Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) usando um substrato de DNA modificado site-specifically λ e um ponto quântico rotulado de proteína.
Abstract
A microscopia de fluorescência fez grandes contribuições em dissecando os mecanismos de complexos processos biológicos a nível da molécula. Em ensaios de molécula para o estudo das interações da proteína-ADN, existem dois fatores importantes para a consideração: o substrato de DNA, com comprimento suficiente para observação fácil e marcando uma proteína com uma sonda fluorescente apropriada. DNA de λ 48,5 kb é um bom candidato para o substrato de DNA. Pontos quânticos (Qdots), como uma classe de sondas fluorescentes, permitem a observação de longa data (minutos a horas) e aquisição de imagens de alta qualidade. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína no nível único-molécula, que inclui preparar um site-specifically modificado λ DNA e marcando uma proteína alvo com streptavidin-revestido Qdots. Para uma prova de conceito, podemos escolher ORC (complexo de reconhecimento de origem) em leveduras brotamento como uma proteína de interesse e visualizar sua interação com um ARS (sequência de replicação autônoma) usando TIRFM. Comparado com outras sondas fluorescentes, Qdots tem vantagens óbvias em estudos única molécula devido a sua alta estabilidade contra fotobranqueamento, mas note que esta propriedade limita sua aplicação em ensaios quantitativos.
Introduction
Interações entre proteínas e DNA são essenciais para muitos processos biológicos complexos, tais como a replicação do DNA, reparo do DNA e transcrição. Apesar de abordagens convencionais têm lançar luz sobre as propriedades destes processos, muitos mecanismos chaves são ainda pouco claras. Recentemente, com as técnicas de molécula em rápido desenvolvimento, alguns dos mecanismos foram abordados1,2,3.
A aplicação da microscopia de fluorescência de único-molécula na visualização de interações proteína-ADN em tempo real principalmente depende do desenvolvimento de detecção de fluorescência e sondas fluorescentes. Para um estudo da molécula, é importante a rotular a proteína de interesse com uma sonda fluorescente adequada desde sistemas de deteção de fluorescência são na sua maioria disponíveis comercialmente.
Proteínas fluorescentes são usadas em biologia molecular. No entanto, o baixo brilho fluorescente e estabilidade contra fotobranqueamento restringem sua aplicação em muitos ensaios única molécula. Pontos quânticos (Qdots) são pequenos emissores de luz de nanopartículas4. Devido a suas propriedades ópticas originais, Qdots são 10 - 20 vezes mais brilhantes e vários milhares de vezes mais estável do que o utilizado orgânicos corantes5. Além disso, Qdots têm uma grande Stokes turno (a diferença entre a posição dos picos de excitação e emissão)5. Assim, Qdots pode ser usado para a observação de longa data (minutos a horas) e aquisição de imagens com alta relação sinal-ruído, enquanto eles não podem ser utilizados em ensaios quantitativos.
Até à data, existem duas abordagens para rotular uma proteína do alvo com Qdots site-specifically: rotulagem, com o auxílio de anticorpos primários ou secundários conjugados a Qdot6,7,8; ou rotulagem a proteína do alvo com Qdots diretamente, que se baseia a interação forte entre biotina e streptavidin9,10,11,12,13. Streptavidin-revestido Qdots estão disponíveis comercialmente. Em nosso estudo recente, site-specifically biotinilado proteínas em gemulação de leveduras com alta eficiência foram purificadas pelo co-superexpressão de BirA e proteínas Avi-etiquetadas em vivo10. Seguinte e otimizando o único-molécula ensaios14,15,16,17, observamos as interações entre proteínas Qdot-labeled e DNA em nível usando a única molécula TIRFM10.
Aqui, nós escolhemos o brotamento fermento origem reconhecimento complexo (ORC), que especificamente pode reconhecer e ligar-se à sequência de replicação autônoma (ARS), como nossa proteína de interesse. O protocolo seguinte apresenta um procedimento passo a passo de visualizar a interação de ORC Qdot-etiquetadas com ARS usando TIRFM. A preparação do substrato DNA site-specifically modificado, biotinylation o DNA, a lamela limpeza e functionalization, a montagem da pilha de fluxo e a imagem do único-molécula são descritos.
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Protocol
1. preparação do substrato de DNA λ-ARS317
- Embalagem e construção de substrato DNA
- Digerir o DNA nativo λ usando Xhoeu enzima; amplificar um rolamento fragmento de DNA bp 543 ARS317 partir do DNA genômico de brotamento fermento usando cartilhas contendo 20 bp homóloga sequências de montante e a jusante da Xhoeu site de enzima no ADN do lambda. Adicionar 100 ng de Xhoeu digerido DNA λ e 10 ng de DNA do fragmento de 10 µ l do sistema de reação do recombination homologous e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.
- Para o DNA de λ de recombinação do pacote, adicione 25 µ l dos extratos de embalagens lambda para o produto de recombinação e incubar a reação a 30 ° C, durante 90 min. Em seguida, adicione um adicional 25 µ l de extratos de embalagens lambda no tubo de reação. Continue a incubar a reação a 30 ° C, durante 90 min.
- Adicionar 500 µ l de tampão de diluição estéril (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM de NaCl, 10 mM MgCl2) para o sistema de reação e misture delicadamente, girando o tubo de cabeça para baixo várias vezes. Adicione 25 µ l de clorofórmio, misture delicadamente e armazenar a 4 ° C.
- Adicione 100 µ l de fagos empacotados e 100 µ l de bactérias LE392MP (cultivadas em 0.8 - 1.0 usando meio LB adicionando com 10 mM de MgSO4) para um tubo novo. Incube a 37 ° C por 15 minutos.
- Adicione 200 µ l de mistura do fago-bactéria em ágar de detop 4 mL (média LB + 0,7% de ágar + 10 mM de MgSO4, resfriado a 48 ° C). Imediatamente misture girando o tubo de cabeça para baixo várias vezes e despeje-o sobre um prato pré-aquecido (37 ° C) LB.
- Incubar a placa a 37 ° C durante a noite e a placa de λ-ARS317 usando PCR e sequenciamento de tela.
- Purificação de substrato DNA de líquido lysates11,18
- Escolha uma placa em 200 µ l de DDQ estéril2O com 10 mM de MgCl2 e 10 nM CaCl2. Misture com 200 µ l de bactérias LE392MP (cultivada durante a noite em meio LB) e incubar a 37 ° C por 15 min.
- Adicione a mistura do fago-bactéria em 100 mL de NZCYM (NZ-amina, 5g/L de 10 g/L de levedura extrato, 5g/L de NaCl, 1 g/L Casamino hidrolisado e 2 g/L MgSO4·7H2O) médio e cultura para 7 h a 37 ° C. Adicionar 250 µ l de clorofórmio na cultura e agitar durante mais 10 minutos.
- Transferi a cultura para um balão de 200 mL. Adicionar 5,8 g de NaCl (concentração final de 1 M), mexa até para dissolver com a mão e incubar no gelo por 30 min.
- Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C para remover os detritos de células. Recolher o sobrenadante para um balão de 200 mL e adicionar 10% PEG8000 (m/V). Mexa para dissolver por aparelhos de agitação magnéticos e incubar no gelo por 30 min ou mais.
- Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C, para precipitar o bacteriófago. Remova o sobrenadante.
- Ressuspender o precipitado em 2 mL de tampão de diluição do fago. Transferi-lo para um tubo de 15 mL e adicionar 10 µ l de RNase (concentração final é de 20 µ g/mL) e 40 µ l de DNase (concentração final é 5 µ g/mL). Incube a 37 ° C por 30 min.
- Adicionar 2 mL de 0.3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 proteinase µ l K (concentração final é de 10 µ g/mL). Incube a 65 ° C por 10 min.
- Adicionar 2 mL de acetato de potássio pre-cooled (3 M, pH 4,8) e incubar o tubo no gelo por 10 min.
- Centrifugar a 8.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover os materiais insolúveis.
- Adicione o volume de 0,7 x de isopropanol para o sobrenadante. Misture girando o tubo de cabeça para baixo várias vezes e incube por 2 min à temperatura ambiente (RT).
- Centrifugar a 8.000 x g durante 10 minutos a RT para precipitar o DNA. Remova o sobrenadante.
- Lave o DNA, uma vez que com 70% de etanol por centrifugação a 8.000 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante.
- Eluir o DNA usando tampão de TE do 500 µ l (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH. 8.0) suavemente e transferir o DNA no tubo de 1,5 mL.
- Extrair o DNA duas vezes usando fenol: clorofórmio por centrifugação a 8.000 g durante 10 minutos.
- Precipitar com 0,7 x volume isopropanol. Misture girando o tubo de cabeça para baixo suavemente e centrifugar a 8.000 x g durante 10 minutos.
- Lave uma vez com etanol a 70%, resuspenda em 200 µ l de TE. Medir a concentração de DNA e armazenar a-20 ° C em 12,5 µ g alíquotas.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Para fosforilar oligonucleotides biotinilado (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementares para a extremidade esquerda do nativo λ DNA, adicionar 1 µ l (100 µM) de oligonucleotídeos, 7,5 µ l de DDQ2O, 1 µ l de buffer de ligase de 10x e 0,5 µ l de T4 PNK. Incube a reação a 37 ° C por 3 h.
- Para fosforilar λ-ARS317, adicione 12,5 µ g de λ-ARS317, 3 µ l de buffer de ligase de 10x, 1 µ l de T4 PNK e ddH2O volume total de 30 µ l. Incubar a reação a 37 ° C por 3 h.
- Para recozer oligonucleotides com λ-ARS317, adicione 0,5 µ l de oligonucleotides fosforilados, µ l 195 do DDQ2O, 25 µ l de tampão de ligase × 10 no tubo fosforilada λ-ARS317. Misture delicadamente, girando o tubo de cabeça para baixo e incubar a 65 ° C por 5 min. Turn off o aquecedor do bloco e deixe o fresco da amostra para abaixo de 33 ° C, no bloco.
- Para ligate oligonucleotides com λ-ARS317, adicione 1 μL de T4 DNA ligase e 0.63 µ l de ATP (200 mM). Misture delicadamente, girando o tubo de cabeça para baixo e incubar a temperatura ambiente por 2 h ou 4 ° C durante a noite. Armazenar a 4 ° C para 1 mês.
Nota: Para evitar a interrupção do DNA, todas as etapas de mistura devem ser feitas rodando suavemente o tubo de cabeça para baixo, em vez de mistura usando pipetas.
3. lamela limpeza e Functionalization
- Lamela limpeza
- Lugar 20 lamelas em 4 frascos de coloração (5 de lamelas/jar), proceda à sonicação durante 30 minutos em etanol e lave as lamelas com ultrapura H2O 3 vezes.
- Proceda à sonicação durante 30 minutos com 1 M de hidróxido de potássio (KOH) e enxágue as lamelas com ultrapura H2O 3 vezes. Repita o etanol e sonication KOH uma vez.
- Proceda à sonicação com acetona durante 30 minutos e em seguida enxaguar com ultrapura H2O (pelo menos 3 vezes).
Nota: Acetona deve ser removida completamente enxaguando com ultrapura H2O, porque ele pode causar uma explosão quando o solvente orgânico (como acetona) misturado com a solução de piranha equivocadamente14. - Coloque as lamelas em solução piranha (3:1 mistura de H2SO4 e 30% H2O2) e incube a 95 ° C por 1h.
Nota: Solução Piranha é altamente energético e erosiva, então use com cautela. Ao preparar a solução de piranha, adicionar 50 mL de H2O2 primeiro para um copo de vidro de 500 mL e adicione 150 mL de H2então4 lentamente no copo medidor. - Enxague as lamelas com ultrapura H2O 5 vezes. Então lave cada lamela com ultrapura H2O completamente usando 3 copos cheios ultrapura H2O e seque a lamela usando papel da borda da lamela. Colocar a lamela dentro do frasco de coloração e secar a lamela completamente em um forno a 110 ° C durante 30 minutos.
- Enxágue a lamela com metanol e coloque o frasco de coloração no forno novamente para secar completamente o sentido do lamela 110 ° C.
Nota: Secagem a lamela completamente é muito importante, porque APTES terá lotes de possíveis estruturas superficiais, uma vez que está na presença de água19.
- Enxágue a lamela com metanol e coloque o frasco de coloração no forno novamente para secar completamente o sentido do lamela 110 ° C.
- Lamela functionalization
- Adicionar 70 mL de solução de silano (metanol de 93%, 5% de ácido acético e 2% APTES) em cada frasco, enrosque a tampa e deixar o frasco à temperatura ambiente durante a noite.
- Lave e seque as lamelas, conforme descrito na etapa 3.1.5, exceto secar as lamelas completamente usando gás nitrogênio ao invés de colocá-los no forno.
- Dissolva 150 mg de mPEG (metoxi-polietileno glicol) e 6 mg de biotina-PEG (biotina-polietilenoglicol) em 1 mL de 0.1 M feito fresco NaHCO3 (pH 8,2) completamente. Em seguida centrifugar 17, 000 x g por 1 min remover PEGs insolúveis.
Nota: Recém-feitos NaHCO3 está pronto; Não há nenhuma necessidade de ajustar o seu pH. - Coloque as lamelas silanizada em caixas e colocar duas pequenas lamelas no topo de duas extremidades de lamelas o silanizadas. Pipetar 100 µ l de solução de PEG no centro da lamela silanizadas e coloque outro silanizada lamela em cima.
- Adicionar alguns ultrapura H2O na caixa para mantê-lo úmido e incube as lamelas com solução de PEG pelo menos 3 h no escuro. Uma incubação durante a noite pode funcionar tão bem.
- Separar os pares de lamela e acompanhar a face superfície funcionalizada, enxaguar as lamelas usando ultrapura H2O extensivamente e seque-os com gás de nitrogênio.
- Marca o lado funcionalizado das lamelas em um dos cantos usando uma caneta marcador, manter o lado funcionalizado voltadas para cima, colocá-los em caixas e armazenar as caixas no exsicador vácuo durante 1 mês.
- Para armazenar as lamelas por mais tempo, coloque uma lamela em um tubo de 50 mL perfurado com um buraco na sua tampa, em seguida, colocar o tubo em um saco plástico e selar o saco usando um selador. Desta forma, as lamelas podem ser armazenadas a-20 º C cerca de 3 meses.
4. fluxo celular Assembly
- Corte um canal 15 mm × 2 milímetros no centro de um pedaço de fita dupla-face (30 mm × 12 mm) usando um perfurador.
- Retire o lado da fita dupla-face de papel e colá-lo sobre a lâmina de vidro com dois buracos. Pressione para remover as bolhas de ar. Baseado em nossa experiência, é mais fácil remover as bolhas de ar por descascar fora do lado do papel que a lateral de plástico da fita dupla-face.
- Corte uma lamela funcionalizada (60 mm × 24 mm) em quatro pedaços (30 mm × 12 mm) usando um copo com ponta de diamante escriba e remover os detritos usando gás nitrogênio. Lembre-se de manter o funcionalizados lado enfrentar.
- Retire a lateral de plástico da fita dupla face e colar o slide sobre a lamela funcionalizado. Pressione suavemente para remover as bolhas de ar entre a lamínula e a fita. Remover as bolhas de ar completamente pode proteger a célula de fluxo vazem enquanto amortecedores foram bombeados para isso.
- Inserir entrada e saída tubos nos furos pequenos e grandes, respectivamente. Conserte a tubulação usando epóxi.
- Bomba de 20 µ l de estreptavidina (0,2 mg/mL) em células de fluxo, usando uma seringa manualmente e incubar a RT por 10 min. Então bomba bloqueio reserva10 na célula de fluxo para substituir streptavidin e mantê-lo em temperatura ambiente.
5. molécula visualização
- Obter o alinhamento focal de vermelho e far-red com A5 do slide de teste do microscópio de fluorescência #1 por excitação simultânea, usando um laser de 532 nm e um laser de 640 nm. Produzir imagens de duplo comprimento de onda com separação óptica (ver Tabela de materiais).
- Coloque a pilha de fluxo no microscópio e conectar a tubulação de saída para uma conexão de tubulação mais com uma mola de 10 mL, instalada em uma bomba de infusão/retirada automática programável.
Nota: Bombeamento buffers de dentro da célula de fluxo mencionada abaixo significa buffers de retirar o tubo de entrada da célula de fluxo para a seringa. - Bomba de tampão de bloqueio em 500 µ l/min para a célula de fluxo para remover o ar rapidamente e garantir que o buffer na célula de fluxo é desbloqueado. Depois da bomba o tampão de bloqueio em 200 µ l/min para a célula de fluxo e virar o tubo de saída para retirar bolhas de ar da tubulação de entrada e a célula de fluxo completamente.
Nota: Todos os buffers bombeados para dentro da célula de fluxo devem ser desgaseificados num exsicador de vácuo pelo menos 15 minutos antes do uso. - Adicionar 0,5 µ l de DNA de λ-ARS317 biotinilado em 80 µ l de tampão de bloqueio e bombeá-lo para a célula de fluxo em 25 µ l/min por 2 min. Então lave λ-ARS317 DNA usando 200 µ l de tampão de bloqueio a uma taxa de 50 µ l/min.
- Bomba de 200 µ l de tampão10 de vinculação a uma taxa de 50 µ l/min para remover o tampão de bloqueio na célula de fluxo.
- Adicionar 0,2 µ l de streptavidin-revestido Qdot705 (1 µM) e 0,2 µ l de biotinilado ORC (1,2 µM) em um tubo e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Em seguida adicionar 20 µ l de binding buffer no tubo e colocá-lo no gelo. A concentração final de ORC-Qdot705 é cerca de 10 nM.
- Adicionar 2 µ l de ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µ l de TDT (100 mM), 1 µ l de ATP (200 mM) em 96 µ l de tampão de ligação. A concentração final de ORC-Qdot705 é 0.2 nM.
- Bomba de 20 µ l de 0,2 nM ORC-Qdot705 à taxa de 10 µ l/min para a célula de fluxo. O jogo de excessiva de ORC-Qdot705 usando 200 µ l de tampão de ligação à taxa de 100 µ l/min. Em seguida, tampão de ligação da bomba com 30 nM SYTOX laranja dentro da célula de fluxo para manchar substratos de DNA a uma taxa de 100 µ l/min.
- Excitar o sinal de705 ORC-Qdot e laranja SYTOX manchado sinal de DNA usando um laser de 405 nm e laser de 532 nm, respectivamente. Observar os sinais simultaneamente com 100 µ l/min, fluxo, usando um filtro de passa-banda Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) e gravar as imagens pelo EM-CCD com 100 ms por quadro. Recolha 20 pilhas de imagem de diferentes campos.
6. análise de dados
- Cortar as imagens usando o software de Fiji com um novo plugin, que é modificado por nós mesmos se baseia o plugin de imagem (OI_cut_RGBmerge), desenvolvido pelo laboratório do Dr. Ron Vale na Universidade da Califórnia, San Francisco.
- Corte uma pilha de imagens (512 × 512 pixels) em duas pilhas de imagens (256 × 256 pixels). Um é um 532 nm laser resultado emocionante, e o outro é um 405 nm laser resultado emocionante.
- Processo de 61 imagens sequenciais usando projeto de Fiji-imagem-pilhas-Z (intensidade média).
- Medida do comprimento do DNA (DNAde L) e a distância do local da ligação de705 (LORC) ORC-Qdot no DNA com do DNA amarrados fim manualmente.
- Calcular o resultado de LORC/LDNA usando excel, analisar os dados usando o método de inicialização por R, em seguida, criar o histograma e ajuste distribuições Gaussian.
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Representative Results
Para visualizar a interação entre ORC Qdot-rotulados e o ARS, construímos primeiro o substrato de DNA λ-ARS317. Um fragmento de DNA contendo ARS317 foi integrado em Xhoeu site (33,5 kb) de DNA nativo λ por recombinação homóloga (figura 1A). O produto de recombinação foi empacotado usando extratos e as partículas do fago embalados foram cultivadas em placas LB (figura 1B). A placa positiva do fago foi projectada por PCR e confirmada por sequenciamento (Figura 1). Λ-ARS317 DNA foi purificado a partir os lysates líquidos (Figura 1).
Único-molécula de imagem ensaios foram realizado na afinação TIRFM objetivo-tipo (Figura 2). Através da marcação o biotinilado ORC com uma relação molar de quase 1:1 Qdots streptavidin-revestido rapidamente, ORC Qdot-etiquetado foi bombeado para dentro da célula de fluxo amarrados λ-ARS317. DNA foi manchado usando laranja SYTOX. Os sinais de ORC Qdot-etiquetadas e SYTOX laranja-manchadas de DNA foram fotografados simultaneamente usando TIRFM (Figura 3A-3 C). Para determinar a distribuição de ORC em λ-ARS317, a pilha de imagem foi separada em duas pilhas: uma pilha de sinal do DNA e a outra pilha de sinal ORC conforme descrito na etapa 6.1 (Figura 3B). Com base na fórmula, posição (kb) = (L/lORCDNA) × 50 kb (Figura 3D), 273 vinculação posições de ORC-Qdot705 moléculas em 168 substratos de DNA foram quantitativamente analisado. Os dados mostraram que o ORC-Qdot705 especialmente vincula no site ARS317 inserido com uma abundância de obviamente alta (Figura 3E) . Enquanto isso, ORC-Qdot705 também vincula nas áreas ricas AT localizadas no meio e a extremidade livre do DNA λ, que é consistente com os resultados do estudo anterior10.
A aquisição de imagem de alta qualidade depende a razão molar de proteína e Qdots no ensaio de rotulagem. Qdots excessiva pode ser bom para a etiquetagem de eficiência de proteína, mas eles podem criar ruído de fundo. Como mostrado na Figura 4, enquanto rotulando o biotinilado ORC com Qdots streptavidin-revestido na proporção molar de 1:3, o ruído de fundo aumentou. Assim, é fundamental para escolher a relação molar adequada de proteínas biotinilado streptavidin-revestido Qdots.
Figura 1: preparação do substrato de DNA λ-ARS317. (A) ilustração da construção de λ-ARS317. Um fragmento de DNA, tendo ARS317 de DNA λ foi integrado por recombinação homóloga. (B) placas em meio sólido LB. Três deles foram marcados usando setas pretas. (C) uma placa de λ-ARS317 foi identificada usando o PCR. (esquerda) Marcador, DNA λ nativo (do meio), (direita) uma placa de λ-ARS317. (D) Purified λ-ARS317 DNA foi detectado pela electroforese do gel de agarose de 0,6%. (esquerda) Marcador, λ nativo (médio) (direita) de DNA purificado λ-ARS317. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: visão geral esquemática da célula TIRF e fluxo objetivo-tipo. Molécula de imagem ensaios foram realizadas com base no TIRFM combinando com sistema de célula de fluxo. Nosso TIRFM foi realizada em um microscópio invertido equipado com um 60 X objetivo de óleo (abertura numérica = 1,49). DNA (linha cinza) foi amarrado na lamela na célula de fluxo através do enlace de estreptavidina-biotina e esticado pelo fluxo da esquerda para a direita. Uma ligação de proteínas no ADN amarrado foi indicada por um ponto vermelho-oval. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Qdot705-rotulado ORC (proporção molar de 1:1) obrigatória para λ-ARS317. (A) ORC e λ-ARS317 DNA foram observados simultaneamente. (topo) SYTOX laranja DNA manchada estava animado, usando um laser de 532 nm e observadas usando a banda de transmissão 550-613 nm do filtro passa-faixa do quad-band. (parte inferior) Qdot705-ORC rotulada estava animado, usando um laser de 405 nm e observadas usando a banda de transmissão 663-743 nm do filtro passa-faixa do quad-band. (B) dois 256 × 256 sub pilhas foram cortadas a partir da original 512 × 512 pilha. (C) as imagens adquiridas usando 61 quadros sequenciais nas pilhas correspondentes. (esquerda) SYTOX laranja manchado de DNA, (meio) Qdot705-rotulado ORC, imagem mesclada (à direita); três Qdot705-vinculação de ORC etiquetado no site ARS317 em substratos de DNA λ-ARS317 foram marcados usando setas pretas. (D) ilustração do cálculo do ORC vinculação posição sobre DNA. LDNA significa o comprimento do DNA, LORC , a distância de ORC ligação local no DNA à extremidade amarrada do DNA. (E) distribuição de vinculação de histograma de ORC no DNA λ-ARS317. Gaussiana caber aos dados foi indicada usando a linha vermelha sólida. Barras de erro indicam um intervalo de confiança de 95% com base em amostras de auto-inicialização de 1000. N significa o número de moléculas ORC. ARS317 inserido local foi indicado usando uma seta preta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ligação de ORC Qdot-rotulado (proporção molar 3:1) em λ-ARS317. ORC e λ-ARS317 DNA observaram-se da mesma forma como na Figura 3A. (esquerda) SYTOX laranja DNA manchada estava animado, usando um laser de 532 nm. (médio) Qdot-rotulado ORC estava animado usando laser 405 nm. imagens mescladas (à direita). Dois ligação de ORC Qdot-etiquetadas em ARS317 site sobre substratos de DNA λ-ARS317 foram marcados usando setas pretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo para observar a interação entre a Qdot-etiquetou a proteína e o DNA de λ site-specifically modificada usando o TIRFM em uma célula de fluxo. Os passos necessários incluem modificação site-specific do substrato DNA, DNA biotinylation, lamela limpeza e functionalization, preparação de fluxo-célula e único-molécula imagem. Existem dois pontos-chave que devem ser observados. Primeiro, todas as etapas envolvidas com DNA λ devem ser manipuladas com cuidado para diminuir qualquer possível dano, por exemplo, evitando a mistura pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em segundo lugar, é muito importante garantir que a lamela é limpa o suficiente para minimizar o ruído de fundo. Durante o processo de limpeza e functionalization lamela, a água deve atingir nível ultrapura, e o ar deve ser isento de poeira. É preferível efectuar a lamela functionalization e montagem de pilha de fluxo sobre uma bancada limpa.
Em ensaios os única molécula para estudar a interação da proteína-DNA, DNA λ é um substrato apropriado com várias vantagens20. DNA de λ é tempo suficiente para ser facilmente observado e permitir a gravação de proteína movimento nele em uma experiência única molécula. Além disso, as saliências do ssDNA permitem que muitos projetos para tethering DNA λ sobre uma lamela de vidro. Neste estudo, apresentamos um método para inserir um fragmento de DNA exógeno em um site específico de DNA λ. Assim, vários fragmentos de DNA definíveis pelo usuário podem ser integrados em DNA λ. O DNA modificado λ pode ser convenientemente purificado de lysates líquidos em grandes quantidades para o estudo da molécula.
É difícil avaliar a eficiência de rotulagem com precisão no streptavidin-revestido Qdot ensaio de rotulagem, porque existem aproximadamente 5-10 streptavidins por Qdot nanocrystal. Nesse sentido, a relação molar apropriada de streptavidin-revestido Qdots e biotinilado proteínas deve ser otimizada em experimentos. Proporção molar de 1:1 pode ser uma referência.
Deve notar-se que o Qdot não pode ser usado em ensaios quantitativos precisos desde sua foto-estabilidade elevada é inadequado para o ensaio de foto-branqueamento. Embora a alta estabilidade de Qdots limita sua aplicação em ensaios quantitativos, permite fácil observação e acompanhamento de longa data5. Cada vez mais aplicações da microscopia de fluorescência de único-molécula em biologia, o protocolo descrito neste documento muito contribuirá para desvendar os mecanismos do metabolismo de DNA no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci do Instituto Francis Crick de tipo ajudar nas experiências de único-molécula, Dr. Daniel Duzdevich do laboratório do Dr. Eric C. Greene, da Universidade de Columbia, Dr. Yujie Sun da Universidade de Pequim e Dr. Chunlai Chen de Universidade de Tsinghua para discussão útil. Este estudo foi suportado por Nacional Natural Science Foundation da China 31371264, 31401059, equipe de inovação interdisciplinar CAS e o Fellowship Newton avançado (NA140085) da Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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