Summary
ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.
Abstract
蛍光顕微鏡は、単一分子レベルでの複雑な生物学的過程のメカニズムを解剖に多大な貢献をしました。単一分子アッセイ DNA 蛋白質の相互作用を研究するため、検討のための 2 つの重要な要因がある: 十分な長さの簡単な観察と適切な蛍光プローブを用いたタンパク質を標識 DNA 基板。48.5 kb λ DNA は DNA の基質の良い候補です。量子ドット (Qdots)、蛍光プローブのクラスとして長年観察 (時間分) と高品質画像の取得を許可します。Site-specifically 変更された λ DNA を準備して、ラベリング、ストレプトアビジン コーティング Qdots と標的タンパク質など分子レベルで DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案します。コンセプトの証明、我々 興味の蛋白質として出芽酵母におけるオーク (原点認識複合体) を選択し、観察を使用して、アルス (自律的複製シーケンス) との相互作用を視覚化します。他の蛍光プローブと比較して、Qdots は退色、に対して高い安定性のための単一分子の研究で明白な利点を持っているが、定量的アッセイへの応用をこのプロパティに制限に注意してください。
Introduction
タンパク質と DNA の相互作用は、DNA 複製、DNA 修復および転写など、多くの複雑な生物学的プロセスに不可欠です。従来のアプローチは、これらのプロセスのプロパティに光を当てるが、多くの主なメカニズムはまだ明らかではありません。最近では、急速に成長の単一分子技術メカニズムのいくつかは対処1,2,3をされています。
主にリアルタイムで蛋白質 DNA 相互作用の視覚化の単一分子蛍光顕微鏡の応用は、蛍光検出蛍光プローブの開発に依存します。単一分子研究のため適切な蛍光プローブ蛍光検出システム、ほとんど商業的に利用可能なので興味の蛋白質にラベルすることが重要です。
蛍光タンパク質は、分子生物学の一般的使用されます。ただし、低蛍光輝度とフォトブリーチングに対する安定性は、多くの単一分子アッセイへの応用を制限します。量子ドット (Qdots) は、小さな発光ナノ粒子4。彼らのユニークな光学特性のため Qdots は 10-20 倍明るく、数千倍より安定したよりも広く使われている有機染料5。さらに、Qdots は大きなストークス シフト (励起と放射のピークの位置差)5にあります。したがって、彼らは定量的アッセイに利用することはできませんしながら Qdots を長年観察 (時間分) の高い信号対雑音比を持つ画像の取得使用できます。
日には、site-specifically Qdots と標的タンパク質をラベルに 2 つのアプローチがある: ラベリングした Qdot 共役のプライマリまたはセカンダリ抗体6,7,8; の助けを借りてやラベル、ターゲット蛋白質 Qdots と直接、ビオチンとストレプトアビジン9,10、11,12,13間の強い相互作用に基づいています。ストレプトアビジン コーティング Qdots 市販されています。最近の研究では、site-specifically 高効率で出芽酵母のビオチン化タンパク質により精製された・ ビラと avi ファイルのタグ付きタンパク質の過剰発現の co体内10。次一分子アッセイ14,15,16,17を最適化することで我々 は単一分子のレベルを使用した Qdot 標識タンパク質と DNA の相互作用を観察観察10。
ここで、我々 は出芽を選択興味の私達の蛋白質として原点認識複合体 (オーク) を具体的に認識して自律的に複製シーケンス (ARS) バインドできますの酵母。次のプロトコルは、観察を使用してアルスした Qdot というラベルの付いたオークの相互作用を視覚化するステップバイ ステップの手順を示します。Site-specifically 変更された DNA の基質、DNA ビオチン化、coverslip のクリーニングし機能化、フロー セル ・ アセンブリおよび単一分子イメージングの準備を説明します。
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Protocol
1. λ ARS317 DNA 基板の作製
- DNA 基板構成と包装形態
- Xhoを使用してネイティブ λ DNA を消化私酵素;新進の genomic DNA から ARS317 酵母 20 を含むプライマーを用いて 543 bp DNA フラグメント ベアリングを増幅する相同 bp 系列の上流と下流にXho私ラムダ DNA 上の酵素のサイト。追加 100 ng Xhoの λ DNA と 10 を消化され ng の DNA のフラグメントの相同組換え反応システムの 10 μ L と 30 分の 37 ° C で反応を孵化させなさい。
- 再結合 λ DNA をパッケージ化、遺伝子組み替え品にラムダ包装エキスを 25 μ l 添加し、90 分の 30 ° C で反応を孵化させなさい。反応管にラムダ包装抽出物の追加 25 μ L を追加します。90 分の 30 ° C で反応をインキュベートし続けます。
- 滅菌希釈バッファー (10 mM トリス-HCl (pH 8.3)、100 mM の NaCl、10 mM MgCl2) 500 μ L を反応システムに追加、チューブを数回上下に回して軽く混ぜます。クロロホルムを 25 μ l 添加、穏やかに混合し、4 ° C で保存
- パッケージ化されたバクテリオファージの 100 μ L と細菌 LE392MP の 100 μ L を追加 (養殖 0.8 - 1.0 10 mm MgSO4追加 LB 培地を使用して) 新しいチューブに。37 ° C で 15 分間インキュベートします。
- (LB 培地 + 0.7% 寒天 + 10 mM MgSO4、48 ° C に冷却) 4 mL oftop 寒天培地に菌ファージ混合物の 200 μ L を追加します。すぐにチューブを数回上下に回してミックスし、予め温めておいた (37 ° C) LB プレート上にそれを注ぐ。
- 37 ° C でプレートを一晩インキュベート、λ ARS317 プラーク PCR を使用して、シーケンス処理の画面です。
- 液体の lysates11,18から DNA 基質浄化
- 200 μ L の滅菌 ddH210 mm MgCl2 O と 10 nM CaCl2に 1 つのプラークを選択します。細菌 LE392MP の 200 μ L (LB 培地で培養一晩) で混合し、37 ° C、15 分インキュベートします。
- NZCYM の 100 mL に菌ファージ混合物を追加 (10 g/L 5 g/L、NZ アミン酵母エキス、5 グラム/L の NaCl、1 g/L カザミノ加水分解、2 g/L MgSO4·7H2O) 中、37 ° C で 7 h の文化文化にクロロホルムの 250 μ L を追加し、別の 10 分間振る。
- 200 mL のフラスコに文化を転送します。NaCl (1 M 最終濃度) の 5.8 グラムを加えて、手で溶解する攪拌氷上で 30 分間インキュベートします。
- 細胞の残骸を削除する 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離機します。200 mL のフラスコに上澄みを収集し、10% PEG8000 (m/V) を追加します。磁気攪拌装置で溶解し、氷上で 30 分間以上インキュベートにかき混ぜます。
- バクテリオファージの沈殿物に 4 ° C で 10 分間の 12,000 × g で遠心分離機します。上澄みを除去します。
- 2 mL のバクテリオファージ希釈バッファーで沈殿物を再懸濁します。15 mL チューブに転送し、10 μ L (終濃度が 20 μ G/ml) RNase の (最終濃度は 5 μ G/ml) DNase の 40 μ L を追加します。37 ° c 30 分間インキュベートします。
- 0.3 2 mL を加える M トリス-HCl (pH 9.0) 100 mM EDTA + 1.25 %sds、15 μ L プロティナーゼ K (最終濃度は 10 μ G/ml)。65 ° C で 10 分間インキュベートします。
- (3 M, pH 4.8)、予冷カリウム酢酸 2 mL を加えて 10 分間氷の上管を孵化させなさい。
- 不溶性物質を削除する 4 ° C で 10 分間 8,000 × g で遠心分離機します。
- 培養上清をイソプロパノール 0.7 x 量を追加します。チューブを数回上下に回して混ぜるし、室温 (RT) で 2 分間インキュベートします。
- DNA を沈殿させる常温 10 分 8,000 × g で遠心分離機します。上澄みを除去します。
- 70% エタノールで 8,000 x g で 10 分間の遠心分離では、上澄みを除去したら DNA を洗浄します。
- 優しく、500 μ L TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) を用いた DNA を溶出し、1.5 mL チューブに DNA を転送します。
- 2 回/フェノールを用いる DNA を抽出: 8,000 g 10 分間遠心分離によってクロロホルム。
- 0.7 x ボリューム イソプロパノールで沈殿させます。回して逆さま管優しく、ダウンし、8,000 × g 10 分間遠心分離機を混ぜます。
- 70% エタノールで 1 回洗浄、TE の 200 μ L で再懸濁します。DNA 濃度を測定し、12.5 μ 因数で-20 ° C で保存します。
2. λ ARS317 DNA ビオチン化
- ビオチン標識オリゴヌクレオチドをリン酸化する (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-ビオチン-3') ネイティブの左の終わりに補足 λ DNA のオリゴヌクレオチドを ddH2O、1 μ L のリガーゼ バッファー x 10 の 7.5 μ L、T4 PNK 0.5 μ の 1 μ L (100 μ M) を追加。3 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。
- Λ ARS317 をリン酸化、λ ARS317 の 12.5 μ g、リガーゼ バッファー x 10 の 3 μ L を追加し、1 μ L の T4 PNK と ddH2O 30 μ L の総ボリュームには 3 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。
- Λ ARS317 とオリゴヌクレオチドをアニールするには、リン酸化オリゴヌクレオチドの 0.5 μ L、ddH2O、リン酸化 λ ARS317 チューブ 10 × リガーゼ バッファーを 25 μ l 添加の 195 μ L を追加します。チューブを逆さま回すことによって穏やかに混合し、65 ° C 5 分ターン、ブロック ヒーターとブロックの 33 ° C 以下にサンプル クールなオフで孵化させなさい。
- Λ ARS317 とオリゴヌクレオチドを縛ること T4 DNA リガーゼの 1 μ L と ATP (200 mM) の 0.63 μ L を追加します。チューブを逆さま回すことによって穏やかに混合し、一晩 2 時間または 4 ° C の室温で孵化させなさい。1 月に 4 ° C で保存します。
注: DNA を破損しないよう、すべての混合手順は優しくピペットを使用して混合ではなく、上下チューブを回すことによって行う必要があります。
3. Coverslip のクリーニングと機能化
- Coverslip クリーニング
- 場所 20 coverslips 4 染色瓶 (5 coverslips/jar) には、エタノールに 30 分間超音波、純水 H2O 3 回と coverslips をすすいでください。
- 1 M 水酸化カリウム (KOH) と 30 分間超音波、純水の H2O 3 回と coverslips をすすいでください。一度島の超音波処理とエタノールを繰り返します。
- 30 分間、アセトンで超音波や超純水 H2O で徹底的に洗い流し (3 回以上)。
注: アセトン必要があります徹底的に洗浄によって除去する純水 H2O、有機溶剤 (アセトン) などが誤ってピラニア ソリューションと混合すると爆発を起こすかもしれないので14。 - ピラニア ソリューション、coverslips に配置 (H2の 3:1 の混合物など4と 30% H2O2) と 95 ° C 1 時間で孵化させなさい。
注: ピラニア ソリューションは非常にエネルギッシュで糜爛ので、注意してください。ピラニアのソリューションを準備しているとき 500 mL ガラス製ビーカーに最初 H2O2の 50 mL を追加し、だから H2の 150 mL を追加4ビーカーにゆっくりと。 - 超純水 H2O coverslips 5 回をすすいでください。超純水 H2O 満ちている超純水 H2O 3 ビーカーを使用して徹底的に各 coverslip を洗浄し、乾燥 coverslip、カバーガラスの端から紙を使用します。染色瓶に、coverslip を置き、30 分間 110 ° C のオーブンで徹底的に coverslip を乾燥します。
- メタノール coverslip のリンスし、coverslip を徹底的に乾燥して 110 ° C のオーブンに染色の jar ファイルを配置します。
注: は、APTES は一度水19存在が可能な表面構造の多くを持っているので非常に重要です、coverslip を徹底的に乾燥します。
- メタノール coverslip のリンスし、coverslip を徹底的に乾燥して 110 ° C のオーブンに染色の jar ファイルを配置します。
- Coverslip の機能化
- シラン溶液 70 mL を追加 (93% メタノールの酢酸、%、2% の 5 APTES) 各瓶にスクリュー キャップと一晩室温で jar を残します。
- 3.1.5、乾燥オーブンでそれらを配置する代わりに窒素ガスを使用して徹底的に coverslips 以外の手順で説明するように、coverslips を乾燥を洗って。
- 徹底的に 1 mL の 0.1 M フレッシュ製 NaHCO3 (pH 8.2) に 150 mg の mPEG (メトキシ - ポリエチレング リコール)、ビオチン ・ ペッグ (ビオチン - ポリエチレング リコール) の 6 mg を溶解します。17 歳の時、遠心分離機、不溶性のペグを削除する 1 分 000 x g。
注: たて NaHCO3準備ができています。その pH を調整する必要はありません。 - ボックスに、シラン処理 coverslips を置き、シラン処理 coverslips の両端の上部にある 2 つの小さな coverslips を置きます。シラン処理 coverslip の中心に PEG 溶液 100 μ L をピペット、上に別のシラン処理 coverslip を配置します。
- 湿気、それを保つためにボックスにいくつか超純水 H2O を追加し、暗闇の中で、少なくとも 3 時間は止め釘の解決と coverslips を孵化させなさい。一晩インキュベートは同様に動作することができます。
- Coverslip のペアを区切るとを機能面を維持、リンス coverslips 超純水 H2O を頻繁に使用して窒素ガスで乾燥させる.
- マーカー ペン保持機能側フェイス アップ、ボックスにそれらを置くし、1 ヶ月間の真空デシケータでボックスを格納を使用してコーナーの 1 つに coverslips の官能の側をマークします。
- 長い時間、coverslips を格納するには、そのキャップに 1 つの穴をドリル 50 mL のチューブに 1 つ coverslip の場所し、チューブをビニール袋に入れ、真空のシーラーを使用して袋をシールします。この方法で、coverslips 格納できます-20 ° C で約 3 カ月。
4. フロー セル ・ アセンブリ
- パンチャーを使用して両面テープ (30 mm × 12 mm) の部分の中央に 15 mm × 2 mm のチャンネルをカットします。
- 紙側の両面テープをはがし、2 つの穴とスライド ガラスに貼り付けます。空気の泡を削除するキーを押します。我々 の経験に基づいて、用紙側両面テープのプラスチック面より剥離で空気の泡を削除する簡単です。
- 官能 coverslip (60 mm × 24 mm) を切り 4 個 (30 mm × 12 mm) ダイヤモンドひっくり返されたガラスを使用して、スクライブし、窒素ガスを使用して残骸を取除きます。機能性を保つために覚えている側が立ち向かいます。
- 両面テープのプラスチック面をはがし、官能の coverslip のスライドを貼り付けます。優しく、coverslip とテープの間の空気の泡を削除するキーを押します。徹底的に空気の泡を削除する一方、バッファーはそれに興奮した漏れからのフロー ・ セルを保護できます。
- それぞれ入口と出口の管を大小の穴に挿入します。エポキシを使用してチューブを修正します。
- 手動で注射器を使用してフロー ・ セルにストレプトアビジン (0.2 mg/mL) の 20 μ L をポンプし、室温で 10 分間インキュベートします。フロー ・ セル、ストレプトアビジンを置き換えるためにポンプ ブロック バッファー10し部屋の温度でそれを維持します。
5. 単一分子の可視化
- 532 nm レーザーと 640 nm のレーザーを使用した同時励起による蛍光顕微鏡テスト スライド #1 の A5 と遠赤の焦点の配置を取得します。(を参照してくださいテーブルの材料) の光学分割とデュアル波長画像を生成します。
- 顕微鏡をフロー ・ セルを配置し、自動注入/撤退プログラム可能なポンプのインストール 10 mL 春と長いチューブ接続するそのアウトレット チューブを接続します。
注: は、フローセルのインレット チューブから注射器にバッファーを引き出す手段を下記のフロー ・ セルにバッファーをポンプします。 - 500 μ L/分ですばやく空気を除去し、フローセル内のバッファーがブロックであることを確認するフロー ・ セルにブロック バッファーをポンプします。フロー ・ セルに 200 μ L/分でブロック バッファーをポンプし、徹底的にインレット チューブとフロー ・ セルから空気の泡を削除するアウトレット チューブを反転します。
メモ: フロー ・ セルに注入されるすべてのバッファーは真空デシケータで使用する前に、少なくとも 15 分間脱する必要があります。 - ブロック バッファーの 80 μ L にビオチン化 λ ARS317 DNA の 0.5 μ L を追加し、2 分の 25 μ L/分でフローセルにポンプします。50 μ L/分の速度で 200 μ L のブロック バッファーを用いた λ ARS317 DNA を洗い流し。
- ポンプのフロー ・ セルのブロック バッファーを削除する 50 μ L/分の速度でバッファー10をバインドを 200 μ l 添加します。
- ストレプトアビジン コーティングした Qdot705 (1 μ M) の 0.2 μ L を追加とビオチン化オークの 0.2 μ L (1.2 μ M)、チューブにし、5 分間室温でインキュベートします。チューブにバッファーをバインドの 20 μ L を追加し、氷の上に置きます。オークした Qdot705の最終濃度は約 10 nM。
- オークした Qdot705の 2 μ L を追加 (10 nM)、地デジ (100 mM) 1 μ L ATP (200 mM) の結合バッファーの 96 μ L に 1 μ L。オークした Qdot705の最終濃度が 0.2 nM。
- フロー ・ セルに 10 μ L/分の速度で 0.2 nM オークした Qdot705の 20 μ L をポンプします。過剰なオークした Qdot705を 100 μ L/分の速度で結合バッファーの 200 μ L を使用して洗い流します。30 nM SYTOX オレンジ色の結合バッファーを 100 μ L/分の速度で dna を染色するフロー ・ セルに、ポンプします。
- オークした Qdot705信号を興奮し、ステンド グラスの SYTOX オレンジ色 405 nm レーザーと 532 nm のレーザーをそれぞれ使用して DNA シグナル。クワッド バンド帯域通過フィルター (ff 01-446/510/581/703-25) を使用して 100 μ L/分の流量で、信号を同時に観測し、フレームあたりが 100 ms の EM CCD による画像を記録します。さまざまな分野から 20 の画像のスタックを収集します。
6. データの分析
- カリフォルニア大学サンフランシスコ校博士ロン ベールのラボが開発したイメージのプラグイン (OI_cut_RGBmerge) に基づいた自分自身で変更する新しいプラグインにフィジーのソフトウェアを使用して画像をトリミング。
- 画像 (256 × 256 ピクセル) の 2 つのスタックに画像 (512 × 512 ピクセル) のスタックをトリミングします。1 つは、532 nm レーザー刺激的な結果および他は、405 nm レーザー エキサイティングな結果。
- フィジー-イメージ-スタック-Z プロジェクト (平均強度) を用いた 61 映像を処理します。
- メジャー (LDNA) DNA と DNA のオークした Qdot705 (Lオーク) バインディングのサイトから DNA のまでの距離の長さは手動で終了を係留しました。
- Lオーク/LDNAの結果を計算するを使用して excel、r、ブートス トラップ法を用いたデータ分析、ヒストグラムを作成し、ガウス分布に適合。
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Representative Results
初めてした Qdot というラベルの付いたオークと、アルスの相互作用を視覚化するには、λ ARS317 DNA 基板を構築します。ARS317 を含んでいる DNA のフラグメントは統合されたXhoに私は (図 1 a) の相同組み換えによるネイティブ λ DNA の (33.5 kb) をサイトします。遺伝子組み替え品はエキスを使用してパッケージ化され、パッケージ化されたバクテリオファージの粒子は LB プレート (図 1 b) で培養しました。肯定的な phage プラークは PCR によって選別され、(図 1) の配列によって確認します。Λ ARS317 DNA は液体の溶解液 (図 1) から精製した.
単一分子イメージング法は目的型観察セットアップ (図 2) で実施されました。ほぼ 1:1 のモル比でビオチン オークの分類によってストレプトアビジン コーティング Qdots λ ARS317 テザーのフロー ・ セルにした Qdot というラベルの付いたオークが急速に励起されました。DNA には、SYTOX オレンジのしみについていた。観察 (図 3 a-3 C) を同時に使用した Qdot というラベルの付いたオークと SYTOX オレンジ染色 DNA の信号をイメージしました。Λ ARS317 オークの分布を決定する画像のスタックは、2 つのスタックに分かれていた: DNA シグナルとオーク信号手順 (図 3 b) 6.1 で説明した他のスタックの 1 つのスタック。位置 (kb)、数式に基づいて = (Lオーク/LDNA) × 50 kb (図 3 D) 273 曲率解析をしたオークした Qdot705 168 dna 分子の位置をバインドします。オークした Qdot705が特別バインド データを示した(図 3E) 明らかに高い豊富な挿入 ARS317 サイトで。一方、オークした Qdot705にも中高前研究10の結果と一致している λ DNA の自由な端にある AT リッチ領域にバインドします。
高品質画像の取得は、ラベリングのアッセイで蛋白質および Qdots のモル比に依存します。過剰な Qdots は蛋白質の効率の分類のために良いかもしれませんが、バック グラウンド ノイズを作成することができます。ビオチン標識ストレプトアビジン コーティング Qdots 1:3 モル比でオークをラベリングしながら図 4で示すように、バック グラウンド ノイズが増加しました。したがって、ストレプトアビジン コーティング Qdots にビオチン化タンパク質の適切なモル比を選択する重要です。
図 1: λ ARS317 DNA 基板の作製します。(A) λ ARS317 建設のイラスト。ARS317 DNA 断片は相同組換えによる λ DNA に統合されました。(B)プラク LB 固体培地に。それらの 3 つは、黒い矢印を使用してマークされました。(C) λ ARS317 プラークは PCR を使用して識別されます。(左)マーカー、(中央) ネイティブ λ DNA (右) λ ARS317 のプラーク。(D)精製された λ ARS317 DNA は 0.6% アガロース電気泳動によって検出されました。(左)マーカー、(中央) ネイティブ λ DNA (右) は、λ ARS317 を精製しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 目的型全反射と流れ電池の図式的な概観します。単一分子イメージングの試金は流れ電池システムと組み合わせて観察に基づいて行われました。石油目的 X 60 装備倒立顕微鏡の観察を行った (開口数 = 1.49)。DNA (灰色の線) ストレプトアビジン-ビオチン連携フロー ・ セルの coverslip のテザー、右に左からフローに拡大します。テザーの DNA に蛋白質の結合は、楕円形の赤ドットで示されていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: した Qdot705-オーク (1:1 のモル比) λ ARS317 のバインドを表示します。(A)オークと λ ARS317 の DNA が同時に認められました。(top)SYTOX オレンジ色のステンド グラスの DNA は、532 nm のレーザーを使用して、クワッド バンド帯域通過フィルターの 550 613 nm の透過帯域を用いて観察に興奮していた。(下)した Qdot705-ラベル付きオーク 405 nm のレーザーを使用して興奮していたし、クワッド バンド帯域通過フィルターの 663 743 nm の透過帯域を用いて観察します。(B) 2 つの 256 × 256 サブ スタックは元の 512 × 512 スタックから切り取られました。(C)対応するスタックの 61 の連続フレームを使用して取得した画像。(左)SYTOX オレンジ染色 DNA、(中央) した Qdot705-オーク、(右) の結合されたイメージをラベル3 つした Qdot705-λ ARS317 DNA 基板上への ARS317 のサイトでラベル付けされたオーク バインドは、黒い矢印を使用してマークされました。オークの dna 結合部位の計算の(D)のイラスト。LDNA DNA の長さ、Lオークはオークからの距離を意味します DNA のテザーの端に結合 DNA のサイト。(E) λ ARS317 DNA ヒストグラムのオーク バインド分布。データに合わせてガウスは、赤の実線を使用して示されました。誤差範囲は、1000 ブートス トラップ サンプルに基づく 95% 信頼区間を示します。N は、オークの分子の数を意味します。挿入 ARS317 サイトは、黒い矢印を使用して示唆されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: λ ARS317 にした Qdot というラベルの付いたオーク バインド (3:1 のモル比).オークと λ ARS317 の DNA は、図 3 aのように同じ方法で観察されました。(左)SYTOX オレンジ色のステンド グラスの DNA は、532 nm のレーザーを使用して興奮していた。(中央)405 nm のレーザーを使用した Qdot というラベルの付いたオークは興奮しました。(右) イメージをマージします。Λ ARS317 DNA 基板上への ARS317 サイトで 2 つのした Qdot というラベルの付いたオーク バインドは、黒い矢印を使用してマークされました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、した Qdot 標識タンパク質およびフロー セル内の観察を使用して site-specifically 変更された λ DNA 間の相互作用を観察するためのプロトコルを提案する.必要な手順には DNA 基板、ビオチン化 DNA、coverslip 洗浄し高機能化、フロー セル準備、および単一分子イメージング サイト固有の変更が含まれます。注意すべき 2 つの重要なポイントがあります。まず、すべての λ DNA と手順は、例えば、任意の可能な被害を減らすため優しく操作する必要があります繰り返し上下にピペッティングにより混合を避けること。第二に、非常に、coverslip がそのバック グラウンド ノイズを最小限に抑えるため十分にきれいであることを確認することが重要です。Coverslip のクリーニングと機能化プロセス中に水超純水レベルに到達する必要があり、空気であるべきほこり無料します。Coverslip の高機能化・ クリーン ベンチのフロー セル ・ アセンブリを行うことをお勧めします。
蛋白質 DNA 相互作用を研究するため単一分子アッセイ、λ DNA はいくつかの利点20適切な基板です。Λ DNA は簡単に観察でき、単一の分子の実験でそれをタンパク質の運動を記録を許可するのに十分な長さです。また、ssDNA のオーバー ハングは、ガラス基盤に λ DNA をテザリングのため多くのデザインを許可します。本研究では λ DNA の特定のサイトに外因性 DNA のフラグメントを挿入するための手法を提案します。したがって、さまざまなユーザー定義可能な DNA 断片は、λ DNA に統合できます。変更された λ DNA は、単一分子研究のため大量に液体の lysates から便利に浄化することが。
ストレプトアビジン コーティングした Qdot のアッセイをラベリングした Qdot ナノあたり約 5-10 streptavidins があるために正確にラベル付けの効率を評価することは困難です。したがって、ストレプトアビジン コーティング Qdots とビオチン化タンパク質の適切なモル比を最適化して、実験でください。1:1 のモル比は、参照することができます。
安定性の高い写真、写真漂白法に適したのでした Qdot 正確な定量的試金で使用できないことに注意してください。Qdots の高い安定性は、定量的アッセイへの応用を制限、簡単な観察と長年追跡5ができます。増加する生物学、単一分子蛍光顕微鏡のアプリケーション プロトコルについて述べると将来的に DNA の代謝のメカニズムの解明に資する大幅。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は博士・ ハサン ・ Yardimci に感謝し、種類のフランシスの Crick 研究所の Dr.Sevim Yardimci は、単一分子の実験博士ダニエル Duzdevich、コロンビア大学の博士エリック ・ グリーンの研究室から北京大学の博士タマ太陽との Chunlai ドクター有用な議論の清華大学。本研究は、国家自然科学基金、中国の 31371264、31401059、CA 学際的革新チームと、ニュートン高度な交わり (NA140085) 英国王立協会からによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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