Summary
Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.
Abstract
De fluorescentie microscopie heeft grote bijdragen geleverd in de ontrafeling van de mechanismen van complexe biologische processen op het niveau van één molecuul. In één molecuul testen voor de studie van DNA-eiwit interactie, zijn er twee belangrijke factoren ter overweging: de DNA-substraat met voldoende lengte voor gemakkelijk waarneming en labelen van een eiwit met een geschikt fluorescente sonde. 48.5 kb λ DNA is een goede kandidaat voor de DNA-substraat. Quantumdots (Qdots), toestaan als een klasse van fluorescerende sondes, dat lange tijd observatie (minuten tot uren) en kwalitatief hoogwaardige Beeldacquisitie. In deze paper presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interacties op het niveau van de single-molecuul, waarin de voorbereiding van een site-specifically gemodificeerde λ DNA en labelen van een target eiwit met streptavidine beklede Qdots. Voor een proof of concept, wij kiezen voor ORC (oorsprong erkenning complexe) in ontluikende gist als een proteïne van belang en visualiseren de wisselwerking daarvan met een ARS (autonoom replicerende sequence) met behulp van TIRFM. Vergeleken met andere tl sondes, Qdots hebben duidelijke voordelen in één molecuul studies als gevolg van de hoge stabiliteit tegen photobleaching, maar hierbij moet worden opgemerkt dat deze eigenschap de toepassing ervan in kwantitatieve tests beperkt.
Introduction
Interacties tussen eiwitten en DNA zijn essentieel voor vele complexe biologische processen, zoals DNA-replicatie, DNA-reparatie en transcriptie. Hoewel conventionele benaderingen licht op de eigenschappen van deze processen werpen hebben, zijn vele belangrijke mechanismen zijn nog onduidelijk. Onlangs, met de zich snel ontwikkelende enkel molecuul technieken, sommige van de mechanismen zijn geadresseerd1,2,3.
De toepassing van single-molecuul fluorescentie microscopie op het visualiseren van eiwit-DNA interacties in real-time voornamelijk hangt af van de ontwikkeling van fluorescentie detectie en fluorescerende sondes. Voor de studie van een enkel molecuul is het belangrijk om de proteïne van belang van een label met een geschikt fluorescente sonde aangezien fluorescentie detectiesystemen meestal commercieel beschikbaar zijn.
Fluorescerende eiwitten worden vaak gebruikt in moleculaire biologie. Echter beperken de lage fluorescerende helderheid en stabiliteit tegen photobleaching de toepassing ervan in veel enkel molecuul testen. Quantumdots (Qdots) zijn kleine lichtgevende nanodeeltjes4. Vanwege hun unieke optische eigenschappen, Qdots zijn 10 - 20 keer helderder en verscheidene duizend keer meer stabiel dan de gebruikte organische kleurstoffen5. Bovendien hebben de Qdots een grote Stokes shift (het verschil tussen de positie van excitatie en emissie pieken)5. Dus, is dat de Qdots kan worden gebruikt voor lange tijd waarneming (minuten tot uren) en verwerving van beelden met hoge signaal-ruis verhoudingen, terwijl ze kunnen niet worden gebruikt in de kwantitatieve tests.
Tot op heden zijn er twee benaderingen van label een doel eiwit met Qdots site-specifically: labelen met behulp van Qdot-geconjugeerde primaire of secundaire antilichamen6,7,8; of het doel-eiwit met Qdots direct, dat is gebaseerd op de sterke wisselwerking tussen Biotine en daar9,10,11,12,13te labelen. Daar beklede Qdots zijn commercieel verkrijgbaar. In onze recente studie site-specifically biotinyleerd eiwitten in de ontluikende gist met hoge efficiëntie werden gezuiverd door co-overexpressie van BirA en Avi-gelabelde proteïnen in vivo10. Door het volgende en het optimaliseren van de single-molecuul testen14,15,16,17, nageleefd wij de interacties tussen Qdot-geëtiketteerden eiwitten en DNA op de enkel molecuul niveau met behulp van TIRFM10.
Hier, we kiezen de ontluikende gist oorsprong erkenning complexe (ORC), die kan worden specifiek herkend en binden aan de autonoom replicerende volgorde (ARS), als onze proteïne van belang. Het volgende protocol presenteert een stapsgewijze procedure voor het visualiseren van de interactie van Qdot-label ORC met ARS met behulp van TIRFM. De voorbereiding van het site-specifically gemodificeerde DNA substraat, de biotinylation van DNA, het dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, de vergadering van de stroom-cel en de single-molecuul beeldvorming worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de λ-ARS317 DNA substraat
- DNA substraat bouw en verpakking
- Verteren inheemse λ DNA met behulp van Xhoik enzym; versterken van 543 bp DNA fragment invloed ARS317 uit de genomic DNA van ontluikende gist gebruikend inleidingen met 20 bp homologe reeksen van stroomopwaarts en stroomafwaarts van Xhoik enzym site op lambda DNA. Voeg 100 ng van Xhoverteerd ik λ DNA en 10 ng van DNA fragment aan 10 µL van homologe recombinatie reactie systeem, en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
- Als wilt inpakken de DNA recombinatie λ, voeg 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda in het product recombinatie en Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 90 min. Vervolgens voegt u een extra 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda in de reactiebuis. Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 90 minuten blijven.
- Voeg 500 µL van steriele verdunning buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) in het reactie-systeem, en meng zachtjes door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen. Voeg 25 µL van chloroform, meng zachtjes en bewaren bij 4 ° C.
- Voeg 100 µL van verpakte bacteriofaag en 100 µL van bacteriën LE392MP (gekweekt op 0.8 - 1.0 LB via toevoegen met 10 mM MgSO4) in een nieuwe buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg 200 µL van phage-bacterie mengsel in 4 mL oftop agar (LB medium + 0,7% agar + 10 mM MgSO4, afgekoeld tot 48 ° C). Meng onmiddellijk door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen en giet het op een bord voorverwarmde (37 ° C) LB.
- Na een nacht bebroeden de plaat bij 37 ° C en de λ-ARS317 plaquette met behulp van PCR en het rangschikken van het scherm.
- DNA substraat zuivering van vloeibare lysates11,18
- Kies een plaque in 200 µL van steriele ddH2O met 10 mM MgCl2 en 10 nM CaCl2. Meng met 200 µL van bacteriën LE392MP (gekweekte overnachting in LB medium) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg het mengsel faag-bacterie in 100 mL NZCYM (10 g/L NZ-amine, 5 g/L gist extract, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino hydrolysaat en 2 g/L MgSO4·7H2O) medium en cultuur gedurende 7 uur bij 37 ° C. Voeg 250 µL van chloroform in de cultuur en schud voor een ander 10 min.
- Breng de cultuur in een maatkolf van 200 mL. Voeg 5.8 g NaCl (1 M eindconcentratie), roer om op te lossen met de hand, en broeden op het ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin van de cel. Verzamelen van de bovendrijvende substantie in een maatkolf van 200 mL en voeg toe 10% PEG8000 (m/V). Roer om los door magnetische roeren apparaat en incubeer op ijs gedurende 30 minuten of langer.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het neerslaan van de bacteriofaag. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de neerslag in 2 mL zuiver faag verdunning buffer. Breng dit in een tube van 15 mL en voeg 10 µL van RNase (eindconcentratie is 20 µg/mL) en 40 µL van DNase (eindconcentratie is 5 µg/mL). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg toe 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 µL proteïnase K (eindconcentratie is 10 µg/mL). Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
- Voeg toe 2 mL pre gekoelde Kaliumacetaat (3 M, pH 4.8), en de buis op ijs gedurende 10 minuten uit te broeden.
- Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van de onoplosbare materialen.
- Voeg 0.7 x hoeveelheid isopropanol in het supernatant. Meng door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten op RT te precipiteren DNA. Verwijder het supernatant.
- Wassen het DNA zodra met 70% ethanol door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
- Elueer het DNA met 500 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) zachtjes, en breng het DNA in 1,5 mL-buis.
- Uitpakken van het DNA tweemaal met behulp van fenol: chloroform door centrifugeren bij 8.000 g gedurende 10 minuten.
- Neerslag met 0.7 x volumedelen isopropanol. Meng door de buis opwaartse zachtjes naar beneden, en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten.
- Een keer wassen met 70% ethanol, resuspendeer in 200 µL voor TE. Meten van de concentratie van DNA, en opgeslagen bij-20 ° C in 12,5 µg aliquots.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Om phosphorylate biotinyleerd oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotine-3') complementair aan het linkereinde van native λ DNA, voeg 1 µL (100 µM) van oligonucleotides, 7,5 µL van ddH2O, 1 µL van 10 x ligase buffer en 0,5 µL van T4 PNK. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 3 uur.
- Λ-ARS317 phosphorylate, toevoegen van 12,5 µg λ-ARS317, 3 µL van 10 x ligase buffer, Incubeer 1 µL van T4 PNK en ddH2O tot totale hoeveelheid 30 µL. de reactie bij 37 ° C gedurende 3 uur.
- Toevoegen om te ontharden oligonucleotides met λ-ARS317, 0,5 µL van gefosforyleerd oligonucleotides, 195 µL van ddH2O, 25 µL van 10 × ligase buffer in de gefosforyleerd λ-ARS317 buis. Meng zachtjes door te draaien aan de buis ondersteboven en Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 min. beurt uit het blok kachel, en laat het monster koel aan minder dan 33 ° C in het blok.
- Om het afbinden oligonucleotides met λ-ARS317, voeg 1 µL van T4 DNA ligase en 0.63 µL van ATP (200 mM). Meng voorzichtig door de buis ondersteboven draaien en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur voor 2 uur of 4 ° C. Bewaren bij 4 ° C gedurende 1 maand.
Opmerking: Om te voorkomen dat de sloop van het DNA, alle mengen stappen moeten worden gedaan door zachtjes draaien de buis ondersteboven, in plaats van mengen met behulp van pipetten.
3. dekglaasje aan reinigings- en Functionalization
- Dekglaasje aan schoonmaken
- Plaats 20 coverslips in 4 kleuring potten (5 coverslips/pot), bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten in ethanol, en spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 3 keer.
- Bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten met 1 M kaliumhydroxide (KOH), en spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 3 keer. Herhaal de ethanol en KOH ultrasoonapparaat eens.
- Bewerk de ultrasone trillingen ten met aceton gedurende 30 minuten, en spoel na met ultrazuiver H2O grondig (minstens 3 maal).
Opmerking: Aceton moet worden verwijderd grondig door spoelen met ultrazuiver H2O, omdat het leiden een explosie tot kan bij organische oplosmiddelen (zoals aceton) vermenging met de piranha-oplossing per ongeluk14. - Plaats de coverslips in piranha-oplossing (3:1 mengsel van H2SO4 en 30% H2O2) en Incubeer bij 95 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: Piranha-oplossing is zeer energiek en erosieve, dus gebruik met voorzichtigheid. Bij de voorbereiding van piranha-oplossing, voegt toe 50 mL H2O2 eerst in een bekerglas van 500 mL glas, en vervolgens 150 mL H2dus4 langzaam af in het bekerglas. - Spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 5 keer. Vervolgens wassen elke dekglaasje aan met ultrazuiver H2O grondig met behulp van 3 bekerglazen gevuld met ultrazuiver H2O en droog het dekglaasje aan met behulp van papier vanaf de rand van het dekglaasje aan. Plaatst het dekglaasje aan in de kleuring pot en droog het dekglaasje aan grondig in een oven van 110 ° C gedurende 30 minuten.
- Spoel het dekglaasje aan met methanol en plaats de kleuring pot in de oven van 110 ° C opnieuw aan het dekglaasje aan goed afdrogen.
Opmerking: Het dekglaasje aan grondig drogen is zeer belangrijk, omdat APTES veel mogelijke oppervlakte structuren hebben zal zodra het in aanwezigheid van water19.
- Spoel het dekglaasje aan met methanol en plaats de kleuring pot in de oven van 110 ° C opnieuw aan het dekglaasje aan goed afdrogen.
- Dekglaasje aan functionalization
- Voeg 70 mL silane oplossing (93% methanol, 5% azijnzuur en 2% APTES) in elke pot, schroef de dop en laat de pot bij kamertemperatuur 's nachts.
- Was en droog de coverslips zoals beschreven in stap 3.1.5, behalve droog de coverslips grondig met stikstofgas in plaats van ze in de oven plaatsen.
- Los 150 mg voor mPEG (methoxy-polyethyleenglycol) en 6 mg Biotine-PEG (Biotine-polyethyleenglycol) grondig in 1 mL 0,1 M vers-en-klare NaHCO3 (pH 8.2). Vervolgens centrifuge op 17, 000 x g voor 1 min te verwijderen van de onoplosbare pinnen.
Opmerking: Versgemaakte NaHCO3 is klaar; Er is geen behoefte aan te passen van de pH. - Plaats van de coverslips gesilaneerde in vakken, en zet twee kleine coverslips op de bovenkant van twee uiteinden van de gesilaneerde coverslips. Pipetteer 100 µL van PEG oplossing in het midden van de gesilaneerde dekglaasje aan en plaats een andere gesilaneerde dekglaasje aan op de top.
- Sommige ultrazuiver H2O toevoegen in het vak te vochtig houden, en de coverslips met PEG oplossing voor ten minste 3 uur in het donker uit te broeden. Een overnachting incubatie kan eveneens werken.
- Scheiden van de paren dekglaasje aan en houden de functionalized oppervlakte gezicht, spoel de coverslips uitgebreid met behulp van ultrazuiver H2O en droog ze met stikstofgas.
- Markeer de functionalized kant van de coverslips op een van de hoeken gebruikmakend van een viltstift, houden de functionalized kant onder ogen zien, plaats ze in vakken en opslaan van de vakken in het vacuüm exsiccator voor 1 maand.
- Voor het opslaan van de coverslips voor een langere tijd, breng een dekglaasje aan in een tube van 50 mL geboord met een gat in de dop, dan zet de buis in een plastic zak en sluit de zak met behulp van een vacuum sealer. Op deze manier kunnen de coverslips worden opgeslagen bij-20 ° C ongeveer 3 maanden.
4. flow cel vergadering
- Het snijden van een kanaal van 15 mm × 2 mm in het midden van een stukje dubbelzijdig tape (30 mm × 12 mm) met behulp van een perforatie.
- Afschilferen van de kant van de papier van de dubbelzijdige tape en plak deze op het glasplaatje met twee gaten. Druk op om luchtbellen te verwijderen. Gebaseerd op onze ervaring, is het makkelijker te verwijderen van luchtbellen door peeling uit de kant van de papier dan de plastic kant van de dubbelzijdige tape.
- Snijd een functionalized dekglaasje aan (60 mm × 24 mm) in vier stukken (30 mm × 12 mm) met behulp van een diamant-tipped glas scribe en verwijderen van het puin met stikstofgas. Vergeet niet om de functionalized kant onder ogen zien.
- Afschilferen van de plastic kant van de dubbelzijdige tape, en plak de dia op de functionalized dekglaasje aan. Druk zachtjes op luchtbellen tussen het dekglaasje aan en de band verwijderen. Het grondig verwijderen van luchtbellen kan behoeden de stroom cel terwijl buffers werden gepompt in het lekken.
- Invoegen inlaat en uitlaat slang in kleine en grote gaten, respectievelijk. Bevestigen van de buis met behulp van epoxy.
- Pomp 20 µL van daar (0,2 mg/mL) in cel van stroom met behulp van een injectiespuit handmatig en Incubeer bij RT gedurende 10 min. Vervolgens pomp blokkerende buffer10 in stroom cel ter vervanging van daar, en bewaar deze bij kamertemperatuur.
5. enkel molecuul visualisatie
- De focal uitlijning van rood en far-red met A5 op de fluorescentie Microscoop test dia #1 verkrijgen door gelijktijdige excitatie met behulp van een 532 nm laser en een 640 nm-laser. Produceren dubbele golflengte beelden met het splitsen van optica (Zie Tabel van materialen).
- Plaats van de cel van de stroom op de Microscoop en sluit haar uitlaat slang aan een langere buis aansluiten met een veer van de 10 mL op een geautomatiseerde infusie/intrekking programmeerbare pomp geïnstalleerd.
Opmerking: Het pompen van buffers in de cel van de stroom onderstaande middelen intrekking van de buffers van de buizen van de inlaat van de stroom-cel met de spuit. - Pomp buffer met blokkerend op 500 µL/min in de cel van de stroom lucht snel verwijderen en ervoor zorgen dat de buffer in de cel van de stroom opgeheven wordt. Vervolgens de buffer met blokkerend op 200 µL/min pomp in de cel van de stroom en de uitlaat slang om te verwijderen van luchtbellen uit de buis van de inlaat en de stroom-cel grondig wegknippen.
Opmerking: Alle buffers in de cel stroom gepompt moeten worden ontgast in een vacuüm exsiccator gedurende ten minste 15 minuten vóór gebruik. - Voeg 0,5 µL van biotinyleerd λ-ARS317 DNA in 80 µL van buffer met blokkerend, en pomp het in de cel van de stroom aan 25 µL/min gedurende 2 minuten. Vervolgens spoel λ-ARS317 DNA met behulp van 200 µL van buffer met blokkerend met een snelheid van 50 µL/min.
- Pomp 200 µL van bindende buffer10 bij een snelheid van 50 µL/min voor het verwijderen van de buffer met blokkerend in de cel van de stroom.
- Voeg 0.2 µL van daar beklede Qdot705 (1 µM) en 0.2 µL van biotinyleerd ORC (1,2 µM) in een buis, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Daarna voeg 20 µL van bindende buffer in de buis, en plaats het op het ijs. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is ongeveer 10 nM.
- Voeg 2 µL van ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL van DTT (100 mM), 1 µL van ATP (200 mM) in 96 µL van bindende buffer. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is 0,2 nM.
- Pomp 20 µL van 0,2 nM ORC-Qdot705 debiet van 10 µL/min in de cel van de stroom. Spoelen van buitensporige ORC-Qdot705 met behulp van 200 µL van bindende buffer tegen het tarief van 100 µL/min. Vervolgens pomp bindende buffer met 30 nM SYTOX oranje in de cel van de stroom aan de vlekken van DNA substraten met een snelheid van 100 µL/min.
- Wekken van het signaal van de705 ORC-Qdot en SYTOX oranje gekleurd DNA signaal met een 405 nm laser en 532 nm laser, respectievelijk. Observeren van de signalen gelijktijdig met 100 µL/min stroom met behulp van een Quad-band bandfilter filter (FF01-446/510/581/703-25) en het opnemen van de beelden door EM-CCD met 100 ms per frame. 20 afbeeldingsstapels verzamelen uit verschillende velden.
6. de gegevensanalyse
- Gewas de beelden met behulp van de Fiji-software met een nieuwe plugin, die door onszelf wordt gewijzigd op basis van de Image-plugin (OI_cut_RGBmerge), ontwikkeld door Dr. Ron Vale de lab aan de Universiteit van Californië, San Francisco.
- Het bijsnijden van een stapel van beelden (512 × 512 pixels) in twee stapels van beelden (256 × 256 pixels). Een is een 532 nm laser spannend resultaat, en anderzijds een 405 nm laser spannend resultaat.
- 61 opeenvolgende afbeeldingen met behulp van Fiji-beeld-Stacks-Z project (gemiddelde intensiteit) verwerken.
- De lengte van DNA (LDNA) en de afstand vanaf de site van ORC-Qdot705 (LORC) bindt DNA tot het DNA dat de maatregel vastgebonden einde handmatig.
- Het resultaat van LORC/lDNA berekenen met behulp van excel, analyseren van de gegevens met behulp van de bootstrap methode door R, dan maken van het histogram en passen Gaussian distributies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te visualiseren de interactie tussen Qdot-geëtiketteerden ORC en de ARS, gebouwd we eerst de λ-ARS317 DNA substraat. Een fragment van DNA met ARS317 werd geïntegreerd in Xhoik (33,5 kb) site van inheemse λ DNA door homologe recombinatie (figuur 1A). De recombinatie product is verpakt met behulp van extracten en de verpakte phage deeltjes werden gekweekt op LB platen (figuur 1B). De positieve faag plaquette werd gescreend door PCR en bevestigd door sequencing (Figuur 1 c). Λ-ARS317 DNA was gezuiverd van de vloeibare lysates (Figuur 1 d).
Single-molecuul imaging tests werden uitgevoerd op de doel-type TIRFM set-up (Figuur 2). Door het labelen van de biotinyleerd ORC met een molaire bijna 1:1-verhouding daar beklede Qdots snel, Qdot-geëtiketteerden ORC was gepompt in de λ-ARS317 vastgebonden stroom cel. DNA werd gekleurd met behulp van SYTOX oranje. De signalen van Qdot-label ORC en SYTOX-Oranje-gekleurde DNA werden beeld gelijktijdig met behulp van TIRFM (figuur 3A-3 C). Om te bepalen van de verdeling van de ORC op λ-ARS317, de imaging stack werd opgedeeld in twee stapels: één stack van DNA signaal en de andere stapel ORC signaal zoals beschreven in stap 6.1 (figuur 3B). Op basis van de formule, positie (kb) = (LORC/lDNA) × 50 kb (figuur 3D), 273 bindende standpunten van ORC-Qdot705 moleculen op 168 DNA substraten waren quantitively geanalyseerd. De gegevens bleek dat de ORC-Qdot705 speciaal bindtop de website van de ARS317 ingevoegd met een natuurlijk hoge overvloed (3E figuur). Ondertussen, ORC-Qdot705 ook bindt op de AT-rijke gebieden gelegen in Midden- en het vrije uiteinde van λ DNA, die met de resultaten van de vorige studie10 strookt.
De kwalitatief hoogwaardige Beeldacquisitie hangt af van de molaire verhouding van eiwit en Qdots in de labeling assay. Overmatige Qdots kunnen goed zijn voor het eiwit labeling van efficiëntie, maar ze achtergrondgeluid kunnen maken. Zoals weergegeven in Figuur 4, terwijl de biotinyleerd ORC met streptavidine beklede Qdots op de molaire verhouding 1:3, labeling verhoogd de achtergrondgeluiden. Het is dus cruciaal voor het kiezen van de juiste molaire verhouding van biotinyleerd eiwitten aan daar beklede Qdots.
Figuur 1: voorbereiding van λ-ARS317 DNA substraat. (A) afbeelding van λ-ARS317 constructie. Een fragment van DNA, rekening houdend met ARS317 werd geïntegreerd in λ DNA door homologe recombinatie. (B) Plaques op de vaste drager van LB. Drie van hen werden gemerkt met behulp van zwarte pijlen. (C) een plaquette λ-ARS317 werd geïdentificeerd met behulp van PCR. (links) Marker, (midden) native λ DNA, (rechts) een plaquette van λ-ARS317. (D) Purified λ-ARS317 DNA werd ontdekt door 0,6% agarose de Elektroforese van het gel. (links) Marker, (midden) native λ DNA (rechts) gezuiverd λ-ARS317. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Schematisch overzicht van de doelstelling-type TIRF en flow-cel. Enkel molecuul imaging tests werden uitgevoerd op basis van de TIRFM te combineren met cel-stroomsysteem. Onze TIRFM werd uitgevoerd op een omgekeerde Microscoop uitgerust met een 60 X olie doelstelling (numerieke diafragma = 1,49). DNA (grijze lijn) was vastgebonden op het dekglaasje aan in de cel van de stroom via de koppeling biotine-daar, en uitgerekt door de stroom van links naar rechts. Een binding aan eiwitten op het vastgebonden DNA werd aangegeven door een rood-ovaal-dot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Qdot705-label ORC (1:1 molair verhouding) bindt λ-ARS317. (A) ORC en λ-ARS317 DNA werden gelijktijdig waargenomen. (boven) SYTOX oranje gekleurd DNA werd opgewekt met behulp van een 532 nm laser en waargenomen met behulp van de 550-613 nm transmissie band van de vierling-band band-pass filter. (onder) Qdot705-gelabelde ORC was opgewekt met behulp van een 405 nm laser en waargenomen met behulp van de 663-743 nm transmissie band van de vierling-band band-pass filter. (B) twee 256 × 256 sub stapels werden bijgesneden van de oorspronkelijke 512 × 512 stack. (C) de beelden verkregen met behulp van 61 sequentiële frames in de overeenkomstige stapels. (links) SYTOX oranje gekleurd DNA, (midden) Qdot705-label ORC, (rechts) samengevoegde afbeelding; drie Qdot705-gelabelde ORC inbinden op ARS317 site op λ-ARS317 DNA substraten werden gemerkt met behulp van zwarte pijlen. (D) de illustratie van de berekening van de ORC bindend standpunt over DNA. LDNA : de lengte van DNA, LORC middelen de afstand van ORC site op DNA te binden aan het vastgebonden einde van DNA. (E) de verdeling van de bindende van het Histogram van de ORC op λ-ARS317 DNA. Gaussiaans aanpassen aan de gegevens werd aangegeven met behulp van de rode ononderbroken lijn. Foutbalken geven een betrouwbaarheidsinterval van 95% op basis van 1000 bootstrap monsters. N betekent het aantal ORC moleculen. ARS317 ingevoegd site werd aangegeven met behulp van een zwarte pijl. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Qdot-geëtiketteerden ORC bindt (molaire verhouding 3:1) λ-ARS317. ORC en λ-ARS317 DNA werden waargenomen op dezelfde manier zoals in figuur 3A. (links) SYTOX oranje gekleurd DNA werd opgewekt met behulp van een 532 nm laser. (midden) Qdot-geëtiketteerden ORC werd opgewekt met behulp van een laser voor 405 nm. (rechts) samengevoegde afbeeldingen. Twee Qdot-geëtiketteerden ORC inbinden op ARS317 site op λ-ARS317 DNA substraten werden gemerkt met behulp van zwarte pijlen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een protocol om te zien hoe de interactie tussen het eiwit Qdot-label en het DNA van de site-specifically gemodificeerde λ met behulp van de TIRFM in een flow-cel. De noodzakelijke stappen omvatten site-specific wijziging van DNA substraat, DNA biotinylation dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, stroom-cel voorbereiding en single-molecuul imaging. Er zijn twee cruciale aandachtspunten die dient te worden opgemerkt. Ten eerste, al de stappen met λ DNA moeten zachtjes worden gemanipuleerd om het verlagen van de mogelijke schade, bijvoorbeeldvermijden mengen door pipetteren herhaaldelijk op en neer. Ten tweede, is het zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat het dekglaasje aan schoon genoeg om te minimaliseren van de achtergrondruis. Tijdens het dekglaasje aan reinigings- en functionalization water ultrazuiver niveau moet bereiken, en de lucht moet stofvrij. Het is beter om het dekglaasje aan functionalization en stroom-cel vergadering op een schone bankje te verrichten.
In de enkel molecuul testen voor de studie van eiwit-DNA-interactie, is λ DNA een geschikt substraat met verschillende voordelen20. Λ DNA is lang genoeg om te worden gemakkelijk waargenomen en toestaan dat eiwit beweging op het opnemen in het experiment van een enkel molecuul. Bovendien, de ssDNA overhangen toestaan vele ontwerpen voor het binden van λ DNA op een glas dekglaasje aan. In deze studie presenteren we een methode voor het invoegen van een exogene fragment van DNA op een specifieke site van λ DNA. Dus, kunnen verschillende gebruiker definieerbare DNA-fragmenten worden geïntegreerd in λ DNA. De gemodificeerde λ DNA kan gunstig worden gezuiverd van vloeibare lysates in grote hoeveelheden voor enkel molecuul studie.
Het is moeilijk om te evalueren van de labeling efficiëntie nauwkeurig in de daar-gecoate Qdot labeling assay omdat er ongeveer 5-10 streptavidins per Qdot nanocrystal. Bijgevolg moet de juiste molaire verhouding van daar beklede Qdots en biotinyleerd eiwitten in de experimenten worden geoptimaliseerd. Een molaire verhouding van 1:1 kan een verwijzing zijn.
Opgemerkt moet worden dat Qdot kan niet worden gebruikt in nauwkeurige kwantitatieve tests, omdat haar hoge foto-stabiliteit ongeschikt voor de foto-bleken assay is. Hoewel de hoge stabiliteit van Qdots de toepassing ervan in de kwantitatieve tests beperkt, kan het eenvoudige observatie en lange tijd bijhouden5. Met de toenemende toepassingen van single-molecuul fluorescentie microscopie in de biologie, het protocol beschreven in dit document zal sterk bijdragen tot het ontrafelen van de mechanismen van DNA-metabolisme in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Hasan Yardimci en Dr.Sevim Yardimci van het Francis Crick Instituut voor soort helpen in de single-molecuul experimenten, Dr. Daniel Duzdevich van Dr. Eric C. Greene's lab van Columbia University, Dr. Yujie Sun van de Universiteit van Peking en Dr. Chunlai Chen van Tsinghua Universiteit voor nuttige discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisciplinaire innovatie Team en de Newton geavanceerde Fellowship (NA140085) van de Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
