Spektral Reflectometric mikroskopi på myeliniserade axoner In Situ

Summary

Här presenterar vi ett stegvisa protokoll för imaging myeliniserade axoner i en fast hjärnan segment med etikett-fri nanoskala imaging teknik utifrån spektrala reflectometry.

Abstract

I ett däggdjur nervsystemet ger myelin en elektrisk isolering genom omsluter axon fibrerna i en multilayered spiral. Inspirerad av sin-organiserade subcellulär arkitektur, vi nyligen utvecklat en ny bildgivande modalitet, heter spectral reflectometry (SpeRe), som ger oöverträffad etikett-fri nanoskala avbildning av den levande myeliniserade axoner i situ. Grundprincipen är att erhålla nanostrukturella information genom att analysera reflektans spectrumen av multilayered subcellulär struktur. I den här artikeln beskriver vi en detaljerad steg för steg-protokoll för att utföra en grundläggande SpeRe avbildning av nervös vävnader med hjälp av ett kommersiellt confocal mikroskopiska system, utrustad med ett vitt ljus laser och en avstämbara filter. Vi täcker förfarandena för provberedning, förvärv av spektrala data och bildbehandling för att erhålla nanostrukturella information.

Introduction

I däggdjur nervsystemet ger myelin snabb nerv överledning och axonal integritet genom omsluter axon fibrerna med multilayered membranös slidor. Dess mångbottnat struktur består av omväxlande nanoskala thin-film består av plasma membran (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), och extracellulära utrymmen (~ 7 nm)^1,2. Optisk mikroskopi, inklusive den senaste super-resolution mikroskopi, lämpar sig inte för att observera nanoskala myelin dynamiken på grund av sin otillräckliga upplösning på grund av optiska diffraktion^3,4,5. Även om elektronmikroskopi kan ge fina detaljer av myelin nanostrukturen, är det inte förenligt med de levande biologiska system på grund av mycket invasiva provet preparat som involverar kemiska fixering och ultrasectioning^6,7 . Tills nyligen har man ingen teknik gällande att iaktta nanoskala dynamiken i myeliniserade axoner i situ.

Schain et al. rapporterade tidigare att myeliniserade axoner uppvisar färgglada ljusreflektion⁸. Genom att anta den spektroskopiska analysen på det reflekterade ljuset, har vi utarbetat en ny bildgivande modalitet för nanoskala avbildning av myeliniserade axoner, heter spectral reflectometry (SpeRe)⁹. SpeRe baseras på tunnfilms-störningar inträffar i flerskiktade strukturen av myelinskidan (figur 1). Av optisk simulering på olika axoner, vi har visat att reflektans spektrumet en periodisk funktion i Vågtal och dess periodicitet () är omvänt proportionell mot axon diameter (d). Detta enkla förhållande () erbjuder lättköpt kvantifiering av axon diameter från SpeRe data. Utnyttja detta, avslöjade vi den förhärskande axon Utbuktningen under mild traumatisk hjärnskada i vår föregående rapport.

SpeRe systemet är baserat på konfokalmikroskopi och består av en specialiserad laserkälla och filtrerar (figur 2). Ingångskällan är en vitt ljus laser, att tillhandahålla bredband spektrala utdata synlig infraröd regioner. För spektral skanna, systemet är utrustat med två acousto-optiska enheter: en acousto-optic avstämbara filter (AOTF) för att leverera en vald våglängd från bredband ingångskälla och en acousto-optic stråldelare (AOBS) för vägledande den valda återspeglas våglängd till detektorn. Programvaran för Hyperspektrala konfokalmikroskopi ger (se Tabell för material) en anpassningsbar spektrala skanningsalternativ sekventiellt förvärva reflektans bilderna på olika indata våglängder. Dessutom kan kromatisk aberration kritiskt ingripa i spektral mätning; Därför rekommenderas användning av ett apochromat objektiv.

Notera, vitt ljus lasrar producera en ojämn spektrala utgång och de optiska komponenterna påverkar också den spektrala profilen. Därför behöver de förvärvade spectrana kalibreras för efterföljande kvantitativ analys. En skyddad silver spegel används vanligen som referens, vilket ger en nästan konstant reflexionsfaktor (> 97%) över regionen fullt synliga. De förvärvade spectrana är sedan uppdelade efter referens spektra från spegeln.

Den spektrala steg storleken för spektral Skanna bestämmer hastigheten hos förvärv; Således behöver optimeras. Som en större axon har en högre spektrala period, kräver det finare spektrala provtagning. Ett axon med en diameter av 10 μm, en av de största fysiologiska axoner, har exempelvis en spektral period av ~ 8 nm. Genom att tillämpa Nyquist provtagning kriterier, vi anställt den spektrala provtagningsintervall 4 nm att täcka alla fysiologiska axoner i mus nervös vävnader. Detta tillvägagångssätt tar vanligtvis över flera sekunder för en full spektral scan och därmed är inte lämplig för i vivo applikationer, där fysiologiska rörelse (t.ex. andning och hjärtslag) stör stabil spektrala förvärv. Vi har tidigare löst problemet av instrumentera anpassade upprätt Mikroskop, utformad för att förvärva hela spektrumet för varje punkt med en array spektrometer (förvärv hastighet ≈ 30 ms per pixel).

I den här rapporten beskriver vi ett detaljerat protokoll på SpeRe bildtagning på en fast hjärnan slice, som kan utföras i kommersiella Hyperspektrala Mikroskop (se Tabell för material). Protokollet kan således utföras av praktiker utan sakkunskap i optiska instrumentation. Vi täcker även de potentiella problem och felsökning för förvärv och analys av SpeRe data.

Protocol

Alla kirurgiska ingrepp har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Sungkyunkwan universitet.

1. provberedning

Obs: Autoklav alla kirurgiska instrument innan djurhantering. Genomföra alla kirurgiska prestanda i ett rum som är dedikerad till kirurgiska ingrepp. Sterila operationsrockar och handskar bör bäras av all personal i kirurgiska rummet hela tiden.

1. Vävnaden fixering
   1. Förbered två 10 mL-sprutor som var fyllda med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS.
   2. Söva en 7-12-vecka-gammal mus, (C57BL/6J eller någon mus linjer med endera könet) genom att administrera en blandning av zoletil och xylazin (1:1, 20 mg/kg varje) eller en alternativ lämplig anestesi regim (t.ex., det blandning av ketamin 80 mg/kg och 10 mg/kg xylazin) med en intraperitoneal injektion.
   3. När musen har nått ett kirurgiskt plan av anestesi (Använd metoden tå nypa-svar), exponera hjärtat genom att skära av huden och bröstkorgen med sax.
   4. Knipsa höger förmak med liten sax att dränera blodet och BEGJUTA PBS och PFA lösningen sekventiellt genom vänster kammare med en nål (perfusion rate = 4 mL/min, volym = 10 mL för varje lösning).
      Obs: Musen blir stel om förfarandet har slutförts. Användningen av ögonsalva eller sterilisering är inte nödvändig eftersom förfarandet är terminal. Förfarandet för fixering kan hoppas över. Detta steg rekommenderas dock att minimera strukturella deformationer inklusive mekaniska vävnadsskada och ischemisk axonal svullnad. För ytterligare information om vävnad fixering, se artikeln av Gage, G. J. et al. ¹⁰
2. Beredning av hjärnan Slice
   1. Halshugga musen med kirurgisk sax genom ventrala thorax och buk.
   2. Ta bort hårbotten och periostet med en passande liten sax tills helt utsätta kraniet.
   3. Bryta pannbenet och skär av kraniet längs sagittal suturen från nackknölen med liten sax med omsorg för att inte skada hjärnan.
   4. Ta försiktigt bort kraniet och dura mater sekventiellt med fin pincett.
   5. Extrahera hjärnan med hjälp av en mjuk plast sked, noga med att inte skada vävnaden.
   6. Skölj och Blötlägg extraherade hjärnan i en 4% PFA lösning under 30 minuter vid 4 ° C.
   7. Skär fast hjärnan i 100-150 µm sektioner med en vibratome.
      Obs: För mer information om vävnad förberedelse, se artikeln av Segev et al. ¹¹. för efterföljande förfaranden, vävnaden bör vara skuret i sektioner tunnare än tjockleken på distansen.
3. Montering av hjärnan Slice
   1. Förbereda 1 glasskiva och 2 kvadratiska lock glas (22 × 22 × 0.17 mm) för varje vävnad skiva.
   2. Skär en av fyrkantiga cover glasen i hälften (två rektangulära bitar) med hjälp av en glas fräs.
   3. Bifoga två halveras cover glasen med en super lim på bilden glaset.
      Obs: Utrymmet mellan två halveras glasen bör vara något större än storleken på vävnad segmentet.
   4. Skörda hjärnan segmentet med en borste eller en pipett och låg vävnaden på bilden glaset mellan mellanlägget. Se till att inte vika vävnaden.
   5. Dispensera 100 μl av PBS på vävnadsytan.
   6. Placera andra fyrkantiga täckglaset ovanpå vävnaden. Undvika delaktighet av luftbubblor under detta skede.
   7. Tätning runt täckglaset med ett nagellack (eller alternativt passande lim) för att förhindra avdunstning av PBS och kontaminering av damm under den efterföljande bildsession.
      Obs: Försöksledaren kan pausa i detta skede.

2. kalibrering

1. Slå på mikroskopet minst 1 h innan av imaging att tillåta termisk stabilisering av laser källa (se Tabell för material). Sedan aktivera programvaran för spektral skanning (se Tabell av material) och klicka på knappen Hämta överst på GUI (figur 3a),.
2. Aktivera programvaran slutaren för vitt ljus laser (WLL) och fotomultiplikatorn röret (PMT) (figur 3a).
3. Välj xyΛ läge på det drop-down listan i Förvärv läge, sedan, laser inmatningsläge ändras automatiskt från konstant procent till Konstant ström. Avmarkera kryssrutan Automatisk SPrörlighet. Och ange sedan fönstret spektrala av ingående laser 470 – 670 nm och spektrala stegstorlek till 4 nm på Λ-Excitation Lambda Skanna Inställningar (figur 3b).
4. Ange den spektrala utbud av PMT till 450-690 genom att dubbelklicka eller flytta fältet justering för spektralområde (figur 3 c).
   Obs: Denna spektralområde bör innehålla fullständig bandbredden för ingångskälla.
5. Välj en nedsänkning i vatten objektiv, passande med en hög numeriska bländaröppningen (NA > 0,7) och ge något värde till PMT och laser makt att aktivera AOBS konfiguration och Live Scan -knappen. Växla den optiska vägen genom att kontrollera speglar i AOBS konfiguration (figur 3d).
6. Montera en referens spegel (se Tabell för material) på Mikroskop scenen. Spegeln bör mötas mot objektivet. Om det inte är lätt att sätta spegeln på Mikroskop scenen, bond en spegel på platta plattan (t.ex. bild glas).
7. Kontroll Mikroskop scenen för att justera fokalplanet till spegeln.
8. Justera PMT förstärkningen och laser kraft med tanke på det dynamiska omfånget av detektorn och sedan ändra inmatningsläge laser från konstant procent till Konstant ström.
   Obs: Som är typiskt, en PMT få 500 (V) och en relativ lasereffekt 0,1% används på 570 nm.
9. Bekräfta i en pseudo color-läge för att kontrollera att det finns ingen mättnad i hela våglängdsområdet. Om mättnad observeras, lägre lasereffekt (figur 3a).
10. Kör Lambda Skanna förvärvet.
11. Ta bort spegeln från scenen och upprepa samma förvärv utan ett prov för att erhålla den mörka referensen (dvs, mörka offset).
12. Spara data i en Multistacked TIF -format.

3. SpeRe bild förvärv

1. Placera den monterade vävnaden på Mikroskop scenen. Justera ungefär vävnaden till fokalplanet av objektivet, Använd wide-fältet fluorescens genom en ögat-bit.
2. Med den Live Scan på, styra Mikroskop scenen för att justera fokalplanet till regionen av intresse i vävnaden. Undvik bakgrundsljud från täckglaset, Välj målregionen av minst 15 μm djup från glasfilt gränssnittet.
3. Förvärva den spektrala bildstapel för målregionen med samma procedur som beskrivs i steg 2.1 – 2.10.
4. Spara data för vävnaden och mörka förskjutningen i Multistacked TIF -format.
   Obs: Försöksledaren kan pausa i detta skede.

4. bild bearbetning och analys

1. Öppna den spektrala data (multistacked TIF) för referens spegeln och hjärnvävnad i ImageJ.
2. Välj ROIs (regioner av intresse) för de öppnade bildstaplar — det centrala området för referens spegeln och segmentet en axon fiber för hjärnvävnaden.
3. Förvärva rå spektra för de valda ROIs av rinnande bild → stackar → Rita z-profil på menyn ImageJ.
4. Öppna den mörka offset data, en för referens spegeln och den andra tagna för hjärnvävnaden.
5. Förvärva spektra för mörka förskjutningarna av rinnande bild → stackar → Rita z-profil på menyn ImageJ.
6. Spara alla förvärvade spektra med hjälp av Kopiera och klistra in alternativen.
   Obs: För SpeRe imaging rekommenderas användning av den centrala bildfältet att minimera off-axeln optiska aberrationer. Axon fibrerna kan vara strukturellt heterogena längs deras längd. Att välja ROI på ett litet axon segment, vanligtvis rekommenderas < 5 µm, att minimera partiella-volym artefakt därför.

5. Baslinjejustering och SpeRe signalanalys

1. Subtrahera offset spektra från referens spegeln och hjärnan vävnaderna.
2. Normalisera varje spektrum genom att dividera den maximal intensiteten av spektrumet.
3. Dela det normaliserade spektrumet av axonet av normaliserade spectrumen av referens spegeln och subtrahera DC offset från normaliserade spektrumet.
4. Mäta Vågtal frekvensen genom att montera förvärvade spektrumet för en sinusformad kurva (se Tabell för material), och sedan konvertera den förvärvade Vågtal till periodicitet av tar ömsesidiga.
5. Konvertera Vågtal periodiciteten till axon diameter med hjälp av ekvation i figur 4 c.

Representative Results

Enligt protokollet får en fast hjärnan skiva var beredd med exogena färgning, en myelin-targeting fluorophore (se Tabell för material). SpeRe imaging utfördes på hjärnan skiva med kommersiella Hyperspektrala confocal Mikroskop i samband med confocal fluorescens imaging (figur 4a). För SpeRe, ingång optiska intensitet sattes till 5 µW/µm² med en pixel uppehållstid på ~ 1 µs. Denna lätta dos är över en beställa-av-storlek lägre än konventionella fluorescens konfokalmikroskopi¹². Det tar ~ 17 s för spektral skanning över 470-670 nm vid ett intervall på 4 nm (51 bilder).

SpeRe signalen var lokaliserade längs mitten av myeliniserade axoner som förväntat av geometri av den optiska speglar. Reflektans spectrumen av en axon segment erhölls Vågtal periodiciteten, som var därefter omvandlats till axon diameter (figur 4b, c). Diametern mätt SpeRe befanns vara i bra avtal med fluorescens-baserade mätningen (figur 4 d). Den kvarstående mindre fel kunde ha sitt ursprung antingen från diffraktion begränsad upplösning fluorescens-baserade metoden eller den ofullständiga geometriska modell för SpeRe.

SpeRe bildtagning är baserad på optiska speglar, således ett kiselbaserade täckglas kan införa en betydande bakgrundsljud. I våra Fiberoptiska setup var bakgrundsljud stor när imaging djupet från täckglaset är mindre än 5 µm men undveks när imaging djupet är större än 15 µm (figur 5).

Figur 1 : Principen om SpeRe. Myeliniserade axon har en multilayered tunnfilms-struktur. Det infallande ljuset reflekteras delvis från vid gränssnitten, som beskrivs av Fresnels lag. Dessa återspeglas ljus vågor interferera med varandra. Därför, det resulterande reflekterade ljuset kodar nanostrukturella informationen. Spektral Reflectometry (SpeRe) erhåller nanostrukturella informationen genom att avkoda det reflekterade ljuset från myeliniserade axon. Denna siffra har varit omtryckt från Kwon, J. et al. ⁹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Layout av systemets SpeRe. SpeRe systemet bygger på en confocal reflektans Mikroskop. För spektral skanning, tre ytterligare komponenter behövs längs sökvägen excitation: (1) en supercontinuum laser, (2) acousto-optic avstämbara filter (AOTF) och (3) acousto-optisk balk splitter (AOBS). Den bredband laserkällan filtreras spektralt av AOTF att överföra en vald våglängd med en smal bandbredd. AOBS fungerar som en stråldelare för den valda våglängden att vägleda magnetiseringen ljus till provet. Ljuset är sedan incident på provet genom en galvanometriska scanner och en objektiv. Det reflekterade ljuset från provet är descanned, rumsligt filtreras av en confocal pinhole och samlas in av fotomultiplikatorn röret (PMT). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Mjukvara setup. (en) det grafiska användargränssnittet (GUI). I huvudfönstret, det finns huvudsakligen fem sub paneler: imaging setup, laser setup, fiberoptiska setup, detektor setup och bildvisare. (b) den nedrullningsbara menyn för val av avbildning läge. För SpeRe väljs xyλ. (c) panelen för att justera fönstret spektrala för detektorn. (d) panelen för att ställa in acousto-optic stråldelare (AOBS). 'Reflektansen' är valt att leda det reflekterade ljuset till detektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : SpeRe på en hjärnvävnad. (en) A SpeRe bilden av en murin hjärnvävnad färgas med en fluorescerande counterstaining av myelin (fluoromyelin). (b) en representativ reflektans spektrum erhållits från den vit streckad rutan i a. (c) en simulerad referenskurva att uppskatta axon diameter från spektral periodicitet. Blå asterisk är den datapunkt som erhållits från (b). (d), övergripande profil av fluorescensintensiteten från boxed regionen i a. Myelin yttre diameter uppskattas med hjälp av fluorescens signalen är ~ 760 nm, vilket stämmer väl överens med SpeRe mätningen. Den kvarstående fel är möjligen från diffraktion fel av fluorescens-baserade mätningen. Scalebar, 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 5 : Effekten av en täckglas. (en, b) Reflektans bilder av en hjärnvävnad på samma lateral position förvärvas på olika djup i vävnaden-täckglas-gränssnittet: 3 µm (a) och 15 µm (b). Scalebar, 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

SpeRe är en ny etikett-fri bildgivande modalitet baserat på spektrala interferometri, som för första gången erbjuder nanoskala informationen i levande myeliniserade axoner. I det aktuella förvärv protokollet, den rumsliga upplösningen för axon diametern är i storleksordningen 10 nm. Dessutom SpeRe använder tredjeparts beställer-av-storlek lägre ljus dos jämfört med andra super-upplösning microscopies; Därför är det fritt från fototoxicitet och fotoblekning. SpeRe skulle ge en ny väg för att studera nanoskala dynamiken i myeliniserade axoner.

Protokollet beskrivs häri är baserad på spektrala skanning medieras av acousto-optik och en LED-detektor (dvsPMT). Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt för att förvärva spektrala bilder av den fullständiga field-of-view. Tidsupplösningen begränsas dock av den spektrala skanning, vilket är normalt > 15 s i vår nuvarande konfiguration. Alternativt kan en höghastighets spektroskopet införlivas för att möjliggöra realtid observation av en liten field-of-view⁹. Detta system kan konstrueras helt enkelt från ett konventionellt confocal system genom att byta PMT genom ett spektroskop och lägga till en vitt ljus laser. För förvärvet programvara måste galvanometer ställning synkroniseras med driften av spektroskopet. Vid en enda punkt mätning bestäms den temporal upplösningen av bildhastigheten för den spektroskop, som kan vara > 10 kHz för senaste ultrasnabb apparater spektrum-optiska. Denna sub millisekund temporal upplösning bör vara tillräckligt för att följa de flesta av fysiologiska dynamiken i myeliniserade axoner i vivo. SpeRe bygger på lätta eftertanke; Därför har upptäcks ljuset samma våglängd som det ingående ljuset. Tvärtom, innebär fluorescens spektrala Skift (dvs, Stokes skift); upptäckta ljuset är således spektralt skiljas från det ingående ljuset. Denna funktion är användbart för samtidiga förvärv av SpeRe och fluorescens på samma prov (som visas i figur 4). Det ingående ljuset absorberas av en fluorophore kan påverka SpeRe mätningen, men absorptionen från typiska fluorescerande färgning är negligibly låg (< 1%).

Notera har SpeRe en begränsad kantiga upptäckten utbud-bara axoner nästan parallellt till imaging kan upptäckas. Detta kantiga SpeRe är runt ± 13,5 ° ⁹. För att förvärva specifika orientering av intresse, kan provet vinklas. Vid transparenta prover såsom zebrafisk embryo eventuellt full volymetriska förvärvet av roterande preparatet. En ytterligare praktiska begränsning är att ett täckglas monterad på ett prov ger stark rygg-reflektion leder till generation av hög bakgrund signal som visas i figur 5. Det rekommenderas att denna ytliga region bör undvikas. SpeRe baserat på synligt ljus har 1/e dämpning längd ~ 20 µm i hjärnans vävnader. Typiska vävnad genomträngningsdjupet kan för förvärva tillförlitlig spektrala information är begränsad till ~ 100 µm. djupare imaging vara möjligt om en längre ingångskälla används. I slutet visas validering av SpeRe genom att jämföra det med diffraktion begränsad fluorescensmikroskopi. Detta har tydligen varit otillräcklig för att utvärdera nanoskala precision (figur 4). Senaste tekniker, såsom korrelat ljus-elektronmikroskopi och expansion mikroskopi, skulle erbjuda ett sätt att validera SpeRe nanoskala regimen^13,14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass cutter	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8	Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	-
Paraformaldehyde	Biosolution	BP031a	4% v/v in PBS
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Thickness: ~1 mm
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	-
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.