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Biology

Qdot-लेबल प्रोटीन और साइट के बीच बातचीत visualizing-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए एकल अणु स्तर पर

Published: July 17, 2018 doi: 10.3791/57967
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक साइट का उपयोग कर कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) द्वारा डीएनए-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए सब्सट्रेट और एक क्वांटम-डॉट लेबल प्रोटीन.

Abstract

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ने एकल अणु स्तर पर जटिल जैविक प्रक्रियाओं के तंत्र को विदारक करने में बड़ा योगदान दिया है. डीएनए का अध्ययन करने के लिए एक अणु परख में प्रोटीन बातचीत, वहां विचार के लिए दो महत्वपूर्ण कारक हैं: आसान अवलोकन के लिए पर्याप्त लंबाई के साथ डीएनए सब्सट्रेट और एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ एक प्रोटीन लेबल । ४८.५ kb λ डीएनए सब्सट्रेट के लिए एक अच्छा उंमीदवार है । क्वांटम डॉट्स (Qdots), फ्लोरोसेंट जांच के एक वर्ग के रूप में, लंबे समय तक अवलोकन (घंटे के लिए मिनट) और उच्च गुणवत्ता छवि अधिग्रहण की अनुमति देते हैं । इस पत्र में, हम डीएनए का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित एकल-अणु स्तर पर प्रोटीन बातचीत, जो एक साइट की तैयारी भी शामिल है-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए और लेबलिंग streptavidin-लेपित Qdots के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन । अवधारणा का एक सबूत के लिए, हम ORC का चयन (मूल मांयता परिसर) में रुचि के एक प्रोटीन के रूप में नवोदित खमीर और एक ARS (autonomously नकल अनुक्रम) TIRFM का उपयोग कर के साथ अपनी बातचीत कल्पना । अंय फ्लोरोसेंट जांच के साथ तुलना में, Qdots एक अणु photobleaching के खिलाफ उच्च स्थिरता के कारण अध्ययन में स्पष्ट लाभ है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस संपत्ति मात्रात्मक परख में अपने आवेदन सीमा ।

Introduction

प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत ऐसे डीएनए प्रतिकृति के रूप में कई जटिल जैविक प्रक्रियाओं, के लिए आवश्यक हैं, डीएनए की मरंमत, और प्रतिलेखन । हालांकि पारंपरिक दृष्टिकोण इन प्रक्रियाओं के गुणों पर प्रकाश डाला है, कई प्रमुख तंत्र अभी भी अस्पष्ट हैं । हाल ही में, तेजी से एक अणु तकनीक के विकास के साथ, तंत्र के कुछ1,2,3को संबोधित किया गया है ।

प्रोटीन visualizing पर एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आवेदन-वास्तविक समय में डीएनए बातचीत मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति का पता लगाने और फ्लोरोसेंट जांच के विकास पर निर्भर करता है । एक एकल अणु अध्ययन के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच के साथ ब्याज की प्रोटीन लेबल प्रतिदीप्ति का पता लगाने प्रणालियों ज्यादातर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन सामांयतः आणविक जीवविज्ञान में उपयोग किया जाता है । हालांकि, कम फ्लोरोसेंट चमक और photobleaching के खिलाफ स्थिरता कई एकल अणु परख में अपने आवेदन को सीमित । क्वांटम डॉट्स (Qdots) छोटे प्रकाश उत्सर्जक नैनोकणों4। उनके अद्वितीय ऑप्टिकल संपत्तियों के कारण, Qdots 10-20 बार उज्जवल और कई हजार बार व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कार्बनिक रंजक5से अधिक स्थिर हैं । इसके अलावा, Qdots एक बड़े स्टोक्स बदलाव (उत्तेजना और उत्सर्जन चोटियों की स्थिति के बीच अंतर)5है । इस प्रकार, Qdots लंबे समय तक अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (घंटे के लिए मिनट) और उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ छवियों का अधिग्रहण, जबकि वे मात्रात्मक परख में उपयोग नहीं किया जा सकता.

तारीख करने के लिए, वहाँ दो दृष्टिकोण Qdots साइट के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन लेबल करने के लिए कर रहे हैं-विशेष रूप से: Qdot की सहायता से लेबलिंग-संयुग्मित प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी6,7,8; या सीधे Qdots के साथ लक्ष्य प्रोटीन लेबलिंग, जो बायोटिन और streptavidin9,10,11,12,13के बीच मजबूत बातचीत पर आधारित है । Streptavidin-लेपित Qdots व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । हमारे हाल के अध्ययन में, साइट-विशेष रूप से उच्च दक्षता के साथ नवोदित खमीर में biotinylated प्रोटीन बिरा के सह-व्यक्त और Avi-10 vivo मेंप्रोटीन टैग द्वारा शुद्ध थे । निंनलिखित और एकल अणु14,15,16,17के अनुकूलन के द्वारा, हम Qdot के बीच बातचीत मनाया प्रोटीन और डीएनए एकल अणु स्तर पर लेबल का उपयोग TIRFM10.

यहां, हम नवोदित खमीर मूल मांयता परिसर (ORC) है, जो विशेष रूप से पहचान और autonomously नकल अनुक्रम (ARS) के लिए बाध्य कर सकते हैं, हमारे हित के प्रोटीन के रूप में चुनें । निंनलिखित प्रोटोकॉल TIRFM का उपयोग ARS के साथ Qdot-लेबल ORC की बातचीत visualizing के एक कदम दर कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करता है । साइट की तैयारी-विशेष रूप से संशोधित डीएनए सब्सट्रेट, डीएनए biotinylation, द coverslip क्लीनिंग एण्ड functionalization, फ्लो-सेल असेंबली, और सिंगल-अणु इमेजिंग बताई गई हैं ।

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Protocol

1. λ-ARS317 डीएनए सब्सट्रेट की तैयारी

  1. डीएनए सब्सट्रेट निर्माण और पैकेजिंग
    1. डाइजेस्ट देशी λ डीएनए Xhoमैं एंजाइम का उपयोग; बढ़ाना एक ५४३ बीपी डीएनए टुकड़ा असर ARS317 नवोदित खमीर के जीनोमिक डीएनए से ऊपर और Xhoमैं लैंब्डा डीएनए पर एंजाइम साइट के ऊपर के 20 बीपी मुताबिक़ दृश्यों युक्त प्राइमरों का उपयोग कर । जोड़ें १०० Xhoके एनजी मैं λ डीएनए और 10 डीएनए टुकड़ा के एनजी मुताबिक़ पुनर्संयोजन प्रतिक्रिया प्रणाली के 10 µ एल को पचा, और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मशीन ।
    2. recombination λ डीएनए पैकेज, recombination उत्पाद में लैंब्डा पैकेजिंग निष्कर्षों के 25 µ एल जोड़ने के लिए, और ९० मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया गर्मी । फिर, प्रतिक्रिया ट्यूब में लैंब्डा पैकेजिंग निष्कर्षों के एक अतिरिक्त 25 µ एल जोड़ें । ९० मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया की मशीन जारी रखें ।
    3. (10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.३), १०० मिमी NaCl, 10 मिमी MgCl2) की प्रतिक्रिया प्रणाली में बाँझ कमजोर पड़ने बफर के ५०० µ एल जोड़ें, और कई बार नीचे ट्यूब उल्टा मोड़ से धीरे मिश्रण. क्लोरोफॉर्म के 25 µ एल जोड़ें, धीरे से मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    4. पैकेज्ड फेज और १०० µ एल के १०० µ एल जोड़ें (०.८-१.० का उपयोग पौंड मध्यम 10 मिमी MgSO4के साथ जोड़ने) एक नई ट्यूब में (कल्चरल) LE392MP । 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    5. फेज-जीवाणु मिश्रण के २०० µ एल जोड़ें 4 मिलीलीटर oftop आगर में (पौंड मध्यम + ०.७% आगर + 10 मिमी MgSO4, ४८ ° c करने के लिए ठंडा) । ट्यूब उल्टा कई बार नीचे मोड़ और यह एक पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) पौंड प्लेट पर डाल द्वारा तुरंत मिलाएं ।
    6. रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली गर्मी और पीसीआर और अनुक्रमण का उपयोग कर λ-ARS317 पट्टिका स्क्रीन ।
  2. डीएनए सब्सट्रेट शुद्धि से तरल lysates11,18
    1. 10 मिमी MgCl2 और 10 एनएम CaCl2के साथ बाँझ ddH2ओ के २०० µ एल में एक पट्टिका उठाओ । बैक्टीरिया LE392MP के २०० µ एल के साथ मिश्रण (पौंड के माध्यम में रातोंरात संस्कृति), और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    2. NZCYM (10 ग्राम/L NZ-अमीन, के १०० मिलीलीटर में फेज-जीवाणु मिश्रण जोड़ें 5 g/l खमीर निकालने, 5 g/l NaCl, 1 g/l Casamino Hydrolysate, और 2 g/l MgSO4· 7H2O) मध्यम और संस्कृति 7 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एच । संस्कृति में क्लोरोफॉर्म के २५० µ एल जोड़ें और एक और 10 मिनट के लिए हिला ।
    3. एक २०० मिलीलीटर कुप्पी में संस्कृति स्थानांतरण । जोड़ें ५.८ NaCl के जी (1 एम अंतिम एकाग्रता), को हाथ से भंग हलचल, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x जी पर केंद्रापसारक सेल मलबे को दूर करने के लिए । एक २०० मिलीलीटर कुप्पी में supernatant लीजिए और 10% खूंटी८००० (एम/वी) जोड़ें । हलचल चुंबकीय सरगर्मी तंत्र द्वारा भंग और 30 मिनट या अधिक समय के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    5. १२,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक भोजी हाला । supernatant निकालें ।
    6. फेज कमजोर पड़ने बफर के 2 मिलीलीटर में हाला resuspend । यह एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण और RNase के 10 µ एल जोड़ने (अंतिम एकाग्रता है 20 µ जी/एमएल) और ४० µ एल के DNase (अंतिम एकाग्रता है 5 µ g/एमएल) । 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    7. ०.३ एम Tris-एचसीएल (pH ९.०), १०० mM EDTA + १.२५% एसडीएस, 15 µ l proteinase K (अंतिम एकाग्रता है 10 µ g/ 10 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन ।
    8. पूर्व ठंडा पोटेशियम एसीटेट के 2 मिलीलीटर जोड़ें (3 एम, पीएच ४.८), और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब गर्मी ।
    9. के लिए ८,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में अघुलनशील सामग्री को दूर करने के लिए ।
    10. supernatant में isopropanol के 0.7 x वॉल्यूम जोड़ें । ट्यूब उल्टा कई बार नीचे मोड़ से मिक्स, और कमरे के तापमान (आरटी) में 2 मिनट के लिए मशीन ।
    11. 10 मिनट के लिए आरटी में ८,००० x जी पर केंद्रापसारक डीएनए हाला । supernatant निकालें ।
    12. 10 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा ७०% इथेनॉल के साथ एक बार डीएनए धो लें । supernatant निकालें ।
    13. Elute ५०० µ एल ते बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA, पीएच ८.०) धीरे से उपयोग कर डीएनए, और १.५ मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए हस्तांतरण ।
    14. दो बार phenol का उपयोग कर डीएनए: क्लोरोफॉर्म द्वारा ८,००० g पर 10 मिनट के लिए निकालें ।
    15. 0.7 x मात्रा isopropanol के साथ हाला । ट्यूब उल्टा धीरे नीचे मोड़ से मिक्स, और 10 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    16. ७०% इथेनॉल के साथ एक बार धो, ते के २०० µ एल में resuspend । डीएनए एकाग्रता को मापने, और में स्टोर-20 ° c १२.५ µ g aliquots.

2. λ-ARS317 डीएनए Biotinylation

  1. करने के लिए phosphorylate biotinylated oligonucleotides (5 '-AGGTCGCCGCC-TEG-बायोटिन-3 ') देशी λ डीएनए के बाएं छोर के पूरक, जोड़ें 1 µ l (१०० µ m) की oligonucleotides, ७.५ µ l की ddH2O, 1 µ l की 10x ligase बफर, और टी-4 µ के ०.५ PNK l. 3 एच के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
  2. करने के लिए phosphorylate λ-ARS317, जोड़ें १२.५ µ जी के λ-ARS317, 3 µ एल के 10x ligase बफर, टी-4 µ के 1 PNK एल, और ddH2ओ की कुल मात्रा 30 µ एल के लिए 3 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ।
  3. λ-ARS317 के साथ ऐनी oligonucleotides करने के लिए, phosphorylated oligonucleotides-µ ट्यूब में 10 × ddH बफर के25 µ एल ligase के phosphorylated, १९५ λ एल के ०.५ µ एल जोड़ें । ट्यूब उल्टा मोड़ और 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन से धीरे मिश्रण । ब्लॉक हीटर बंद करें, और नमूना ३३ डिग्री सेल्सियस से नीचे ब्लॉक करने के लिए शांत करते हैं ।
  4. λ-ARS317 के साथ oligonucleotides ligate करने के लिए, टी-4 डीएनए µ के 1 ligase एल और एटीपी (२०० मिमी) के ०.६३ µ एल जोड़ें । ट्यूब उल्टा मोड़ और 2 ज या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी से धीरे मिश्रण । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: डीएनए को तोड़ने से बचने के लिए, सभी मिश्रण कदम धीरे ट्यूब उल्टा मोड़ द्वारा किया जाना चाहिए, बजाय पिपेट का उपयोग कर मिश्रण की.

3. Coverslip सफाई और Functionalization

  1. Coverslip सफाई
    1. 4 दाग जार में 20 coverslips प्लेस (5 coverslips/जार), इथेनॉल में 30 मिनट के लिए sonicate, और कुल्ला ultrapure एच2ओ 3 बार के साथ coverslips ।
    2. 1 M पोटेशियम हीड्राकसीड (कोह) के साथ 30 मिनट के लिए Sonicate, और ultrapure एच2ओ 3 बार के साथ coverslips कुल्ला । इथेनॉल और KOH sonication एक बार दोहराएं ।
    3. 30 मिनट के लिए एसीटोन के साथ Sonicate, और फिर ultrapure एच2ओ के साथ अच्छी तरह से कुल्ला (ंयूनतम 3 बार) ।
      नोट: एसीटोन ultrapure एच2ओ के साथ धोने के द्वारा अच्छी तरह से हटाया जाना चाहिए, क्योंकि यह एक विस्फोट के कारण हो सकता है जब कार्बनिक विलायक (जैसे एसीटोन) के साथ मिश्रित पिरांहा समाधान गलती से14.
    4. पिरांहा समाधान में coverslips प्लेस (एच2के 3:1 मिश्रण तो4 और 30% एच2ओ2) और 1 एच के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: पिरांहा समाधान अत्यधिक ऊर्जावान और कटाव है, इसलिए सावधानी के साथ प्रयोग करें । पिरांहा सॉल्यूशन तैयार करते समय, एच2ओ2 के ५० मिलीलीटर को एक ५०० मिलीलीटर ग्लास यूरिन में डालें, और उसके बाद एच2के १५० मिलीलीटर को फिर4 बार चोंच में डालें ।
    5. ultrapure एच2ओ के साथ coverslips कुल्ला 5 बार । फिर प्रत्येक coverslip को ultrapure एच2ओ के साथ अच्छी तरह से धोकर ultrapure एच2ओ से भरे 3 यूरिन का प्रयोग करें और coverslip के किनारे से कागज का प्रयोग करते हुए coverslip को सुखा लें । दाग जार में coverslip प्लेस और 30 मिनट के लिए एक ११० डिग्री सेल्सियस ओवन में अच्छी तरह से सूखी coverslip ।
      1. मेथनॉल के साथ coverslip कुल्ला और ११० डिग्री सेल्सियस ओवन में दाग जार फिर से coverslip अच्छी तरह से शुष्क करने के लिए जगह है ।
        ध्यान दें: coverslip अच्छी तरह से सुखाने बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि APTES संभव सतह संरचनाओं के बहुत सारे होगा एक बार यह19पानी की उपस्थिति में है ।
  2. Coverslip functionalization
    1. प्रत्येक जार में ७० मिलीलीटर silane समाधान (९३% मेथनॉल, 5% एसिटिक, और 2% APTES) जोड़ें, टोपी पेंच और रात भर कमरे के तापमान पर जार छोड़ दें ।
    2. coverslips के रूप में चरण 3.1.5 में वर्णित के रूप में सूखे को धो और सूखी coverslips अच्छी तरह से उंहें ओवन में रखने के बजाय नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर ।
    3. भंग १५० एमपीईजी के मिलीग्राम (methoxy-पॉलीथीन ग्लाइकोल) और 6 मिलीग्राम बायोटिन-खूंटी (बायोटिन-पॉलीथीन ग्लाइकोल) के 1 मिलीलीटर में ०.१ एम ताजा-बनाया NaHCO3 (पीएच ८.२) अच्छी तरह से । फिर अघुलनशील खूंटे को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए 17, 000 x g पर केंद्रापसारक ।
      नोट: हौसले से बनाया NaHCO3 तैयार है; इसके पीएच को एडजस्ट करने की कोई जरूरत नहीं है ।
    4. silanized coverslips को बक्से में रखें, और दो छोटे coverslips को silanized coverslips के दो सिरों के ऊपर रखें । पिपेट १०० silanized coverslip के केंद्र पर खूंटी समाधान के µ एल, और शीर्ष पर एक और silanized coverslip जगह है ।
    5. यह आर्द्र रखने के लिए बॉक्स में कुछ ultrapure एच2ओ जोड़ें, और अंधेरे में कम से कम 3 ज के लिए खूंटी समाधान के साथ coverslips की मशीन । एक रात की मशीन के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं ।
    6. coverslip जोड़े को अलग करें और कार्यात्मक सतह को आमने-सामने रखें, coverslips को बड़े पैमाने पर ultrapure एच2ओ का प्रयोग करके कुल्ला करें, और उन्हें नाइट्रोजन गैस से सुखा लें ।
    7. एक मार्कर पेन का उपयोग कर कोनों में से एक पर coverslips के कार्यात्मक पक्ष मार्क, कार्यात्मक पक्ष चेहरा ऊपर रखने के लिए, बक्से में उन्हें जगह और 1 महीने के लिए निर्वात desiccator में बक्से की दुकान.
    8. एक लंबे समय के लिए coverslips स्टोर करने के लिए, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक coverslip जगह अपनी टोपी पर एक छेद के साथ drilled, तो एक प्लास्टिक की थैली में ट्यूब डाल दिया, और एक वैक्यूम मुहर का उपयोग कर बैग सील । इस तरह, coverslips-20 ° c के बारे में 3 महीने में संग्रहित किया जा सकता है ।

4. फ्लो सेल असेंबली

  1. डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा के केंद्र में एक 15 मिमी × 2 मिमी चैनल में कटौती (30 मिमी × 12 मिमी) एक घूंसे का उपयोग कर.
  2. डबल पक्षीय टेप के कागज की ओर से छील और यह दो छेद के साथ गिलास स्लाइड पर पेस्ट करें । एयर बुलबुले को हटाने के लिए दबाएँ । हमारे अनुभव के आधार पर, यह डबल पक्षीय टेप के प्लास्टिक की ओर से कागज की ओर से छीलने से हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए आसान है ।
  3. एक कार्यात्मक coverslip कटौती (६० मिमी × 24 मिमी) चार टुकड़ों (30 मिमी × 12 मिमी) में एक हीरे की इत्तला दे दी गिलास मुंशी का उपयोग कर, और नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर मलबे को हटा दें । कार्यात्मक पक्ष चेहरा ऊपर रखने के लिए याद रखें ।
  4. डबल-पक्षीय टेप के प्लास्टिक की ओर से छील करें, और स्लाइड को कार्यशील coverslip पर चिपकाएं । coverslip और टेप के बीच हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए धीरे दबाएँ. हवा के बुलबुले को हटाने अच्छी तरह से प्रवाह सेल लीक से रक्षा कर सकते हैं, जबकि बफ़र्स में यह पंप थे ।
  5. डालें प्रवेश और छोटे और बड़े छेद में आउटलेट टयूबिंग, क्रमशः । epoxy का उपयोग कर टयूबिंग फिक्स ।
  6. पंप 20 µ streptavidin के एल (०.२ मिलीग्राम/फ्लो सेल में एक सिरिंज का उपयोग कर मैंयुअल रूप से और आर टी पर 10 मिनट के लिए मशीन । फिर streptavidin बदलने के लिए फ्लो सेल में10 बफर अवरुद्ध पंप, और कमरे के तापमान पर रखने के लिए ।

5. एकल अणु दृश्य

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप परीक्षण स्लाइड पर A5 के साथ लाल और दूर-लाल के फोकल संरेखण प्राप्त करें #1 एक साथ उत्तेजना एक ५३२ एनएम लेजर और एक ६४० एनएम लेजर का उपयोग करके । विभाजन प्रकाशिकी के साथ दोहरी तरंग दैर्ध्य छवियों का उत्पादन ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. माइक्रोस्कोप पर फ्लो सेल प्लेस और एक लंबे समय एक 10 मिलीलीटर एक स्वचालित अर्क/आहरण प्रोग्राम पंप पर स्थापित वसंत के साथ जोड़ने के लिए अपनी दुकान टयूबिंग कनेक्ट ।
    नोट: नीचे उल्लेख किया प्रवाह कोशिका में पम्पिंग बफ़र्स सिरिंज के लिए प्रवाह कोशिका के प्रवेश टयूबिंग से बफ़र्स वापस लेने का मतलब है.
  3. पंप ब्लॉकिंग बफर पर ५०० µ l/मिनट प्रवाह सेल में जल्दी से हवा को हटाने और सुनिश्चित करें कि प्रवाह कक्ष में बफर जुदा है । तो प्रवाह सेल में २०० µ l/मिनट में अवरुद्ध बफर पंप और प्रवेश टयूबिंग और फ्लो सेल अच्छी तरह से हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए आउटलेट टयूबिंग फ्लिप ।
    ध्यान दें: सभी प्रवाह सेल में पंप बफ़र्स एक निर्वात desiccator में degassed का उपयोग करने से पहले कम से 15 मिनट के लिए किया जाना चाहिए ।
  4. जोड़ें ०.५ µ biotinylated λ के एल-ARS317 डीएनए में ८० µ ब्लॉक बफर के एल, और यह पंप पर प्रवाह सेल में 25 µ l/ फिर फ्लश λ-ARS317 डीएनए का उपयोग २०० µ एल अवरुद्ध बफर की दर से ५० µ l/
  5. पम्प २०० µ l बाइंडिंग बफ़र10 की दर से ५० µ l/प्रवाह कक्ष में अवरोध बफ़र को निकालने के लिए ।
  6. जोड़ें ०.२ µ के streptavidin-लेपित Qdot७०५ (1 µ m) और ०.२ µ एल के biotinylated ORC (१.२ µ मीटर) एक ट्यूब में, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । फिर ट्यूब में बाध्यकारी बफर के 20 µ एल जोड़ें, और यह बर्फ पर जगह है । ORC-Qdot७०५ के अंतिम एकाग्रता के बारे में 10 एनएम है ।
  7. जोड़ें 2 µ l of ORC-Qdot७०५ (10 एनएम), 1 µ l की डीटीटी (१०० mm), 1 µ l के एटीपी (२०० mm) में ९६ µ l बाइंडिंग बफ़र. ORC-Qdot७०५ की अंतिम एकाग्रता ०.२ एनएम है ।
  8. पम्प 20 µ l की ०.२ एनएम ORC-Qdot७०५ की दर से 10 µ l/न्यूनतम फ्लो सेल में. अत्यधिक ORC से बाहर फ्लश-Qdot७०५ २०० µ l का उपयोग कर बाइंडिंग बफ़र की दर पर १०० µ l/ फिर प्रवाह सेल में 30 एनएम SYTOX ऑरेंज के साथ बाध्यकारी बफर पंप १०० µ एल की दर से डीएनए सब्सट्रेट दाग/
  9. ORC-Qdot७०५ संकेत और SYTOX नारंगी सना हुआ डीएनए एक ४०५ एनएम लेजर और ५३२ एनएम लेजर, क्रमशः का उपयोग कर संकेत उत्तेजित । एक ट्रैक्टर-बैंड bandpass फ़िल्टर (FF01-446/510/581/703-25) का उपयोग कर १०० µ l/न्यूनतम प्रवाह के साथ एक साथ संकेतों को देखें और फ्रेम प्रति १०० एमएस के साथ उन्हें सीसीडी द्वारा छवियों रिकॉर्ड । विभिंन क्षेत्रों से 20 छवि ढेर लीजिए ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. फसल एक नया प्लगइन है, जो खुद द्वारा संशोधित है के साथ फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को छवि प्लगइन (OI_cut_RGBmerge) के आधार पर विश्वविद्यालय के कैलिफोर्निया, सैन फ्रांसिस्को में डॉ रॉन है घाटी लैब द्वारा विकसित की है ।
    1. छवि (२५६ × २५६ पिक्सल) के दो ढेर में छवियों के ढेर (५१२ × ५१२ पिक्सल) फसल । एक एक ५३२ एनएम लेजर रोमांचक परिणाम है, और दूसरे एक ४०५ एनएम लेजर रोमांचक परिणाम है ।
  2. प्रक्रिया ६१ क्रमिक छवियों फिजी-छवि-स्टैक्स-Z प्रोजेक्ट (औसत तीव्रता) का उपयोग कर ।
  3. डीएनए की लंबाई (एलडीएनए) और ORC की साइट से दूरी-Qdot७०५ (एलORC) डीएनए को मैंयुअल रूप से सीमित अंत के लिए बाध्यकारी उपाय ।
  4. के परिणाम की गणना LORC/Lडीएनए excel का उपयोग कर, R द्वारा बूटस्ट्रैप विधि का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें, और फिर हिस्टोग्राम और फ़िट गाऊसी वितरण बनाएँ ।

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Representative Results

Qdot-ORC और ARS लेबल के बीच बातचीत कल्पना, हम पहले λ-ARS317 डीएनए सब्सट्रेट का निर्माण किया । एक डीएनए ARS317 युक्त टुकड़ा मुताबिक़ पुनर्संयोजन (आंकड़ा 1a) द्वारा देशी λ डीएनए के Xhoमैं साइट (३३.५ kb) में एकीकृत किया गया था । पुनर्संयोजन उत्पाद निष्कर्षों का उपयोग कर पैक किया गया था और पैक फेज कणों पौंड प्लेटों (आंकड़ा 1b) पर कल्चरित थे । सकारात्मक फेज पट्टिका पीसीआर द्वारा जांच की और अनुक्रमण (चित्रा 1C) द्वारा की पुष्टि की थी । λ-ARS317 डीएनए तरल lysates (चित्रा 1 डी) से शुद्ध किया गया था ।

एकल अणु इमेजिंग परख उद्देश्य-प्रकार TIRFM सेट अप (चित्रा 2) पर किए गए । एक लगभग 1:1 दाढ़ अनुपात streptavidin के साथ biotinylated ORC-लेपित Qdots तेजी से लेबल, Qdot-लेबल ORC λ-ARS317 tethered प्रवाह सेल में पंप था । डीएनए SYTOX ऑरेंज का उपयोग दाग था । Qdot के संकेतों-लेबल ORC और SYTOX-नारंगी दाग डीएनए समवर्ती TIRFM (3 ए-3डी) का उपयोग कर छवि थे । λ-ARS317 पर ORC के वितरण का निर्धारण करने के लिए, इमेजिंग स्टैक दो स्टैक में अलग किया गया था: एक डीएनए संकेत के ढेर और अंय ORC संकेत के ढेर के रूप में ६.१ कदम (चित्र बी) में वर्णित है । सूत्र के आधार पर, स्थिति (kb) = (एलORC/Lडीएनए) × 50kb (चित्रा 3 डी), ORC के २७३ बाध्यकारी पदों-Qdot७०५ अणुओं पर १६८ डीएनए सब्सट्रेट quantitively विश्लेषण किया गया. आंकड़ों से पता चला है कि ORC-Qdot७०५ विशेष रूप से एक स्पष्ट रूप से उच्च बहुतायत (चित्रा 3E) के साथ साइट डाला ARS317पर बांधता है । इस बीच, ORC-Qdot७०५ भी मध्यम और λ डीएनए है, जो पिछले अध्ययन10के परिणामों के अनुरूप है के मुक्त अंत में स्थित पर अमीर क्षेत्रों पर बांधता है ।

उच्च गुणवत्ता छवि अधिग्रहण लेबल परख में प्रोटीन और Qdots के दाढ़ अनुपात पर निर्भर करता है । अत्यधिक Qdots प्रोटीन लेबलिंग दक्षता के लिए अच्छा हो सकता है, लेकिन वे पृष्ठभूमि शोर बना सकते हैं । के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है, जबकि 1:3 दाढ़ अनुपात में streptavidin-लेपित Qdots के साथ biotinylated ORC लेबल, पृष्ठभूमि शोर बढ़ गई । इस प्रकार, यह streptavidin-लेपित Qdots के लिए biotinylated प्रोटीन के उपयुक्त दाढ़ अनुपात का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

Figure 1
चित्रा 1: λ-ARS317 डीएनए सब्सट्रेट की तैयारी. (क) λ-ARS317 निर्माण का चित्रण. एक डीएनए टुकड़ा असर ARS317 λ डीएनए में मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा एकीकृत किया गया था । (ख) पौंड ठोस माध्यम पर पट्टिकाएँ. इनमें से तीन काले तीरों का प्रयोग करते हुए चिह्नित किए गए । (ग) पीसीआर का उपयोग कर एक λ-ARS317 पट्टिका की पहचान की गई । छोड़ा मार्कर, (मध्य) देशी λ डीएनए, (दाएँ) λ-ARS317 की एक पट्टिका. (घ) शुद्ध λ-ARS317 डीएनए ०.६% agarose जेल ट्रो द्वारा पता लगाया गया था । छोड़ा मार्कर, (मध्य) देशी λ डीएनए (right) शुद्ध λ-ARS317. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: उद्देश्य के योजनाबद्ध सिंहावलोकन-प्रकार TIRF और प्रवाह सेल । एकल अणु इमेजिंग परख बाहर प्रवाह सेल प्रणाली के साथ संयोजन TIRFM के आधार पर किए गए । हमारे TIRFM एक उल्टे एक 60X तेल उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = १.४९) के साथ सज्जित माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन किया गया था । डीएनए (ग्रे लाइन) बायोटिन-streptavidin लिंकेज के माध्यम से प्रवाह सेल में coverslip पर सीमित किया गया था, और बाएं से दाएं प्रवाह द्वारा बढ़ाया । एक प्रोटीन सीमित डीएनए पर बाध्यकारी एक लाल-अंडाकार डॉट द्वारा संकेत दिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Qdot७०५-लेबल्ड ORC (1:1 दाढ़ अनुपात) λ-ARS317 पर बाध्यकारी । (क) ORC और λ-ARS317 डीएनए एक साथ मनाया गया । शीर्ष SYTOX ऑरेंज सना हुआ डीएनए एक ५३२ एनएम लेजर का उपयोग कर उत्साहित किया गया था और ट्रैक्टर बैंड बैंड के 550-613 एनएम संचरण बैंड-पास फिल्टर का उपयोग कर मनाया । नीचे Qdot७०५-लेबल ORC एक ४०५ एनएम लेजर का उपयोग कर उत्साहित किया गया था और quad बैंड बैंड के 663-743 एनएम संचरण बैंड-पास फिल्टर का उपयोग कर मनाया । (B) दो 256 × 256 उप-स्टैक्स मूल 512 × 512 स्टैक से क्रॉप किए गए थे । (ग) छवियों इसी स्टैक में ६१ अनुक्रमिक फ्रेम का उपयोग कर हासिल की । छोड़ा SYTOX नारंगी सना हुआ डीएनए, (मध्य) Qdot७०५-लेबल ORC, (दाएँ) विलय छवि; तीन Qdot७०५-लेबल ORC λ पर ARS317 साइट पर बाध्यकारी-ARS317 डीएनए सब्सट्रेट काले तीर का उपयोग कर चिह्नित किया गया. (घ) डीएनए पर ORC बाध्यकारी स्थिति की गणना का चित्रण. एलडीएनए डीएनए की लंबाई का मतलब है, एलORC डीएनए पर ORC बंधन साइट से डीएनए के सीमित अंत तक दूरी का मतलब है । (ङ) λ-ARS317 डीएनए पर ORC बाइंडिंग वितरण का हिस्टोग्राम. डेटा के लिए फ़िट गाऊसी लाल ठोस रेखा का उपयोग करके इंगित किया गया था । त्रुटि पट्टियां १००० बूटस्ट्रैप नमूनों पर आधारित ९५% विश्वास अंतराल को इंगित करती हैं । N ORC अणुओं की संख्या का मतलब है । ARS317 डाला साइट एक काले तीर का उपयोग कर दिखाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: Qdot-लेबल्ड ORC बाइंडिंग (3:1 दाढ़ अनुपात) पर λ-ARS317 । ORC और λ-ARS317 डीएनए में चित्रा 3ए के रूप में उसी तरह से मनाया गया । छोड़ा SYTOX ऑरेंज सना हुआ डीएनए एक ५३२ एनएम लेजर का उपयोग कर उत्साहित किया गया । मध्य Qdot-लेबल ORC एक ४०५ एनएम लेजर का उपयोग कर उत्साहित किया गया । (दाएं) मर्ज किए गए छवियां । दो Qdot-लेबल ORC पर ARS317 साइट पर बाध्यकारी λ-ARS317 डीएनए सब्सट्रेट काले तीर का उपयोग कर चिह्नित किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां, हम एक प्रोटोकॉल मौजूद Qdot-लेबल प्रोटीन और साइट के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए एक प्रवाह में TIRFM का उपयोग कर-सेल । आवश्यक कदम साइट-डीएनए सब्सट्रेट, डीएनए biotinylation, coverslip सफाई और functionalization, प्रवाह सेल तैयारी, और एकल अणु इमेजिंग के विशेष संशोधन शामिल हैं । वहां दो प्रमुख बिंदु है कि ध्यान दिया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, λ डीएनए के साथ शामिल सभी कदम धीरे हेरफेर किया जाना चाहिए किसी भी संभव नुकसान कम करने के लिए, उदाहरणके लिए, pipetting द्वारा मिश्रण से बचने के ऊपर और नीचे बार । दूसरा, यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है कि coverslip अपनी पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए पर्याप्त साफ है । coverslip सफाई और functionalization प्रक्रिया के दौरान, पानी ultrapure स्तर तक पहुंच जाना चाहिए, और हवा धूल से मुक्त होना चाहिए । बेहतर है कि coverslip functionalization और फ्लो सेल असेंबली को क्लीन बेंच पर ले जाएं ।

प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एकल अणु परख में-डीएनए संपर्क, λ डीएनए कई फायदे के साथ एक उपयुक्त सब्सट्रेट है20. λ डीएनए काफी आसानी से मनाया जा करने के लिए पर्याप्त है और एक ही अणु प्रयोग में उस पर रिकॉर्डिंग प्रोटीन आंदोलन की अनुमति है । इसके अलावा, ssDNA एक गिलास coverslip पर λ डीएनए tethering के लिए कई डिजाइनों की अनुमति को भांप लिया । इस अध्ययन में, हम λ डीएनए की एक विशिष्ट साइट पर एक exogenous डीएनए टुकड़ा डालने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस प्रकार, विभिंन उपयोगकर्ता-परिभाषित डीएनए टुकड़े λ डीएनए में एकीकृत किया जा सकता है । संशोधित λ डीएनए आसानी से तरल lysates से एक अणु अध्ययन के लिए बड़ी मात्रा में शुद्ध किया जा सकता है ।

streptavidin-लेपित Qdot लेबलिंग परख में लेबलिंग दक्षता का मूल्यांकन करना कठिन है क्योंकि Qdot nanocrystal प्रति लगभग 5-10 streptavidins हैं । तदनुसार, streptavidin-लेपित Qdots और biotinylated प्रोटीन के उपयुक्त दाढ़ अनुपात को प्रयोगों में ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए. एक 1:1 दाढ़ अनुपात एक संदर्भ हो सकता है ।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि Qdot सटीक मात्रात्मक परख में इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से अपनी उच्च फोटो-स्थिरता फोटो ब्लीचिंग परख के लिए अनुपयुक्त है । हालांकि Qdots की उच्च स्थिरता मात्रात्मक परख में अपने आवेदन सीमा, यह आसान अवलोकन और लंबे समय से5ट्रैकिंग की अनुमति देता है । जीव विज्ञान में एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की बढ़ती अनुप्रयोगों के साथ, इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल बहुत भविष्य में डीएनए चयापचय के तंत्र को खंडित करने के लिए योगदान देगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ हसन Yardimci और डॉ Sevim Yardimci फ्रांसिस क्रिकेटरों संस्थान के एकल अणु प्रयोगों में मदद करने के लिए धंयवाद, डॉ डैनियल Duzdevich कोलंबिया विश्वविद्यालय के डॉ एरिक सी ग्रीन लैब से, डॉ Yujie पेकिंग विश्वविद्यालय के सन और डॉ चुनलाई चेन के... उपयोगी चर्चा के लिए Tsinghua विश्वविद्यालय । इस अध्ययन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन ३१३७१२६४, ३१४०१०५९, कैस अनुशासनात्मक नवाचार टीम और ंयूटन उंनत फैलोशिप (NA140085) रॉयल सोसायटी से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lambda DNA New England Biolabs N3011 Store 25 μL aliquots at -20 ºC.
XhoI enzyme Thermo Fisher Scientific FD0694
Quick-fusion cloning kit Biotool B22611
MaxPlax Lambda
Packaging Extracts		 Epicentre MP5110 Bacterial strain LE392MP
is included in this package.
MgSO4 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10013092 Any brand is acceptable.
Tris Amresco 0497-5KG
NaCl Beijing Chemical works N/A Any brand is acceptable.
MgCl2 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10012818
Chloroform Beijing Chemical works N/A Any brand is acceptable.
NZ-amine Amresco J853-250G
Casamino acids Sigma-Aldrich 22090-500G
PEG8000 Beyotime ST483
Magnetic stirring apparatus IKA KMO2 basic
15 mL Eppendorf tube Eppendorf 30122151 15 mL, sterile, bulk, 500pcs
Rnase SIGMA R4875-100MG
Dnase SIGMA D5319-500UG
Proteinase K Amresco 0706-100MG
Biotinylated primers Thermo Fisher Scientific N/A
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) New England Biolabs M0202
Coverslip Thermo Fisher Scientific 22266882
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009259
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 306568-100G
Acetone Thermo Fisher Scientific A949-4
H2SO4 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80120891 sulfuric acid
H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10011218 30% Hydrogen peroxide
Methanol Sigma-Aldrich 322415-2L
Acetic acid Sigma-Aldrich V900798
APTES Sigma-Aldrich A3648
mPEG
(methoxy-polyethylene glycol)		 Lysan mPEG-SVA-5000
biotin-PEG
(biotin-polyethylene glycol)		 Lysan Biotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3 Sigma-Aldrich 31437-500G
Vacuum desiccator Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. IPC250-1
Vacuum sealer MAGIC SEAL WP300
Diamond-tipped glass scribe ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 70036
Glass slide Sail Brand 7101
Inlet tubing SCI (Scientific Commodties INC.) BB31695-PE/2 inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.
Outlet tubing SCI (Scientific Commodties INC.) BB31695-PE/4 inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.
Double-sided tape Sigma-Aldrich GBL620001-1EA
Epoxy LEAFTOP 9005 five minutes epoxy
Streptavidin Sigma-Aldrich S4762
Fluorescence Microscope Olympus IX71
Infusion/withdrawal
programmable pump		 Harvard apparatus 70-4504
532 nm laser Coherent Sapphire-532-50
640 nm laser Coherent OBIS-640-100
EMCCD Camera Andor DU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
splitting optics		 Hamamatsu photonics K.K. A12801-01
TIRF illumination system Olympus IX2-RFAEVA2
60×TIRF objective Olympus APON60XOTIRF
Quad-edge laser dichroic
beamsplitter		 Semrock Di01-R405/488/
532/635-25x36
Quad-band bandpass filter Semrock FF01-446/510/
581/703-25
Dichroic beamsplitter Semrock FF649-Di01-25x36
Emission filter Chroma Technology Corp ET585/65m
Emission filter Chroma Technology Corp ET665lp
FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 Thermo Fisher Scientific F36909
SYTOX Orange Thermo Fisher Scientific S11368
Qdot705 Streptavidin Conjugate Thermo Fisher Scientific Q10163MP Store at 4 ºC, do not freeze.
ATP Amresco 0220-25G Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC.
DTT Amresco M109-5G Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC.

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References

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Qdot-लेबल प्रोटीन और साइट के बीच बातचीत visualizing-विशेष रूप से संशोधित λ डीएनए एकल अणु स्तर पर
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Xue, H., Zhan, Z., Zhang, K., Fu, Y. … More

Xue, H., Zhan, Z., Zhang, K., Fu, Y. V. Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified λ DNA at the Single Molecule Level. J. Vis. Exp. (137), e57967, doi:10.3791/57967 (2018).

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