de vidrio en el superficial cortical de la capa (2/3) utilizando manipuladores manual. Registro/ver la actividad eléctrica de la rebanada del cerebro en un ordenador con software estándar.
Nota: Rebanadas de cerebro (alta calidad) Viable exhibirá un sólido potencial evocado en respuesta a los estímulos eléctricos aplicados (100 μs, 30-300 μA) o pulsos ligeros (30 ms, 10 mW/mm2) para el tejido de optogenetic.
- Inducción de asimiento-como actividades
- Perfusión ACSF conteniendo 100 μm 4-Aminopirimidina (4-AP) sobre la rebanada del cerebro. Disolver 80 mg de 4-AP en 8,5 mL de agua para hacer una solución madre de 100 mM 4-AP. Añadir 100 μl de solución stock de 100 mM 4-AP a 100 mL de ACSF para lograr una solución ACSF con 100 μm 4-AP.
Nota: Alternativamente, utilizar cero Mg2 + ACSF (tabla 4), una solución ACSF modificada que contiene ningún añadido Mg2 +, para inundar la rebanada del cerebro. Para el tejido humano, utilice una combinación de 100 μm 4-AP en cero-Mg2 + ACSF humano (tabla 5) para lograr resultados óptimos. El tiempo medio para acontecimientos ictales que aparezca está a 15 minutos; sin embargo, puede tomar hasta 40 minutos para algunas rebanadas de cerebro.
- Perfusión ACSF conteniendo 100 μm 4-Aminopirimidina (4-AP) sobre la rebanada del cerebro. Disolver 80 mg de 4-AP en 8,5 mL de agua para hacer una solución madre de 100 mM 4-AP. Añadir 100 μl de solución stock de 100 mM 4-AP a 100 mL de ACSF para lograr una solución ACSF con 100 μm 4-AP.
- Generación de pay-per-crisis: una estrategia de optogenetic para optogenetic ratones
- Aplicar un pulso breve (30 ms) de color azul (470 nm) luz (con una intensidad de salida mínimo de 1 mW/mm2 ) para iniciar un evento ictal. Utilice un manipulador manual para colocar una 1.000 μm núcleo diámetro de fibra óptica (0.39 NA) directamente sobre la región de grabación.
Nota: Establezca la velocidad de la foto estimulación para que coincida con la tasa deseada de la ocurrencia del evento ictal (es decir, 1 pulso cada 50 s). Sin embargo, la tasa no demasiado exagerada de la tasa intrínseca en la que se producen acontecimientos ictales.
- Aplicar un pulso breve (30 ms) de color azul (470 nm) luz (con una intensidad de salida mínimo de 1 mW/mm2 ) para iniciar un evento ictal. Utilice un manipulador manual para colocar una 1.000 μm núcleo diámetro de fibra óptica (0.39 NA) directamente sobre la región de grabación.
- Generación de pay-per-crisis: una estrategia de no optogenetic para el tejido humano
- Coloque la rebanada del cerebro de manera que las capas superficiales son aguas arriba, y las capas profundas aguas abajo para el flujo de la solución a través de la cámara de grabación.
- Tire de un electrodo de vidrio (el mismo tipo que el utilizado para las grabaciones de la LFP) y toque suavemente su extremo con un limpiador de la delicada tarea para crear una pequeña abertura. Rellene el electrodo con ~ 25 μl de 100 mM GABA (disuelto en agua) y fíjelo a la picospritzer. O bien, rellene el electrodo con el glutamato 200 μm (disuelto en agua).
Nota: Para estimar el volumen ser inflado de picospritzer (~ 50 μL), aplica un soplo de prueba sobre una placa de plástico (preferentemente cuadriculada). Luego, aplicar una gota de volumen conocido (por ejemplo,10 μl, 20 μl, 50 μl y 100 μL) con una pipeta para una comparación con el soplo de la prueba. - Soplos del neurotransmisor (GABA o glutamato) se aplican en el tejido humano con un picospritzer (10-20 psi durante ms de 30-100) para iniciar un evento ictal. Aplicar un solo soplo de 100 mM GABA en la capa profunda (5) del tejido del cerebro para generar acontecimientos ictales en la capa superficial (2/3). Como alternativa, aplicar un solo soplo de 200 μm glutamato directamente en la capa superficial para generar acontecimientos ictales en la capa superficial.
Nota: Establezca la velocidad de la picospritzer puff para que coincida con la tasa deseada de la ocurrencia del evento ictal (es decir, 1 pulso cada 50 s). Sin embargo, la tasa no demasiado exagerada de la tasa intrínseca en la que se producen acontecimientos ictales.
2. Protocolo II: Aguda In vivo modelo del asimiento
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Preparación quirúrgica y cirugía
- Obtener un ratón adulto (p35 - p60) de ambos sexos.
- Profundamente anestesiar con ketamina (95 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) del ratón. Realice la prueba de refleja del dedo del pie-pinch para asegurar que el ratón está sedado. Como alternativa, utilizar isoflurano (4% para la inducción, de 1.5-2% para la cirugía) para anestesiar el ratón.
Nota: La elección de los anestésicos puede afectar la actividad de asimiento30,31. - Monte el ratón dentro de un marco estereotáxicas colocándole la cabeza con barras de oído. Coloque una almohadilla caliente debajo del ratón para la duración de la cirugía.
- Cepille la parte superior de la cabeza del ratón usando roedor trimmer para exponer el cuero cabelludo. Inyectar 0,3 mL de lidocaína con un 25 5/8 aguja el periostio para evitar sangrado excesivo o dolor. Aplicar ungüento oftálmico en ojos del ratón para evitar que se sequen durante el experimento.
- Apriete y levante el centro del cuero cabelludo de ratón para evaluar si sus reflejos han desaparecido. Posteriormente, realizar un corte para dejar al descubierto el bregma a región de lambda del cráneo horizontal. Raspar suavemente toda la zona expuesta de cráneo con un hisopo de algodón para crear una superficie seca.
- Realizar una craneotomía de 4 mm de diámetro en coordenadas 2.0mm rostrocaudal lateromedial y-2,00 mm para exponer la corteza somatosensorial. Marque la ubicación con un círculo (4 mm de diámetro) con un marcador permanente. Taladro alrededor del círculo con un taladro dental neumático hasta la capa restante del hueso craneotomía cede fácilmente cuando empuja hacia abajo. Aplique solución salina en la capa de hueso antes de retirar la craneotomía con fórceps de la astilla. Posteriormente, aplique solución salina tibia a la región expuesta.
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Métodos de grabación y la inducción química de convulsiones
- Tire de electrodos de cristal con una impedancia de 1-3 MΩ de tubos de vidrio borosilicato (con un diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un tirador. Rellene la jeringuilla de los electrodos de vidrio con ~ 10 μl de la ACSF o solución salina con un Hamilton. Deseche de inmediato el electrodo si la punta está dañada.
Nota: Bleach el alambre de plata (5 min) y permitir sólo una porción mínima (es decir, la punta) de alambre de plata para sumergirse en los electrodos de vidrio rellenada ACSF para minimizar el ruido y la deriva durante las grabaciones. Quite cualquier exceso ACSF desde el electrodo de vidrio con una jeringa Hamilton si es necesario. - Utilizar un manipulador manual para guiar el electrodo de vidrio en el superficial cortical (2/3) de la capa en el área somatosensorial-motor. Registro/ver la actividad eléctrica de la rebanada del cerebro en un ordenador con software estándar.
Nota: Capa 2/3 es aproximadamente 0,3 mm de profundidad de la superficie32. - Aplicar tópicamente ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP solución salina en la corteza expuesta del ratón con una jeringa hasta que cubra completamente la craneotomía. Disolver 14 mg de 4-AP en 100 mL de solución salina isotónica para hacer una solución stock de solución salina 4-AP 1, 5 mM.
Nota: Preparar la solución salina 4-AP antes de que comience el experimento. En promedio, los eventos ictales aparecen 15-30 min después de aplicación tópica.
- Tire de electrodos de cristal con una impedancia de 1-3 MΩ de tubos de vidrio borosilicato (con un diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un tirador. Rellene la jeringuilla de los electrodos de vidrio con ~ 10 μl de la ACSF o solución salina con un Hamilton. Deseche de inmediato el electrodo si la punta está dañada.
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Generación de demanda de las convulsiones en los ratones optogenetic
- Aplicar un pulso breve (30 ms) de color azul (470 nm) luz (con una intensidad de salida mínimo de 10 mW/mm2 ) para iniciar un evento ictal. Utilice un manipulador manual para colocar una 1.000 μm núcleo diámetro de fibra óptica (0.39 NA) directamente sobre la región de grabación.
Nota: Establezca la velocidad de la foto estimulación para que coincida con la tasa deseada de la ocurrencia del evento ictal (es decir, 1 pulso cada 300 s). Sin embargo, la tasa no demasiado exagerada de la tasa intrínseca en la que se producen acontecimientos ictales.
- Aplicar un pulso breve (30 ms) de color azul (470 nm) luz (con una intensidad de salida mínimo de 10 mW/mm2 ) para iniciar un evento ictal. Utilice un manipulador manual para colocar una 1.000 μm núcleo diámetro de fibra óptica (0.39 NA) directamente sobre la región de grabación.
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Representative Results
La aplicación de 100 μm 4-AP a rebanadas de cerebro cortical μm tamaño 450 (intacto) buena calidad de un juvenil VGAT ChR2 ratón inducido confiablemente ictal eventos recurrentes (> 5 s) dentro de 15 min (figura 1Ai). La aplicación de 100 μm 4-AP a rebanadas de mala calidad producido explosión eventos o clavar actividad (figura 1Aii). En promedio, 40% de las láminas de cada cerebro de ratón disecado había generado con éxito acontecimientos ictales. Por otra parte, 83% (25/30) de los ratones disecados resultó en la rebanada de por lo menos un cerebro que generó con éxito acontecimientos ictales. En rebanadas de cerebro con que se producen espontáneamente acontecimientos ictales, la aplicación de un pulso de luz breve 30 ms en el segmento de cerebro confiablemente activa un evento ictal que era idéntico en la morfología (figura 1Aiii y 1Aiv). Los mismos resultados fueron hechos en rebanadas de cerebro de ratones Thy1-ChR2 (figura 1B). Así, independientemente de que neuronal-subpoblación fue activado, cualquier breve sincronizar evento aislado red neuronal cortical condujo a la aparición de un evento ictal. Estos acontecimientos ictales fueron abarcados de un centinela (preictal) Espiga (figura 2Aii y 2Bii), tónico-como leña (figura 2Aiii y 2Biii) clónica como leña (figura 2Aiv y 2Biv) y explosión de actividad hacia el final (figura 2Av y 2Bv); fueron similares en naturaleza a las electrográficas firmas asociadas con asimientos clínicos33. Además, estos ratones juveniles eran fisiológicamente adulto-como como la adición de 10 μm de la bumetanida (BUM), un bloqueador de NKCC1, no tuvo ningún efecto sobre los acontecimientos ictales resultantes (figura 2).
El en vitro segmento cortical 4-AP confiablemente generó modelo eventos ictales constantes para ~ 1 h (figura 1Ai), mientras que el modelo2 + cero Mg típicamente genera acontecimientos ictales durante aproximadamente 10 minutos antes de transformar rápidamente (explosión-como actividad Figura 3A). Sin embargo, si un método no-4-AP de la inducción de convulsiones se requiere, el modelo2 + cero Mg puede modificarse con la adición de 5-10 μm baclofeno (un agonista de los receptores GABAB ) para transformar la actividad estalla en acontecimientos ictales (figura 3B) . En general, los métodos de no-desinhibición para aumentar la excitabilidad (es decir, 4-AP o cero-Mg2 + ACSF) confiablemente reproducen acontecimientos ictales en rebanadas de cerebro cortical. En contraste, métodos de desinhibición [es decir, bicuculina (IMC), un antagonista de los receptores GABAA ] dado lugar a clavar actividad de actividad interictal o estallido de actividad, en lugar de acontecimientos ictales (Figura 4A). Del mismo modo, generaron modelos de convulsión aguda preparados a partir de 100 μm 4-AP-tratados hippocampal rebanadas interictal spiking actividad o estado epiléptico-como las condiciones en el CA3 (Figura 4B). En vivo 4-AP cortical modelo correspondientemente genera eventos ictales recurrentes (> 5 s). Acontecimientos ictales se observaron en el superficial (2/3) de la capa dentro de ~ 30 min de la aplicación tópica 1.5 mM 4-AP en la corteza expuesta de ratones adultos VGAT ChR2. La aplicación de un pulso de luz de 30 ms breve en la corteza expuesta confiablemente desencadenó acontecimientos ictales que son morfológicamente similares a los que espontáneamente ocurre (figura 5).
La aplicación de cero Mg2 + ACSF humana con 100 μm 4-AP a rebanadas de cerebro cortical 'no epilépticos' (450 μm) de pacientes con epilepsia del lóbulo temporal genera confiablemente eventos ictales recurrentes (> 5 s) dentro de ~ 30 minutos (figura 6Ai y 6Bi). Rebanadas de mala calidad generan actividad clavaba o no actividad (figura 1Aii). La viabilidad de las rebanadas de cerebro consideró 'buena calidad' cuando un breve estímulo eléctrico (100 μs, 30-300 μA) indujo una respuesta robusta, evocada en la LFP en el inicio del experimento. Una vez que acontecimientos ictales comenzaron a precipitar, la aplicación de un breve soplo (ms de 75 a 20 psi) de 100 mM GABA sobre la rebanada del cerebro confiablemente desencadenó acontecimientos ictales que eran idénticos en morfología a los que se producen espontáneamente (figura 6Aii y 6Aiii) . Una menor concentración de GABA, 100-200 μm, probablemente sea eficaz, así como para en vitro experimentos34; sin embargo, una mayor concentración de GABA, 100 mM, se recomienda en vivo experimentos35. Las mismas observaciones se reprodujeron cuando se aplicó un breve soplo de 200 μm glutamato a rebanadas de cerebro humano (figura 6Bii y 6Biii). Por lo tanto, independientemente de que los receptores postsinápticos se activaron, un breve evento de sincronización en la red neuronal cortical humano aislado confiablemente activa un evento ictal.
Figura 1: Agudo en vitro modelo 4-AP convulsiones corticales. Las líneas negras representan el campo local potencial (LFP) grabación; las líneas azules representan el estímulo luz. (A) estos paneles se basan en los resultados de un modelo de ratón VGAT ChR2. Ilustran acontecimientos ictales en la grabación de la LFP de la capa superficial (2/3) de una tajada de cerebro cortical alta calidad tratado con 100 μm 4-AP. ) este panel muestra un resumen de la grabación de la LFP. ii) son ejemplos de la LFP de rebanadas del cerebro de la mala calidad de grabación. La barra de escala vertical es de 0.4 mV, la barra de la escala horizontal es 20 s. iii) esta es una vista ampliada de un evento ictal activados por luz. iv) esta es una vista ampliada de un evento ictal espontánea. (B) panel de estos se basa en los resultados de un modelo de ratón Thy1-ChR2. Ilustran acontecimientos ictales en la grabación de la LFP de la capa superficial (2/3) de una porción cortical cerebral tratados con 100 μm 4-AP. ) este panel muestra un resumen de la grabación de la LFP. ii) esta es una vista ampliada de un evento ictal activados por luz. iii) esta es una vista ampliada de un evento ictal espontánea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ictal eventos generaban en un trozo de cerebro (capa 2/3) de un juvenil (p13) ratón VGAT ChR2 inundado con la 4-AP y bumetanida (BUM). Las líneas negras representan el campo local potencial (LFP) grabación; las líneas azules representan el estímulo luz. (A) estos paneles muestran un espontáneo evento ictal. yo) este panel muestra un resumen de todo el evento ictal. Los siguientes paneles muestran ii) un punto de centinela, iii) tónico-como leña, iv) clónica como leña y v) estallido de actividad. (B) estos paneles muestran un evento ictal activados por luz. yo) este panel muestra un resumen de todo el evento ictal. Los siguientes paneles muestran ii) un punto de luz activa centinela desde el mismo segmento de grabación, iii) tónico-como leña, iv) clónica como leña y v) estallido de actividad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aguda en vitro cero Mg2 + cortical asimiento modelo. Las líneas negras representan el campo local potencial (LFP) grabación; las líneas azules representan el estímulo luz. (A) Estos paneles se basan en los resultados de un modelo de ratón VGAT ChR2. yo) este panel muestra el estado epiléptico condiciones similares a las observadas en la grabación de la LFP de la capa superficial (2/3) de una porción cortical cerebral tratados con cero Mg2 + ACSF. ii) esta es una vista ampliada de un evento ictal activados por luz. iii) esta es una vista ampliada de la actividad estalla status epiléptico-como. (B) estos paneles muestran el mismo segmento de grabación con la adición de baclofen. ) la aplicación de 5 μm baclofen a cero-Mg2 + ACSF transforma la actividad estalla en distintos eventos recurrentes ictales. ii) esta es una vista ampliada de la actividad de ruptura. iii) esta es una vista ampliada del evento ictal distinto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aguda en vitro estallido/clavar modelos. Las líneas negras representan el campo local potencial (LFP) grabación; las líneas azules representan el estímulo luz. (A) estos paneles muestran los resultados de una porción cortical de un VGAT-ChR2mouse, que ilustra la actividad explosión observada en lo superficial de la capa (2/3) después de la adición de IMC de 10 μm a 100 μm 4AP. yo) este es un resumen de la grabación de la LFP. La línea roja punteada indica el IMC cuando entró en vigor. ii) esta es una vista ampliada de un evento ictal activados por luz. iii) esta es una vista ampliada de la actividad espontánea de la ruptura. (B) estos paneles muestran los resultados de una rebanada del hipocampo de un ratón VGAT ChR2, ilustrando un evento de estado epiléptico-como observado en la zona de CA3 tras la aplicación de 100 μm 4AP. i) este es un resumen de la grabación de la LFP. ii) esta es una vista ampliada de un evento ictal. iii) esta es una vista ampliada de luz activa y espontánea explosión de eventos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aguda en vivo modelo 4-AP convulsiones corticales. Las líneas negras representan el campo local potencial (LFP) grabación; las líneas azules representan el estímulo luz. (A) estos paneles muestran los resultados de un adulto (p56) VGAT ChR2 modelo de ratón con 1.5 mM 4-AP de aplicación tópica a la corteza expuesta. yo) este panel muestra un evento ictal activadas por luz observado en la capa superficial (2/3) de la zona somatosensorial-motor. ii) esta es una vista ampliada del evento ictal activadas por la luz del panel Ai. iii) este es un super zoom en vista del inicio del evento ictal activados por luz (indicado por la flecha negra). Esta figura es la versión sin filtrar de una figura de Chang et al. 16. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Aguda en vitro modelo asimiento cortical humana. Las líneas negras representan el campo local potencial (LFP) grabación; las líneas marrones representan el soplo picospritzer. (A) estos paneles muestran los resultados de un segmento cortical cerebral de un paciente de epilepsia (MTLE) lóbulo temporal medial, ilustrando los acontecimientos ictales en lo superficial de la capa (2/3) tras una perfusión con 100 μm 4-AP y cero Mg2 + ACSF humana . yo) este es un resumen de la grabación de la LFP. Los siguientes paneles muestran ii) una vista ampliada de un 100 mM GABA puff-eventos desencadenados por el ictal y iii) una vista ampliada de un evento ictal espontánea. (B) estos paneles muestran los resultados de un segmento cortical cerebral de otro paciente MTLE, ilustrando los acontecimientos ictales en lo superficial de la capa (2/3) tras una perfusión con 100 μm 4-AP y cero Mg2 + humano ACSF. yo) este es un resumen de la grabación de la LFP. Los siguientes paneles muestran ii) una vista ampliada de una 200 eventos desencadenados por el soplo ictal glutamato μm y iii) una vista ampliada de un evento ictal espontánea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: receta para la solución de disección. Estas son instrucciones para hacer volúmenes de 1 L o 2 L. MW = peso molecular del soluto.
| # | Reactivo de | Concentrado [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | Sacarosa | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4,37 |
| 3 | Dextrosa (d-glucosa) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Fosfato de sodio monobásico monohidrato (H2NaPO4· H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
Tabla 2: receta para roedor artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF). Estas son instrucciones para hacer volúmenes de 2 L o 4 L. MW = peso molecular del soluto.
| # | Reactivo de | Concentrado [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro de sodio (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4,37 | 8.74 |
| 3 | Dextrosa (d-glucosa) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4· H2O) | 1.3 | 246.47 | 0,64 | 1.28 |
| 6 | Fosfato de sodio monobásico monohidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
Tabla 3: receta de espinal cerebral artificial humano líquido (humano ACSF). Estas son instrucciones para hacer volúmenes de 2 L o 4 L. MW = peso molecular del soluto.
| # | Reactivo de | Concentrado [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro de sodio (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.38 | 28.75 |
| 2 | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 25.2 | 84.01 | 4.23 | 8.46 |
| 3 | Dextrosa (d-glucosa) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4· H2O) | 1 | 246.47 | 0.49 | 0.99 |
| 6 | Fosfato de sodio monobásico monohidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.29 | 0,59 |
Tabla 4: receta para el magnesio de cero 2 + roedor líquido cefalorraquídeo artificial (cero Mg2 + ACSF). Estas son instrucciones para hacer volúmenes de 2 L o 4 L. MW = peso molecular del soluto.
| # | Reactivo de | Concentrado [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro de sodio (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4,37 | 8.74 |
| 3 | Dextrosa (d-glucosa) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4· H2O) | Nominalmente libre | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Fosfato de sodio monobásico monohidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0,59 |
Tabla 5: receta para el magnesio de cero 2 + el líquido espinal cerebral artificial humano (cero Mg2 + humano ACSF). Estas son instrucciones para hacer 2 L o 4 L volúmenes; MW = peso molecular del soluto.
| # | Reactivo de | Concentrado [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro de sodio (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.38 | 28.75 |
| 2 | Bicarbonato de sodio (NaHCO2) | 25.2 | 84.01 | 4.23 | 8.46 |
| 3 | Dextrosa (d-glucosa) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Cloruro de potasio (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Sulfato de magnesio (MgSO4· H2O) | Nominalmente libre | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Fosfato de sodio monobásico monohidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Cloruro de calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.29 | 0,59 |
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Discussion
Las rebanadas del cerebro se tratan con un medicamento proconvulsant o una solución ACSF alterado para aumentar la excitabilidad de la red neuronal y promover una precipitación de acontecimientos ictales (electrográficas asimiento-como acontecimientos). Para los ratones, deben contener las rebanadas coronales preferidas del área somatosensorial-motor de la corteza del cíngulo, área 2 (CG), pero no el área de retrosplenial (RS); Estos marcadores anatómicos ayudan a identificar la gama de rebanadas coronales que son los mejores para la inducción de eventos ictales. Una modificación opcional para el tejido de los ratones es cortar los dos hemisferios de la rebanada del cerebro por la mitad para diseños experimentales par emparejado, como los dos hemisferios son prácticamente idénticas (unidades experimentales similares). Cuando prepare rebanadas de cerebro para generar acontecimientos ictales, es imprescindible para mantener la integridad de las redes neuronales y sus conexiones sinápticas, porque acontecimientos ictales son un fenómeno de la red neuronal. Tres puntos en el paso 1 del protocolo que son críticos para la calidad de la rebanada 1) el corte procedimiento 2) incubación y están 3) oxigenación. En primer lugar, el procedimiento de corte requiere un equilibrio entre velocidad y técnica. Es crucial minimizar el tiempo entre la decapitación (o resección quirúrgica) y la incubación, mientras que también teniendo cuidado con cada contacto y movimiento de la rebanada del cerebro para evitar daños. En segundo lugar, la calidad del tejido es muy sensible a la temperatura de incubación y duración. Es importante utilizar un reloj y termómetro para la incubación es a 35 ° C durante 30 minutos en tercer lugar, que la viabilidad del tejido cerebral es sensible a la exposición a cualquier cosa que no sea oxigenado líquido cefalorraquídeo (artificial). La rebanada del cerebro caducará si no se perfunde con carbogenated ACSF durante un período prolongado (~ 1 min).
Rebanadas de cerebro de ratones de edad p13 - p16 ofrecen la más alta probabilidad de generar con éxito acontecimientos ictales. La razón es que ratones ≤ p16 no requieren una perfusión de transcardial antes de disecciones. Esto efectivamente reduce la posibilidad de errores y acelera el proceso de disección, que es un enorme beneficio, porque la cantidad de tiempo entre la decapitación y la incubación se correlaciona inversamente con la viabilidad de la división del cerebro. Mientras tanto, ratones > p13 con cantidades reducidas de NKCC1 que son comparables a un adulto de36. En general, menores (< p21) el tejido es más viable que el tejido adulto debido a una excepcional capacidad para recuperarse del perjudicial procedimiento corte. Esta ventana de semana entre p13 y p21 ofrece la oportunidad de explotar los ratones fisiología del adulto y juvenil-como capacidad de generar fácilmente acontecimientos ictal37,38. Sin embargo, si los experimentos requieren estudiar acontecimientos ictales en rebanadas de cerebro de ratones adultos, un ACSF NMDG basado con HEPES, tiourea y ascorbato ayudará a promover la viabilidad del tejido adulto24,39,40, 41. para el tejido humano, la adición de antioxidantes como α-tocoferol, a la solución de disección puede beneficiar la viabilidad del tejido, especialmente durante el transporte interurbano (> 30 minutos) entre el quirófano y el laboratorio de corte8,26. Para todos los sectores de cerebro, las condiciones favorables para generar acontecimientos ictales son grabar en rodajas gruesas de 450 μm a 36 ° C. Rebanadas de cerebro necesitan ser por lo menos 350 μm de espesor que contienen suficientes neuronas en la red neuronal para generar el evento ictal estructurado. Sin embargo, sectores no pueden ser más gruesos que 500 μm, ya que resultará difícil para el oxígeno que se difunden en el centro del tejido. Sectores que son 450 μm representan un espesor óptimo, donde se mantiene una cantidad abundante de conectividad de la red neuronal sin obstaculizar la perfusión de oxígeno a lo largo del tejido. Por último, la precipitación de acontecimientos ictales es óptima a 33-36 ° C; Si la cámara de grabación no está por lo menos 33 ° C, será difícil para los acontecimientos ictales que se produzca.
Una limitación del modelo convulsión aguda es que no se producen convulsiones. Sólo generan acontecimientos ictales, que son la firma electrográfica de una convulsión. Acontecimientos ictales no tienen ninguna componentes conductuales asociados, tales como la pérdida de conciencia o convulsiones motor que definen una convulsión. Por lo tanto, modelos de convulsión aguda no se puede utilizar para confirmar la eficacia de los posibles candidatos de medicamentos anticonvulsivos o ganar penetraciones en epileptogenesis; estas preguntas de investigación deberían abordarse mediante modelos de epilepsia crónica y ensayos clínicos. Modelos de convulsión aguda se deben usarse sólo para su propósito de realizar estudios preliminares fundamentales en mecanismos de incautación. Sólo los resultados más prometedores de los modelos de la convulsión aguda deben avanzados hacia modelos mayores que son más costoso, laborioso de preparar y requiere consideraciones éticas mucho más complejas.
Para avanzar en la investigación de la epilepsia y convulsiones, es imprescindible tener un modelo confiable de convulsión aguda que puede replicar exactamente la actividad de asimiento electrográfica observada clínicamente en el EEG de pacientes asimiento. Confiablemente reproducir acontecimientos ictales en rebanadas de cerebro, desinhibición no métodos de aumentar la excitabilidad se requieren, mientras que los métodos de desinhibición (es decir, el antagonista de los receptores GABAA IMC) suelen resultan en clavar actividad recuerda la actividad interictal, en lugar de acontecimientos ictales (Figura 3A). El método preferido de desinhibición no es aplicar el agente proconvulsant 4-AP porque puede generar confiablemente eventos ictales constantes durante 1 hora. En cambio, el modelo cortical cero Mg2 + genera acontecimientos ictales de sólo ~ 10 min antes de transformar rápidamente en ráfaga-como actividad (figura 2A). Si utiliza el modelo2 + cero Mg, la adición de 5-10 μm baclofen, un agonista del receptor de GABAB , ayudarán a transformar la actividad estalla en acontecimientos ictales (figura 2B), según lo demostrado previamente en rebanadas hippocampal42. Por otra parte, el modelo de ataque 4-AP en vitro es preferido, porque los resultados de ese modelo pueden ser replicados en su contraparte en vivo , en vivo 4-AP convulsiones corticales modelo (figura 4). No es factible modificar el todo líquido espinal cerebral de un ratón adulto vivo para recrear el agudo en vivo cero Mg2 + medio ambiente.
La aplicación de la 4-AP en rebanadas de cerebro cortical puede reproducir con precisión la actividad de asimiento clínico observada15,33. En cambio, tratados con AP de 4 rebanadas hippocampal están predispuestos a generar interictal como clavaba43 y status epiléptico-como condiciones de actividad (figura 3B). Así, a los efectos de estudiar las convulsiones, el agudo en vitro 4-AP cortical modelo es preferido sobre el vitro 4-AP hippocampal modelo. Además, no hay prácticamente ninguna oportunidad para grabar en rebanadas de hipocampales humanos viables, como resecciones hipocampales más el CA1 y CA3 dañado21. En contraste, el tejido cortical humano no patológico es más accesible, ya es el resultado secundario de procedimientos neuroquirúrgicos subcorticales como la cirugía de la epilepsia del lóbulo temporal. Tejido neocortical no epilépticos 'control' también puede ser adquirido de cirugías de resección de tumor. Por estas razones, la corteza es el sitio preferido para el modelado de la actividad de asimiento debido a su facilidad de transporte entre el ratón y tejido humano para confirmar la relevancia clínica. Finalmente, la cepa C57BL/6 de los ratones es preferida porque fácilmente expresan los transgenes, y optogenetic las variantes son disponibles en el mercado. Optogenetic modelos de ratones permiten la iniciación de la demanda de acontecimientos ictal mediante un estímulo de luz breve, mínimamente invasivo. Esto hace que el estudio de convulsiones increíblemente eficiente eliminando tiempos de espera y permitiendo la activación específica de subpoblaciones neuronales. Además, la capacidad de desencadenar convulsiones bajo demanda permite nuevas formas de delimitar definitivamente el punto exacto de inicio de convulsión y potencialmente estudiar la efectividad de medicamentos contra las convulsiones. Un programa fácil de usar basada en MATLAB se desarrolló específicamente para detectar y clasificar los distintos tipos de eventos epileptiformes que se producen en los modelos de ataque 4-AP in vitro e in vivo. Este programa de detección está disponible para descargar desde el repositorio de GitHub del laboratorio Valiante (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de investigación de salud (MOP 119603 Taufik A. Valiante y Peter L. Carlen), el Instituto del cerebro de Ontario (a Taufik A. Valiante) y la beca de investigación del estudiante de Mightex (a Michael Chang). Nos gustaría dar las gracias a Liam Long para su ayuda en la película el manuscrito video. Nos gustaría reconocer Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran y Shadini Dematagoda por su ayuda en la recopilación de las figuras y tablas en este manuscrito. Figuras 1A, 3A, 4Ay 6A son todas figuras originales de datos publicados en Chang et al. 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
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