Summary
Здесь мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий по микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) с помощью site-specifically модифицированных λ субстрат ДНК и точка квантовой надписью белка.
Abstract
Микроскопии флуоресцирования внесла большой вклад в рассекает механизмов сложных биологических процессов на уровне одной молекулы. В одной молекулы анализов для изучения ДНК белковых взаимодействий, есть два важных факторов для рассмотрения: субстрат ДНК с достаточной длины для легко наблюдения и маркировки белок с подходящей флуоресцентного зонда. 48,5 kb ДНК λ является хорошим кандидатом для субстрат ДНК. Квантовые точки (Qdots), как класс флуоресцентных зондов, позволяют долгое время наблюдения (от минут до часов) и получение высокого качества изображения. В этой статье мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий на уровне одной молекулы, которая включает в себя подготовку site-specifically модифицированных λ ДНК и маркировки целевого белка с покрытием стрептавидина Qdots. Для доказательство концепции мы выбираем ОРК (происхождения признание комплекс) в многообещающий дрожжи как протеин интереса и визуализировать его взаимодействие с ARS (автономно тиражирование последовательность) с помощью TIRFM. По сравнению с другими флуоресцентных зондов, Qdots имеют очевидные преимущества в одной молекулы исследований благодаря своей высокой стабильности против Фотообесцвечивание, однако следует отметить, что это свойство ограничивает его применение в количественных анализов.
Introduction
Взаимодействие между ДНК и белка имеют важное значение для многих сложных биологических процессов, таких как репликация ДНК, репарации ДНК и транскрипции. Хотя традиционные подходы пролили свет на свойства этих процессов, многие ключевые механизмы по-прежнему неясны. Недавно с быстро развивающейся одной молекулы методами, некоторые из механизмов были рассмотрены1,2,3.
Применение одной молекулы флуоресцентной микроскопии на визуализации взаимодействий протеин дна в режиме реального времени главным образом зависит от развития флуоресцентным обнаружением и флуоресцентных зондов. Для изучения одной молекулы важно для обозначения протеина интереса с подходящей флуоресцентного зонда, поскольку флуоресценции обнаружения систем в основном доступны коммерчески.
Флуоресцентные белки обычно используется в молекулярной биологии. Однако низкой яркости люминесцентных и стабильности против Фотообесцвечивание ограничить ее применение в многих анализов одной молекулы. Квантовые точки (Qdots) являются крошечные светоизлучающих наночастиц4. Благодаря их уникальным оптическим свойствам Qdots 10 - 20 раз ярче и несколько тысячу раз более стабильной, чем широко используются органические красители5. Кроме того Qdots имеют большой Стокса сдвига (разница между положением пики возбуждения и выбросов)5. Таким образом Qdots может использоваться для длительного наблюдения (от минут до часов) и получение изображений с высоким соотношением сигнал шум, в то время как они не могут быть использованы в количественных анализов.
На сегодняшний день, существует два подхода к этикетке целевого белка с Qdots site-specifically: маркировка с помощью первичных или вторичных антител, Qdot конъюгированных6,,78; или маркировки целевого белка с Qdots непосредственно, которая основана на сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина9,10,11,12,13. Qdots покрытием стрептавидина коммерчески доступны. В нашем недавнем исследовании, site-specifically биотинилированным белков в многообещающий дрожжей с высокой эффективностью были неразделимая co гиперэкспрессия Бира и Avi тегами белков в естественных условиях10. Следующие и оптимизации одной молекулы анализов14,,1516,17мы наблюдали взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК в одной молекулы уровня с помощью TIRFM10.
Здесь, мы выбираем многообещающий дрожжевого происхождения признание комплекс (ОРК), которые могут конкретно признать и привязать к автономно тиражирование последовательности (ARS), как наш протеин интереса. Следующий протокол представляет пошаговую процедуру визуализации взаимодействия Qdot меченых ОРКОВ с ARS с помощью TIRFM. Подготовка site-specifically модифицированных субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, поток cell Ассамблеи, и сингл молекула изображений описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. подготовка субстрата λ-ARS317 ДНК
- Строительство субстрат ДНК и упаковка
- Дайджест родной λ ДНК с помощью Xhoя фермента; усилить 543 bp ДНК фрагмента подшипника ARS317 от геномной ДНК многообещающий дрожжей с праймерами, содержащие 20 bp гомологичных последовательностей вверх и вниз по течению от Xhoя фермента сайт на лямбда ДНК. Добавить 100 нг от Xhoя переваривается λ ДНК и 10 нг ДНК фрагмент 10 мкл гомологичная рекомбинация реакции системы и инкубировать реакции при 37 ° C за 30 мин.
- Чтобы упаковать рекомбинации ДНК λ, 25 мкл лямбда упаковки экстрактов в рекомбинации продукт, и инкубировать и реакции на 30 ° C 90 мин. Затем добавьте дополнительные 25 мкл лямбда упаковки экстрактов в трубу реакции. Продолжать инкубировать реакции при 30 ° C 90 мин.
- Добавьте 500 мкл буфера для разведения стерильный (10 мм трис-HCl (рН 8.3), 100 мм NaCl, MgCl 10 мм2) в реакции системы и осторожно перемешать, повернув трубу вниз несколько раз. 25 мкл хлороформ, осторожно перемешать и хранить при 4 ° C.
- Добавить 100 мкл упакованных ФАГ и 100 мкл бактерий LE392MP (культивированный на 0,8 - 1,0 с использованием средних LB, добавление с 10 мм MgSO4) в новую трубу. Инкубируйте 15 минут при 37 ° C.
- Добавьте 200 мкл ФАГ бактерия смеси в 4 мл институциональному агар (LB средний + 0,7% агар + 10 мм MgSO4, охлаждается до 48 ° C). Сразу смешать, повернув трубу вниз несколько раз и вылить его на тарелку подогретым (37 ° C) фунтов.
- Инкубировать пластины при 37 ° C ночь и экран λ-ARS317 доска с помощью ПЦР и последовательности.
- Очистка субстрат ДНК от жидких лизатов11,18
- Выберите один налет в 200 мкл стерильных ddH2O с 10 мм MgCl2 и 10 Нм CaCl2. Смешать с 200 мкл бактерий LE392MP (культурный ночлега в среде фунтов) и инкубировать при 37 ° C 15 мин.
- Добавить смесь ФАГ бактерий в 100 мл NZCYM (10 г/Л NZ-Амин, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 5 г/Л NaCl, 1 г/Л Casamino гидролизат и 2 г/Л MgSO4·7H2O) среднего и культуры для 7 ч при 37 ° C. 250 мкл хлороформ в культуру и встряхнуть для еще 10 мин.
- Передача культуры в 200 мл флакон. Добавьте 5,8 г NaCl (1 М конечная концентрация), перемешайте вручную распустить и инкубировать на льду за 30 мин.
- Центрифуга на 12000 g x 10 мин при 4 ° C для удаления мусора ячейки. Собирать супернатант в 200 мл флакон и добавить 10% PEG8000 (m/V). Движение, чтобы распустить аппаратом магнитного перемешивания и инкубировать на льду для 30 минут или дольше.
- Центрифуга на 12000 g x 10 мин при 4 ° C, чтобы осадить бактериофага. Удалите супернатант.
- Ресуспензируйте осадка в 2 мл буфера для разведения ФАГ. Перенести его в 15 мл трубку и добавить 10 мкл РНКазы (конечная концентрация-20 мкг/мл) и 40 мкл DNase (конечная концентрация составляет 5 мкг/мл). Инкубируйте при 37 ° C за 30 мин.
- Добавить 2 мл 0,3 М трис-HCl (рН 9,0), ЭДТА 100 мм + 1,25% SDS, 15 мкл протеиназы K (конечная концентрация составляет 10 мкг/мл). Инкубируйте на 65 ° C для 10 мин.
- Добавить 2 мл, предварительно охлажденный калия ацетата (3 M, pH 4,8) и инкубировать трубку на льду за 10 мин.
- Центрифуга на 8000 x g 10 мин при температуре 4 ° C для удаления нерастворимых материалов.
- Добавление 0,7 x объем изопропанола в надосадке. Смешайте, повернув трубу вниз несколько раз и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре (RT).
- Центрифуга на 8000 x g 10 мин на RT, чтобы осадить ДНК. Удалите супернатант.
- Вымойте ДНК после с 70% этанол центрифугированием в 8000 x g 10 мин удалить супернатант.
- Элюировать ДНК, используя буфер TE 500 мкл (10 мм трис-HCl, ЭДТА 1 мм, pH 8.0) мягко и переноса ДНК в 1,5 мл трубку.
- Извлечь ДНК, дважды с использованием фенола: хлороформ центрифугированием в 8000 г за 10 мин.
- Осадок изопропанолом 0.7 x тома. Смешать, повернув трубу вверх вниз осторожно и центрифуги на 8000 x g за 10 мин.
- Один раз Помойте с 70% этиловом спирте, Ресуспензируйте в 200 мкл TE. Измерение концентрации ДНК и хранить при температуре-20 ° C в 12,5 мкг аликвоты.
2. λ-ARS317 ДНК Biotinylation
- К фосфорилировать биотинилированным олигонуклеотиды (5'-AGGTCGCCGCC-ГТЭ-биотин-3') в дополнение к левому концу родной λ ДНК, добавить 1 мкл (100 мкм) олигонуклеотиды, 7,5 мкл ddH2O, 1 мкл 10 x буфер лигаза и 0,5 мкл T4 ПНК. Инкубируйте реакции при 37 ° C в течение 3 ч.
- Фосфорилировать λ-ARS317, добавить 12,5 мкг λ-ARS317, 3 мкл 10 x буфер лигаза, 1 мкл T4 ПНК и ddH2O общий объем 30 мкл. Инкубируйте реакции при 37 ° C в течение 3 ч.
- Для отжига олигонуклеотиды с λ-ARS317, добавьте 0,5 мкл фосфорилированных олигонуклеотиды, 195 мкл ddH2O, 25 мкл 10 × лигаза буфера в трубу фосфорилированных λ-ARS317. Осторожно перемешать, повернув трубу вверх дном и Инкубируйте на 65 ° C для 5 минут повернуть блок отопителя, и пусть прохладно пример ниже 33 ° C в блоке.
- Чтобы перевязать олигонуклеотиды с λ-ARS317, добавьте 1 мкл T4 ДНК лигаза и 0,63 мкл АТФ (200 мм). Осторожно перемешать, повернув трубу вверх дном и инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч или 4 ° C на ночь. Хранить при 4 ° C на 1 месяц.
Примечание: Чтобы избежать распада ДНК, смешивая шаги должно быть сделано, осторожно поворачивая трубку вверх дном, вместо смешивания с помощью пипетки.
3. Coverslip очистка и функционализации
- Coverslip очистка
- Coverslips 20 место в 4 окрашивание банки (5 coverslips/jar), sonicate на 30 минут в этаноле и промойте coverslips с сверхчистого H2O 3 раза.
- Sonicate за 30 минут с 1 М гидроксид калия (KOH) и промыть coverslips с сверхчистого H2O 3 раза. Повторите этанола и Кох sonication раз.
- Sonicate с помощью ацетона для 30 минут и затем промойте с сверхчистого H2O (по крайней мере 3 раза).
Примечание: Ацетон должны быть удалены тщательно промыв с сверхчистого H2O, потому что это может привести к взрыву при смешивании органического растворителя (например, ацетон) раствором Пиранья ошибочно14. - Поместите coverslips в раствор Пиранья (3:1 смесь H2так4 и 30% H2O2) и Инкубируйте на 95 ° C в течение 1 ч.
Примечание: Пираньи решение очень энергичный и эрозионных, так что используйте с осторожностью. При подготовке решения пираньи, сначала добавьте 50 мл H2O2 в стеклянный стакан 500 мл, а затем добавить 150 мл, H2так4 медленно в стакан. - Промывайте coverslips с сверхчистого H2O 5 раз. Затем вымойте каждый coverslip с сверхчистого H2O, тщательно с использованием 3 стаканах, наполненный сверхчистого H2O и сухой coverslip, используя бумагу от края coverslip. Поместите coverslip в окрашивание банку и сухой coverslip тщательно в 110 ° C духовке в течение 30 минут.
- Промыть coverslip метанолом и окрашивание jar в 110 ° C духовке снова, чтобы высушить coverslip.
Примечание: Сушка coverslip тщательно очень важно, потому что APTES будет иметь много возможных поверхностных структур, как только это в присутствии воды19.
- Промыть coverslip метанолом и окрашивание jar в 110 ° C духовке снова, чтобы высушить coverslip.
- Функционализация Coverslip
- Добавить 70 мл раствора силана (93% метанола, 5% уксусной и 2% APTES) в каждую банку, колпачок и оставить банку при комнатной температуре на ночь.
- Вымойте и высушите coverslips, как описано в шаге 3.1.5, за исключением сухого coverslips, тщательно с использованием газ азот вместо того чтобы помещать их в духовке.
- Тщательно растворяются 150 мг mPEG (метокси-полиэтиленгликоль) и 6 мг биотина ПЭГ (биотин-полиэтиленгликоль) в 1 мл 0,1 М свежий сделал NaHCO3 (рН 8,2). Затем центрифуги на 17, 000 x г за 1 мин для удаления нерастворимых колышки.
Примечание: Свежеприготовленные NaHCO3 готова; Существует не нужно отрегулировать его рН. - Место silanized coverslips в коробках и положить два небольших coverslips на вершине двух концах silanized coverslips. Пипетка 100 мкл раствора ПЭГ на центре silanized coverslip и место другой silanized coverslip на вершине.
- Добавить некоторые сверхчистого H2O в поле, чтобы держать его влажным, и инкубировать и coverslips с PEG решение по крайней мере 3 часа в темноте. На ночь инкубации может работать также.
- Отдельных пар coverslip ногу функционализированных поверхности лица, промойте coverslips, широко используя сверхчистого H2O и высушите их азотом.
- Марк функционализированных стороне coverslips на одном из углов, используя маркер ручка, держать функционализированных стороне лицом вверх, поместите их в коробки и хранить коробки в вакуум-сушильный шкаф за 1 месяц.
- Для хранения coverslips на более длительное время, поместите одну coverslip в 50 мл трубки просверливаются с одним отверстием на его колпачок, затем положите трубку в пластиковый пакет и уплотнение мешка используя вакуумный упаковщик. Таким образом coverslips может храниться при температуре-20 ° C около 3 месяцев.
4. поток Cell Ассамблеи
- Вырежьте канал 15 мм × 2 мм в центре кусок двухсторонний скотч (30 × 12 мм) с помощью нокаутером.
- Отделите стороне бумаги двухсторонний скотч и вставьте его на слайде стекла с двумя отверстиями. Нажмите для удаления пузырьков воздуха. Основываясь на нашем опыте, легче удалить пузырьки воздуха, пилинг покинуть стороны бумаги, чем пластиковые стороны двухсторонней ленты.
- Вырезать функционализированных coverslip (60 × 24 мм) на четыре части (30 × 12 мм) с использованием стекла алмаз наконечником писец и удалить мусор, используя газ азот. Помните, чтобы держать функционализированных стороне лицом вверх.
- Отделите пластиковых стороне двухсторонний скотч и вставить слайд на функционализированных coverslip. Аккуратно нажмите удалить пузырьки воздуха между coverslip и ленты. Удаление пузырьков воздуха тщательно можно защитить клетки потока от утечки в то время как буферы были закачивается в него.
- Вставьте входе и выходе трубопровода в малых и больших отверстий, соответственно. Исправление с помощью эпоксидных труб.
- Насоса 20 мкл стрептавидина (0,2 мг/мл) в ячейку потока вручную с помощью шприца и Инкубируйте на RT за 10 мин. Затем насос блокирующий буфер10 в ячейку потока для замены стрептавидина и держать его при комнатной температуре.
5. одной молекулы визуализация
- Получение фокуса выравнивание красного и far-red с A5 на флуоресценции микроскопа тест #1 путем одновременного возбуждения, с использованием 532 нм лазер и 640 Нм лазер. Производить двойной длины волны изображения с расщепления оптике (см. Таблицу материалов).
- Поместить в ячейку потока на микроскопе и соедините его выходе трубы больше соединительной трубы с 10 мл весной, установленных на автоматизированные инфузионные/вывода программируемых насоса.
Примечание: Перекачивание буферов в ячейку потока, упомянутые ниже средства снятия буферы с впускной трубы поток ячейки шприца. - Насос блокирующий буфер в 500 мкл/мин в ячейку потока для удаления воздуха быстро и убедитесь, что буфер, в поток ячейки разблокированы. Затем насос блокирующий буфер в 200 мкл/мин в ячейку потока и флип выходе трубы для удаления пузырьков воздуха из впускной трубы и потока клетки тщательно.
Примечание: Все буферы, закачивается в ячейку потока следует дегазации в вакуумный сушильный шкаф для по крайней мере 15 минут до использования. - 0.5 мкл биотинилированным λ-ARS317 ДНК в 80 мкл блокировки буфера и насос в ячейку потока в 25 мкл/мин на 2 мин. Затем промойте λ-ARS317 ДНК, используя 200 мкл блокировки буфера в размере 50 мкл/мин.
- Насос 200 мкл привязки буфер10 со скоростью 50 мкл/мин Удалить блокирующий буфер в ячейке потока.
- 0.2 мкл стрептавидина покрытием Qdot705 (1 мкм) и 0,2 мкл биотинилированным ОРК (1,2 мкм) в трубку и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем 20 мкл привязки буфера в трубу и поместите его на льду. Конечная концентрация орк-Qdot705 составляет около 10 Нм.
- 2 мкл орк-Qdot705 (10 Нм), 1 мкл DTT (100 мм), 1 мкл в 96 мкл буфера привязки АТФ (200 мм). Конечная концентрация орк-Qdot705 составляет 0,2 Нм.
- Насос 20 мкл 0.2 Нм орк-Qdot705 в размере 10 мкл/мин в ячейку потока. Избавиться от чрезмерного орк-Qdot705 с помощью 200 мкл буфера привязки в размере 100 мкл/мин. Затем насос привязки буфер с 30 Нм SYTOX оранжевый в ячейку потока пятно ДНК субстратов в размере 100 мкл/мин.
- Возбуждают сигнал705 орк-Qdot и SYTOX оранжевый окрашенных ДНК сигнала с помощью 405 нм лазер и 532 нм лазер, соответственно. Соблюдать сигналы одновременно с 100 мкл/мин поток, используя фильтр полосовой Quad диапазона (FF01-446/510/581/703-25) и запись изображений на EM-CCD с 100 мс на кадр. Соберите 20 стеки изображений из различных областей.
6. анализ данных
- Обрезать изображения с помощью программного обеспечения Фиджи с новый плагин, который модифицируется сами на основе изображений плагин (OI_cut_RGBmerge), разработанный д-р Рон Vale лаборатории в университете Калифорнии, Сан-Франциско.
- Обрезка стек изображений (512 × 512 пикселей) в два стеки изображений (256 × 256 пикселей). Один является 532 нм лазерные захватывающие результат, и другой — 405 нм лазерные захватывающие результат.
- Процесс 61 последовательных изображений, с помощью проекта Фиджи-Image-стеки-Z (средней интенсивности).
- Мера длины ДНК (LДНК) и расстояние от сайта орк-Qdot705 (Lорк) привязки на ДНК ДНК привязал конец вручную.
- Вычислить результат Lорк/лДНК с помощью excel, анализировать данные с помощью метода загрузки, R, а затем создать гистограмму и соответствуют нормальным распределением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы визуализировать взаимодействие между Qdot меченых орк и ARS, мы сначала построили субстрат ДНК λ-ARS317. Фрагмент ДНК, содержащие ARS317 была интегрирована в Xhoя на сайте (33,5 kb) родной λ ДНК гомологичная рекомбинация (рис. 1A). Рекомбинация продукт был упакован с помощью экстрактов и упакованных Фаговые частицы были культивированный на LB пластины (рис. 1B). Положительные Фаговые бляшки экранируется ПЦР и подтверждена последовательности (рис. 1 c). Λ-ARS317 ДНК был очищен от жидкого лизатов (рис. 1 d).
Сингл молекула изображений анализы проводились на настройке TIRFM цель типа (рис. 2). По маркировке биотинилированным ОРКОВ с молярное соотношение примерно 1:1 с покрытием стрептавидина Qdots быстро, Qdot меченых ОРКОВ был накачкой в клетку привязанный поток λ-ARS317. ДНК был окрашенных с помощью SYTOX оранжевый. Сигналы Qdot меченых ОРКОВ и SYTOX-оранжевый окрашенных ДНК были образы, одновременно используя TIRFM (Рисунок 3А-3 C). Чтобы определить распределение орк на λ-ARS317, стек изображений был разделен на два стека: один стек ДНК сигнала и стек орк сигнала, как описано в шаге 6.1 (рис. 3B). На основе формулы, позиция (КБ) = (L/lоркДНК) × 50 КБ (рис. 3D), 273 обязательных позиций орк-Qdot705 молекул на 168 субстратов ДНК были проанализированы quantitively. Эти данные показали, что орк-Qdot705 специально связывает на сайте ARS317 вставлены с обилием очевидно высокой (Рисунок 3E) . Тем временем орк-Qdot705 также связывает на AT-богатые районы, расположенные в середине и свободный конец λ ДНК, которая согласуется с результатами предыдущих исследований10.
Приобретение высокого качества изображения зависит от молярное соотношение белка и Qdots в маркировке assay. Чрезмерное Qdots может быть хорошо для маркировки эффективности белка, но они могут создавать фоновый шум. Как показано на рисунке 4, при маркировке биотинилированным ОРКОВ с покрытием стрептавидина Qdots на молярное соотношение 1:3, увеличение фонового шума. Таким образом важно выбрать соответствующие молярное соотношение белков биотинилированным стрептавидина покрытием Qdots.
Рисунок 1: подготовка субстрата ДНК λ-ARS317. (A) Иллюстрация λ-ARS317 строительства. Подшипник ARS317 фрагмент ДНК была интегрирована в ДНК λ гомологичная рекомбинация. (B) бляшек на твердой питательной фунтов. Три из них были отмечены с помощью черные стрелки. (C) λ-ARS317 доска была определена с помощью ПЦР. (слева) Маркер, ДНК (посередине) родной λ, доска λ-ARS317 (справа). (D) очищенные λ-ARS317 ДНК была обнаружена электрофорезом геля агарозы 0,6%. (слева) Маркер, λ (посередине) родной ДНК (справа) очищенного λ-ARS317. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематичный обзор цель тип TIRF и потока ячейки. Одной молекулы изображений анализы были проведены основаны на TIRFM, сочетая с системы клеток потока. Наша TIRFM была выполнена на инвертированным микроскопом с 60 X нефти цель (числовая апертура = 1,49). ДНК (серая линия) привязными на coverslip в ячейку потока через биотин стрептавидина связь и растягивается потока слева направо. Связывания белков на привязи ДНК был обозначается точка красно овальные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Qdot705-помечены ОРК (молярное соотношение 1:1) обязательную λ-ARS317. (A) орк и λ-ARS317 ДНК наблюдались одновременно. (вверху) SYTOX оранжевый, окрашенных ДНК был взволнован лазером 532 нм и используя полоса передачи Нм 550-613 квад полосовой фильтр. (внизу) Qdot705-помечены ОРКОВ был взволнован лазером 405 нм и используя полоса передачи Нм 663-743 квад полосовой фильтр. (B) два 256 × 256 суб стеки были обрезаны из оригинального 512 × 512 стека. (C) изображения, полученные с помощью 61 последовательных кадров в соответствующих подборках. (слева) SYTOX оранжевый окрашенных ДНК, (средний) Qdot705-помечены орк, (справа) объединенного изображения; три Qdot705-помечены орк привязки на сайте ARS317 на подложках λ-ARS317 ДНК были отмечены с помощью черные стрелки. (D) Иллюстрация расчета орк привязка позиции на ДНК. LДНК означает ДНК длина, Lорк расстояние от ОРКОВ привязки сайта на ДНК в привязал конец ДНК. (E) гистограммы орк привязки распределение на λ-ARS317 ДНК. Гаусса, подходят к данным было указано с помощью красная сплошная линия. Ошибка бары указывают на 95% доверительный интервал, основанный на 1000 загрузки образцов. N означает количество молекул орк. Сайт ARS317 вставлены было указано с помощью черной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: привязка (молярное соотношение 3:1) Qdot меченых орк на λ-ARS317. Орк и λ-ARS317 ДНК наблюдались таким же образом, как показано на рисунке 3A. (слева) SYTOX оранжевый окрашенных ДНК был взволнован лазером 532 нм. (средний) Qdot меченых ОРКОВ был взволнован с помощью лазера 405 нм. (справа) объединенного изображения. Два Qdot меченых орк привязки на сайте ARS317 на подложках λ-ARS317 ДНК были отмечены с помощью черные стрелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем протокол наблюдать взаимодействие между Qdot меченых белков и ДНК site-specifically модифицированных λ, используя TIRFM в ячейку потока. Необходимые меры включают участкам модификации субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, подготовка потока клетки, и одной молекулы изображений. Существует два ключевых момента, которые следует отметить. Во-первых, все этапы с λ ДНК следует аккуратно манипулировать для снижения возможного ущерба, например, избегая смешивания, закупорить вверх и вниз несколько раз. Во-вторых это очень важно для обеспечения того, чтобы coverslip достаточно чистым, чтобы свести к минимуму ее фоновый шум. Во время процесса очистки и функционализации coverslip, вода должна достичь сверхчистого уровня, и воздух должен быть пыли. Это лучше осуществлять coverslip функционализации и потока cell Ассамблеи на лавочке чистой.
В одной молекулы анализов для изучения взаимодействия протеин дна λ ДНК является соответствующей подложке с несколькими преимуществами20. Λ ДНК достаточно долго, чтобы быть легко наблюдается и разрешение на запись движения белка на нем в эксперименте по одной молекулы. Кроме того свесы ssDNA позволяют много конструкций для привязывать λ ДНК на стекло coverslip. В этом исследовании мы представляем метод для вставки фрагмента экзогенной ДНК на определенном сайте λ ДНК. Таким образом различные Пользователь definable фрагментов ДНК могут быть интегрированы в λ ДНК. Изменение λ ДНК можно удобно очищенного от жидких лизатов в больших количествах для изучения одной молекулы.
Трудно оценить точно стрептавидина покрытием Qdot маркировки пробирного потому, что есть около 5-10 streptavidins за Qdot Нанокристаллические маркировки эффективности. Соответственно соответствующие молярное соотношение стрептавидина покрытием Qdots и биотинилированным белков должны быть оптимизированы в экспериментах. Молярное соотношение 1:1 может быть ссылкой.
Следует отметить, что Qdot не может использоваться в точных количественных анализов, поскольку ее устойчивость фото непригодна для фото отбеливание assay. Хотя высокая стабильность Qdots ограничивает его применение в количественных анализов, он позволяет легко наблюдения и отслеживания долгое время5. С ростом применения одной молекулы флуоресцентной микроскопии в биологии, протокол, описанных в данном документе будет во многом способствовать распад механизмов метаболизма ДНК в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Хасан Йардимчи и Dr.Sevim Йардимчи Фрэнсиса Крика института рода помощь в сингл молекулярных экспериментов, д-р Даниэль Duzdevich из лаборатории д-р Эрик C. Грин Колумбийского университета, доктор Юйцзе солнце Пекинского университета и доктор Чен Чуньлай из Университет Цинхуа для полезного обсуждения. Это исследование было поддержано национальным естественных наук фонд Китая 31371264, 31401059, CAS-междисциплинарная команда инноваций и Ньютон расширенный стипендий (NA140085) из Королевского общества.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
