Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Seksuelt overført smitte af amerikansk Trypanosomes fra hanner og hunner til Naive hjælpere

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

Trypanosoma cruzi agent for Chagas sygdom producerer langvarig asymptomatiske infektioner, der pludselig udvikler sig til klinisk anerkendte patologi. Følgende forskning protokol beskriver en kort sigt familie-baserede epidemiologisk undersøgelse for at optrævle T. cruzi infektionen overføres seksuelt fra forældre til afkom.

Abstract

Amerikansk trypanosomiasis overføres til mennesker af triatomine bugs via indtagelse af forurenede fødevarer, ved blodtransfusioner eller tilfældigt i hospitaler og forskningslaboratorier. Derudover Trypanosoma cruzi infektionen overføres medfødt fra en chagasic mor til hendes afkom, men den mandlige partner bidrag i livmoderen kontaminering er ukendt. Resultaterne af reder og klumper af amastigotes og trypomastigotes i theca celler i æggestokkene, i goniablasts og i lumen af seminiferous tubules tyder på, at T. cruzi infektioner overføres seksuelt. Forskning protokol heri præsenterer resultaterne af en familie undersøgelse befolkning viser parasit nukleare DNA i diploide blod mononukleære celler og i de haploide kønsceller af forsøgspersoner. Således, tre uafhængige biologiske prøver, der opsamlet et år fra hinanden bekræftet, at T. cruzi infektioner var seksuelt overførte til afkommet. Interessant, specifikke T. cruzi antistof var fraværende i fleste af familiens afkom, der bar immuntolerance til parasit-antigen. Immuntolerance blev demonstreret i kylling refraktære over for T. cruzi efter den første uge af embryonale vækst, og kyllinger udklækket af flagellat-podes æggene var ude af stand til at producere det specifikke antistof. Derudover ejakulerer instillation af den menneskelige sæd intraperitoneal eller ind i skeden af naive mus viste T. cruzi amastigotes i bitestiklen, seminiferous tubulus, sædlederen og æggelederen med fravær af inflammatoriske reaktioner i immunsystemet privilegeret organer af reproduktion. Opdræt af T. cruzi-inficerede mandlige og kvindelige mus med naive kammerater resulterede i erhvervelse af de infektioner, som blev senere overført til afkommet. Derfor er en solid uddannelse, information og kommunikation program, der involverer befolkning og sociale organisationer anses for nødvendig for at forhindre Chagas sygdom.

Introduction

Protozo parasit Trypanosoma cruzi tilhører familien Trypanosomatidae gennemgår trypomastigote og amastigote livscyklus stadier i pattedyr værter og findes som epimastigotes i insekt-vektor (Reduviid: Triatominae) gut og i axenic kultur. I de seneste årtier, har flere undersøgelser vist tilstedeværelsen af Chagas sygdom i lande på fire kontinenter betragtes som triatomine fejl fri1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; spredningen af amerikanske trypanosomes blev i første omgang henføres til latinamerikanske indvandrere til den nordlige halvkugle, men muligheden for, at nogle er autoktont tilfælde af Chagas sygdom kan ikke længere blive nægtet3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. kun genkendelige endogene kilden til T. cruzi transmission har været tilskrevet chagasic mors overførsel af parasitten til afkom i ca. 10% af graviditeter15; den mandlige partner bidrag til i livmoderen infektioner gennem sæd ejakulerer forblevet ukendt.

Mere end et århundrede siden, efterforskere16,17 observeret intracellulære T. cruzi amastigotes i theca celler i æggestokkene og kimen linje celler i testiklerne i akutte tilfælde af Chagas sygdom. Reder og klumper af T. cruzi trypomastigotes og amastigotes i theca celler i æggestokkene, i goniablasts og i lumen af seminiferous tubules (figur 1) dødelig akut Chagas sygdom tilfælde udvikle immun privilegium i organer reproduktion i mangel af inflammatoriske infiltrerer18,19. I de seneste årtier, et par eksperimentelle studier har vist reder af de runde amastigote former for T. cruzi i seminiferous tubulus, epididymis og vas deferens såvel som i livmoderen, rør og æggestok theca celler i akut inficerede mus 1,20,21,22. Desuden, i løbet af familie undersøgelser at dokumentere overførsel af protozo mitokondrie-DNA fra forældrenes Chagas patienter at deres efterkommere, T. cruzi nukleare DNA (nDNA) blev bekræftet i humane haploide Kim linje celler23, og parasit livscyklus faser blev observeret i ejakulerer chagasic mus24. Disse resultater er i overensstemmelse med rapporter om immuntolerance opnået af afkommet af T. cruzi -inficerede værter i mangel af specifikke antistof1,25,26. Derudover epidemiologiske betænkninger, der foreslog spredning af endemiske Chagas sygdom til andre kontinenter3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 understøttes nu af eksperimentelle undersøgelser viser at Chagas sygdom kan overføres seksuelt1 . Undersøgelsen præsenterer en epidemiologisk familie undersøgelse protokol og viser, at T. cruzi infektion overføres ved samleje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige og dyre forskning udvalg af det medicinske fakultet på universitetet Brasilia godkendt alle procedurer med forsøgspersoner og forsøgsdyr, henholdsvis i forskningsprotokoller 2500.167567 og 10411/2011. Den etiske komité i den offentlige Foundation Hospital Gaspar Vianna (protokol n º 054/2009 og CONEP 11163/2009) godkendt gratis samtykke former for feltundersøgelse, med udvidelse til ministeriet for sundhed nationale Kommissionen på Human forskning (CONEP 2585/04). Protokollen blev justeret for at vurdere T. cruzi DNA i diploide blod mononukleære celler og i haploide kønsceller af sæd ejakulerer. Forsøgsdyr modtaget Human pleje; mus, underkastes hjerte punktering før offer, var under anæstesi.

1. rekruttering af menneskelige deltagere

  1. Sikre, at forskningsgruppen deltager i en Health System Chagas sygdom Program til at levere sundhedsydelser til Chagas patienter.
  2. Rekruttere menneskelige deltagere fra familier tilmeldt programmet, viser mindst ét tilfælde med feber, utilpashed, hovedpine, takykardi, og ødem, de vigtigste kliniske symptomer på akut Chagas sygdom14.
  3. Levere sundhedsydelser til personer i undersøgelsen familier for en periode på fem år.
  4. Få 15 mL af venøse blod fra undersøgelsens deltagere på tre gange ét år fra hinanden, opdele prøven i tre 5 mL alikvoter, og gemme dem i køleskab ved 4 ° C.
  5. 2 mL af sæd ejakulerer opsamles fra voksne frivillige familiemedlemmer og fortsætte som beskrevet i trin 3.3.

2. vækst af parasitter

  1. Bruger alikvot fra trin 1.4, blande blod med 5 enheder af anticlotting natrium heparin; gøre en skråning kultur ved inokulation af blod fra familie deltagere med diagnosticering af akut Chagas sygdom.
    1. Podes 5 mL af unclotted humant blod ind i en 50 mL skruelåg tube blod-skråagarsubstratet plus 5 mL af leveren infusion-tryptose medium (LIT), og der inkuberes prøven i en shaker på 27 ° C i 3 måneder.
    2. Placere 100 µL af supernatanten medium oven på glas dias, dække med følgesedler og søgen efter blod T. cruzi epimastigotes under mikroskop, hver fire uger.
    3. Høste epimastigote isolater i centrifugatet axenic LIT medium på 27 ° C; vaske cellerne i PBS pH 7,4, centrifugeres ved 1.000 x g i 10 min. Fortynd epimastigotes i pellet i 5 mL af Dulbeccos modificerede afgørende medium (DMEM).
    4. Podes sammenflydende L6 muskel celle kultur kolber med 1 x 106 ECI1 til ECI21 T. cruzi epimastigote isolerer.
    5. Vokse T. cruzi ECI1-til-ECI21 og Berenice arketype trypomastigotes i L6 muskel cellekulturer i 75 mL kultur kolber.
    6. Feed celler med 15 mL DMEM ved pH 7,4 suppleret med 5% føtal bovint serum, 100 IE/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 250 nM L-glutamin, og 5% CO2 på 37 ° C1.
    7. Bruge den positive kontrol T. cruzi Berenice trypomastigotes at fænotype ECI1 til ECI21 isolater fra vævskultur, som beskrevet i trin 5.2.
    8. Vokser den negative kontrol Leishmania braziliensis27 i DMEM suppleret med 20% bovint serum kun føtal, og bruge parasit promastigotes som en negativ kontrol.
    9. Brug 1 x 106 T. cruzi ECI1 til ECI21 trypomastigotes i supernatanten fra cellekultur for at inficere mus.
    10. Søgning efter T. cruzi trypomastigotes i halen blod efter den første uge af infektionen.
    11. Søg reder af amastigotes hæmatoxylin-eosin farvede dele af hjertet, skeletmuskulatur og reproduktive organer af de inficerede mus, en måned derefter.

3. DNA-ekstraktion og PCR analyser

  1. Placere 5 mL blod (trin 1.4) alikvot i et sterilt EDTA-rør, og udføre tæthed gradient centrifugering for 45 min på 3.000 x g. Bruge en pipette til at høste de mononukleære celler fra hvidlig fase over røde blodlegemer, hvide cellerne vaskes to gange med 5 mL PBS, pH 7,4, ved centrifugering i 10 min på 1.500 x g i en anden 15 mL tube, og bruge cellerne til DNA-ekstraktion.
  2. Uddrag DNA fra ECI-1 til HEV-21 T. cruzi, fra den positive kontrol Berenice T. cruzi, fra den negative kontrol L. braziliensis (trin 2.1.8), og fra test blod mononukleære celler af 109 menneskelige familie studere emner1 , 27 , 28.
  3. Fortyndet 2 mL af de sperm prøver i trin 1,5 i DMEM (1:4, v/v); Inkuber i 45 min på 5% CO2 og 37 ° C, inddrive sædcellerne fra supernatanten efter centrifugering i 5 min på 13.000 x g, og uddrag den haploide DNA23.
  4. Placer 1 mL af cellerne i ekstraktionsbuffer (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1% SDS, 0,04% proteinase-K, og 1% dithiothreitol), og bland løsningerne af inversion og ryster.
    1. Centrifugeres løsninger til 10 min på 13.000 x g og 25 ° C, og overføre den tyktflydende supernatanten til en spin kolonne.
    2. Centrifugeres kolonnen spin i 1 minut ved 10.000 x g og kassér eluatet; tilføje 500 µL binding buffer til kolonnen spin (Table of Materials), centrifugeres i 1 min på 12.000 x g, og kassér eluat.
    3. Tilføje 600 µL vask buffer til kolonnen spin, centrifugeres i 1 min på 12.000 x g, og kassér eluat.
    4. Gentag dette trin to gange, og Overfør kolonnen spin til en sterile 1,5 mL micro-centrifugerør.
    5. Tilføj 100 µL af TE buffer, inkuberes rør ved stuetemperatur for 2 min og derefter centrifugeres tube for 1 min på 12.000 x g. Buffer i microcentrifuge tube indeholder DNA.
    6. Måle DNA koncentrationer af kører delprøver på en 0,8%-agarosegel og ved at læse absorbans på 260 nm med et spektrofotometer. Gemme DNA-prøver ved-20 ° C indtil brug i PCR-analyse.
  5. Brug T. cruzi Tcz1/2 primere udglødet til specifikke 188-nt specifikke telomere sekvens sonde29 og køre PCR med DNA fra familie undersøgelse forsøgspersonernes blod og sæd, Berenice T. cruzi positiv kontrol og fra de L. braziliensis negativ kontrol.
    1. Forbered PCR blanding med 10 ng skabelon DNA, 0,4 µM i hvert par af primere, 2 U af Taq DNA polymerase, 0,2 µM dNTP'er og 15 µM MgCl2 i en 25 µL endelige rumfang.
    2. Indlede DNA amplifikation program på 94 ° C til 30 s til at denaturere skabelonen, og cool prøver til 55 ° C til 30 s. Altså Ruger prøver på 94 ° C til 90 s for at udvide de udglødet primere. Returnere temperaturen til 94 ° C til 30 s til at starte den næste cyklus, og Inkuber prøver en yderligere 3 min på 72 ° C. For enden af 32nd cyklus cool prøver i 10 min. ved stuetemperatur, og gemme dem i køleskab ved 4 ° C29.
    3. Forstærke en T. cruzi DNA telomere gentagelsessekvensen udglødet til Tcz1/2 grundere på både ekstremiteter.
    4. Analysere amplification produkter på et 1,3%-agarosegel og observere 188-nt DNA bands på en UV-belysningen.

4. sydlige hybridisering

NOTE: Southern hybridisering blev brugt til at skille sig af med de fleste af den falske positive PCR-amplikoner i agarosegel.

  1. Hensyn PCR forstærkning produkter fra ikke-inficerede kontrolelementer fra Chagas sag positive kontroller, fra 109 klargjorte prøver af diploide DNA og haploide DNA af 21 undersøgelse familie deltagere til det sydlige hybridizations.
  2. Ansætte T. cruzi 188-nt DNA-specifikke telomere sekvens sonden udglødet til Tcz1/2 primere vist; etiket sonde med [α -32P] 2'-deoxyadenosine trifosfat (dATP) ved hjælp af en tilfældig primer mærkning kit, og analysere amplification produkter på et 1,3%-agarosegel på 60 V natten over ved 4 ° C.
  3. Overføre gel til et positivt ladede nylon membran ved hjælp af metoden kapillær natten over.
  4. Krydse DNA bands overført til nylon membranen med radiolabeled 188-nt sonden, som binder EcoR1 fordøjer af genomisk DNA i 25 µL af enzym-specifikke buffer for variabel perioder.
  5. Vask membran to gange i 15 min. ved 65 ° C med 2 x SSC og 0,1% SDS.
  6. Udsætte X-ray film til nylon membran og autoradiograph bands på membranen i en uge.
  7. Vokse kloner udvalgt fra PCR og sydlige hybridisering med T. cruzi PCR forstærkning produkter, som er udvidet med den specifikke radiolabeled DNA-sonder.
  8. Kommercielt sekvens kloner ved hjælp af de Tcz1/2 primere indstille udglødet til T. cruzi -specifikke Telomer fodspor2,23.

5. immunologiske assays

Bemærk: Følsomheden og specificiteten af den indirekte immunofluorescens (IIF) og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) blev vurderet i serum fra seks Chagas patienter med påviselig parasitemia og seks Chagas-fri, deidentified serum Bank prøver. Assays udført med dobbelt serum fortyndinger i PBS, pH 7,4, afslørede at IIF på 1: 100 fortyndinger og ELISA optisk tætheder (ODs) på 0.150 og ovenfor adskilt positivt fra de negative resultater.

  1. Bruge 5 mL af unclotted blodet alikvot (trin 1.4) opbevares ved stuetemperatur i 1 time, og der centrifugeres det på 1.500 x g for 30 min til at adskille serum i supernatanten.
  2. Udføre IIF og ELISA i tredobbelt 1: 100 serum fortyndinger at opdage T. cruzi og L. braziliensis -antigener som tidligere beskrevet28.
  3. IIF
    1. Gennemføre IIF assay i tredobbelt serum fortyndinger af 109 undersøgelse emner prøver på tre gange ét år fra hinanden.
    2. Placere 5 µL suspensioner af formalin 1% - behandlet T. cruzi epimastigotes eller L. braziliensis promastigotes på glas dias. Lad den parasitter tørre natten over i en hætte ved stuetemperatur og gemme glas dias ved-20 ° C indtil brug.
    3. Sted 20 µL af patienternes serum fortyndinger oven på glas dias belagt med 5 µL af formalin-dræbt (10 parasitter/µL) T. cruzi epimastigotes eller L. braziliensis promastigotes.
    4. Inkuber glas dias dækket med en slip for 1 h i et fugtigt kammer ved 37 ° C og vaskes tre gange med PBS.
    5. Inkuber lufttørret glas dias med en 1:1,000 fortynding af en fluorescein-mærket kanin antistof (Table of Materials) til humant IgG i 1 timer ved 37 ° C; vask og tør diaset.
    6. Mount diaset med et cover slip og undersøge det under et UV lysmikroskop.
      Bemærk: En positiv eksamen er en apple-grøn T. cruzi epimastigote silhuet, vist i videoen.
  4. ELISA
    1. Køre en ELISA til påvisning af T. cruzi og L. braziliensis opløselige antigener (1 µg/100 µL i 0,1 M karbonat buffer, pH 9,6) på bestrøget mikrotiterplade brønde.
    2. Inkubér 1: 100 serum fortyndinger i tredobbelt coatede brønde i 2 timer ved stuetemperatur.
    3. Vaske pladerne tre gange med PBST (PBS indeholdende 0,5% Tween-20), pH 7,4, løsning før tørring.
    4. Inkuber plader med 50 µL af en 1:1,000 fortynding af kanin-anti-humant IgG antistof i 90 min ved 37 ° C.
    5. Vaske pladerne tre gange med PBST løsning og lade dem tørre ved stuetemperatur.
    6. Inkuber plader med 100 µL af 1:1,000 fortyndinger af basisk fosfatase-konjugeret gede anti-kanin IgG (Table of Materials) i 90 min ved 37 ° C.
    7. Vaske pladerne tre gange med PBST, tilføje substrat p-nitro phenyl fosfat, og vente på farveudviklingen.
    8. Læs ODs på 630 nm i en multimode pladelæseren.
    9. Køre tredobbelt Fortyndingerne af prøveserum fra befolkningens undersøgelse og plot ODs for at identificere specifikke T. cruzi antistof titers.

6. vurderinger af immunforsvar tolerance

Bemærk: En kylling modelsystem blev brugt til at teste T. cruzi infektioner efter den første uge af embryo udvikling.

  1. Podes frugtbare hønseæg med 100/10 µL T. cruzi trypomastigotes høstet fra vævskultur medium; podes mock kontrol æg med 10 T. cruzi trypomastigotes pr. µL næringssubstratet. Forsegle hullet med tape.
  2. Inkuber 20 T. cruzi -inficerede æg og et tilsvarende antal mock kontrol frugtbare æg ved 37 ° C og 65% luftfugtighed i 21 dage.
  3. Holde kyllinger at luge i inkubator i 24 timer og derefter ved 32 ° C i hætter med temperaturkontrol for tre uger.
  4. Vokse kyllinger udklækket fra T. cruzi -podes æg og mock kontrol æg til det voksne Stadium i positive luft pres værelse på 24 ° C, i individuelle bure placeret i separate sideskibe.
  5. Udfordre alle de voksne kyllinger tre gange på seks måneder med 107 formalin-dræbt trypomastigotes injiceres subkutant, ugentligt, ifølge ordningen i videoen.
  6. Trække blod fra en wing vene af kyllinger udklækket fra T. cruzi -podes æg og mock kontrolelementerne fire uger efter den sidste vaccination at få serum.
  7. Bruge kylling serum til at opdage særlige T. cruzi antistof ved hjælp af IIF og ELISA som beskrevet i trin 5 i protokollen.

7. infektion i mus med T. cruzi fra Chagas patienternes sæd ejakulerer

  1. Bruge sæd ejakulerer fra en voksen PCR + Chagas sygdom patienten (trin 1,5) og fra individ voksen PCR - Chagas-fri.
  2. Brug to grupper af 12 en-måned-forhenværende BALB/c naive mus holdes i hætter under positive lufttryk på 24 ° C og fed mad ad libitum.
  3. Indgyde de menneskelige Chagas-positive sæd delprøver (100 µL) ind i bughinden og lige store mængder i skeden af gruppe-en mus.
  4. Indgyde kontrol Chagas-fri sæd delprøver (100 µL) i bughinden og et tilsvarende beløb i skeden af gruppe-B mus.
  5. Ofre de eksperimentelle mus under anæstesi fem uger efter sæd instillations og væv sektioner på farvning med hæmatoxylin-eosin.
  6. Bruge mikroskopi til at søge efter T. cruzi trypomastigotes og amastigotes i hjertet, skeletmuskulatur og reproduktive organer i grupper af mus.

8. overførsel af den T. cruzi infektion af samleje

  1. Bruge 10 mandlige og kvindelige seks uger gamle BALB/c mus i eksperimenter.
  2. Podes fem mand og fem hunmus intraperitoneal med 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes fra vævskultur.
  3. Avle musene indtil tre måneder efter alder: gruppe jeg vil blive dannet af fem T. cruzi-inficerede hunmus og fem styre noninfected mandlige kammerater; gruppe II vil være dannet af fem T. cruzi -smittet mand og fem styre noninfected kvindelige hjælpere. Gruppe III vil blive dannet af fem mand og fem kvindelige kontrol naive inficerede kammerater.
  4. Hus hver ynglende par i et bur placeret inde i en sikker boks med en 5 mm gitteret og lås-i døren for at forhindre flugt.
  5. Feed musene chow og vand ad libitum. Hæve ialt 70 fravænning descendenter i grupper II og for mindst seks uger.
  6. Trække blod af hjertet punktering fra forældrenes (FO) og afkom (F1) mus under bedøvelse, ofrer mus og sende dele af hjertet, skeletmuskulatur og reproduktive organer for patologisk analyse.

9. vurdering af immun privilegium

  1. Få væv fra T. cruzi-inficeret og naive kontrol mus (trin 8,6), og skær paraffin-embedded prøverne i 4 µm tykt sektioner.
  2. Fjern paraffinen og dehydrere sektioner på glas dias med flere ændringer af xylen og sorterede vasker med 100% til 70% ethanol, for 1 min.
  3. Inkuber væv sektioner med 0,05% saponin én gang, efterfulgt af tre skylninger med destilleret vand ved stuetemperatur.
  4. Spærre afsnittene vævet med 5% nonfat mælkepulver i 45 min. Skyl dias i 0,1 M PBST og inkuberes sektioner med den Chagas musen anti-T. cruzi serum eller med inficerede mus kontrolserummet på 1:20 fortynding for 2 h.
  5. Vask dias tre gange i 5 min i PBST og tørt ved stuetemperatur før inkubering med en 1:1,000 fortynding af basisk fosfatase-konjugeret kanin anti-mus IgG.
  6. Skyl dias i PBST og tilsæt 100 µL af 3,3' diaminobenzidine for en 5 min inkubation, efterfulgt af tre vasker med PBST og counterstaining med Harris hæmatoxylin for 30 s.
  7. Vaske dias i destilleret vand i 5 min, dehydrere dem i 70%, 80%, 90% og 100% ethanol i 1 min., og montere dem i buffer glycerin.
  8. Undersøge dias med en lyse-felt lysmikroskop, og fange fotobilleder med en microcamera med software og en analyzer program.
  9. Dokumentere rettigheden immun af parasitten i mangel af inflammatoriske reaktioner i de reproduktive organer.

10. statistiske analyser

  1. Bruge biomedicinsk Rediger Sekvensanalyse, udføre linjeføringer med BLAST og bestemme E-value Statistisk signifikans (p < 0,05).
  2. Udføre en envejs variansanalyse (ANOVA) og Tukey testen til at sammenligne OD betyder plus eller minus standardafvigelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne forskning, udført i henhold til protokollen, har til formål at påvise akutte tilfælde af Chagas sygdom ved kliniske og parasitologiske eksamener. Venøse blodprøver blev udsat for direkte mikroskopisk undersøgelse og in vitro-kultur for parasitten vækst. Enogtyve akutte tilfælde af Chagas sygdom viste T. cruzi i blodet. Forskning protokol sikret isolering af T. cruzi ECI1-ECI21 fra akut Chagas sygdom og DNA prøver udstillet positive DNA fodspor i resten af befolkningens undersøgelse: nDNA-PCR assays givet den typiske telomere gentagelsessekvensen med 188-nt bands nuværende samt T. cruzi Berenice arketype1. Chagas sager og deres familiemedlemmer, der meldte sig frivilligt til at deltage i undersøgelsen blev inddelt i fire familier1.

I denne familie undersøgelse blev T. cruzi nDNA PCR forstærket med primer sætter1,23 udglødet til specifikke telomere sekvens fra hver af de 21 akut Chagas sygdom sager. Disse T. cruzi nDNA amplikoner hybridiseret med specifikke radiolabeled sekvens sonde (figur 2); kloning og sekventering afslørede at amplikoner består T. cruzi 188-nt telomere gentage motivet. Specificiteten af disse hybridisering procedurer blev vist i den negative kontrol udført med L. braziliensis promastigotes. Patologi analyse valideret, hemoflagellates i de akutte patienter med Chagas sygdom var ægte virulente T. cruzi. Vi konkludere, at T. cruzi nDNA (188-bp) band fundet i 21 akut Chagas tilfælde (figur 2) er et direkte demonstration af vedvarende infektioner.

Seksuelt overført smitte af Trypanosoma cruzi i mennesker

For at evaluere nøgletal for T. cruzi infektioner, anvendte vi nukleinsyre test for høj følsomhed påvisning af parasitten fodspor i familien undersøgelse befolkningen1. I disse PCR assays, forstærkning produkter, der hybridiseret med specifikke radiolabeled 188-nt sonden dannet nDNA bands i 76,1% (83/109) af prøverne; resultaterne af det sydlige hybridisering af nDNA-PCR forstærkning produkter med specifikke 188-nt radiolabeled sonden er vist i figur 3. Desuden viste hybridizations parasit DNA i kimcellemanipulering for frivillige familiemedlemmer (figur 4).

IIF var ansat til fænotype ECI1 til ECI21 T. cruzi trypomastigotes med human serum IgG fra en Chagas sygdom serum bank prøve med parasitologiske demonstration af protozo i blodet, og en fluorescein konjugeret-anti-humant IgG blev brugt . T. cruzi Berenice var en positiv kontrol for Chagas-antistof, og den negative kontrol blev promastigote af sin familie relative L. braziliensis. Figur 5 viser, at den positive æble-grøn silhuet af Berenice arketype korrelerer med wild-type T. cruzi kuvert vist i videoen.

ELISA og IIF afslørede specifikke T. cruzi antistoffer1,28 i 28,4% (31/109) fra analyseprøverne. Resultaterne af ELISA og IIF, såvel som dem fra nDNA-PCR-amplikon og sydlige hybridizations, er afbildet i figur 6. Uoverensstemmelser blandt resultaterne af nDNA-PCR fodspor og dem fra det specifikke antistof assays er afbildet i heredograms (figur 7), familie A, fire fag havde positive nDNA og anti -T. cruzi antistof og 11 havde kun den positive nDNA; fem mænd havde T. cruzi i sæd ejakulere. I familien B med 44 mennesker, 11 havde specifikke T. cruzi antistof og 23 havde både det specifikke antistof og parasit nDNA; syv personer havde T. cruzi i sæd ejakulere. Familien Christensen med 29 medlemmer havde antistoffet og T. cruzi nDNA i fem personer, og 17 havde parasitten nDNA alene; fire mænd havde nDNA-PCR-positive i sæd ejakulere. I familien D, blandt 21 fag, 11 havde særlige anti -T. cruzi antistof og nDNA fodaftryk, og ni havde positive nDNA-PCR alene. Figur 3, figur 6 og figur 7 skildre de brede uoverensstemmelser blandt resultaterne, konsekvent, i de biologiske prøver familie emner i tre uafhængige forsøg køre et år fra hinanden.

Tabel 1 viser de kvantitative forskelle mellem IIF, ELISA og nDNA-PCR assays i prøverne fra menneskelige undersøgelse familier A til D. Uoverensstemmelser mellem nøgletal af antistof assays (28.4%) og positiv nukleinsyre assays (76,1%) er statistisk signifikant (p < 0.005). I disse familier, forskelle mellem grupper af T. cruzi -inficerede mennesker (III og IV) tegnede sig til 62,6% (52/83) af befolkningen, viser en positiv nukleinsyre test alene. De brede uoverensstemmelser blandt nøgletal af positive nDNA fodspor og dem af den specifikke T. cruzi antistof blev forklaret af eksperimenter udført i kylling modelsystem.

Immuntolerance

Evaluering af immunrespons gennemført i grupper af kyllinger forhøjet til det voksne Stadium i individuelle bure i separate gangene indeholdende naive kontrol kyllinger (A); mock kontrol kyllinger udklækket af æg, der er podet med næringssubstratet (B); og kyllinger udklækket af T. cruzi trypomastigotes-podes æg (C)26. Voksne høns i grupperne B og C blev udfordret tre gange med formalin-dræbt T. cruzi trypomastigote antigen, ugentlig, som vist i videoen. ELISA og IIF-assays blev kørt med serum indsamlet fra gruppe A, B og C kyllinger én måned efter udfordring. Figur 8 viser fraværet af det specifikke antistof i gruppe A og C kyllinger, der stod i kontrast stærkt med de specifikke antistof produktion i gruppe B immuniseret med T. cruzi antigen. Resultaterne viste tydeligt immun tolerance i gruppe C udklækket fra T. cruzi-podes æg.

Seksuelt overført smitte af Prøv panosoma cruzi i en mus Model System

Desuden, T. cruzi smitteevne fra en Chagas patientens ejakulere, der testede positiv i PCR og manglede det specifikke antistof, blev demonstreret gennem instillations af 100 µL af sæd ind i bughulen af mandlige mus og gennem en lig mængden af sæd indpodet i skeden. Fem uger senere, T. cruzi amastigote reder blev fundet i hjerte- og skeletmuskulatur og klumper af differentiere parasitter var til stede i lumen af sædlederen og æggelederen. Interessant nok, de destruktive inflammatoriske reaktioner ikke surround reder og klumper af T. cruzi amastigotes (figur 9).

Vurderingen af den seksuelle transmission af T. cruzi infektioner blev yderligere udført i to grupper af mus podet intraperitoneal med 1 x 105 T. cruzi Berenice trypomastigotes former1,30, 31. I eksperimentelle gruppe I, 10 T. cruzi -inficeret hanner parret med 10 naive kontrol hunmus. I eksperimentelle gruppe II, 10 T. cruzi -inficerede hunner parret med 10 naive kontrol mænd. Figur 10 viser, at T. cruzi-inficerede mandlige mus (A-til-E) og den T. cruzi -inficerede hunmus (F-g) gav 188-bp nDNA bands (ulige numre). Efter avl, naive kammerater (lige numre) let erhvervet T. cruzi efter en unik seksuelt forhold med en chagasic mate. Lignende gentagne eksperimenter udført på identiske betingelser bekræftet, at hver naive kvindelig eller mandlig mus som seksuelt parret med et T. cruzi-inficerede mandlig eller kvindelig erhvervet findes flagellate infektionen. Disse nDNA-positive stiftere (F0) genereret afkom, de rejste indtil en alder af seks uger. Derefter, test og kontrol inficerede mus var bled via hjerte punktering at indsamle ca. 0,5 mL blod. NDNA-PCR assays viste, at grundlæggerne (F0) seksuelt erhvervede infektioner blev fremsendt til F1-afkom, som det fremgår af 188-bp nDNA bands (Figur 11). F1-afkom var nDNA-positive i 41 af de 70 (58,6%) undersoegte proever. Af disse mus med nDNA bands tyder på lodret erhvervede infektioner, så få som 9 af 41 (22%) havde T. cruzi antistoffer.

F1 afkom mus blev ofret under bedøvelse, og kroppens væv blev udsat for patologisk og immun peroxidase-farvning analyser. Resultaterne af disse forsøg er vist i figur 12. Resultaterne for T. cruzi amastigotes blev dokumenteret i de interstitielle celler i epididymis og i goniablasts; amastigotes differentiere til trypomastigotes var til stede i lumen af seminiferous tubules i mangel af inflammatoriske reaktioner.

Figure 1
Figur 1 . Trypanosoma cruzi infektion i de seminiferous tubuli af en dreng, der døde af akut Chagas sygdom . Microphotograph fra læge Teixeira fil, 197018. T. cruzi former i goniablasts, og klumper af amastigotes og gratis trypomastigotes (pile) er til stede i lumen af de seminiferous tubulus i mangel af inflammatoriske infiltrater1. Hæmatoxylin-eosin pletter. Bar, 20 µm. Reprinted med tilladelse fra udgiveren og forfattere1,19.

Figure 2
Figur 2 . Fodaftryk Trypanosoma cruzi fra akut Chagas sygdom. T. cruzi nDNA-PCR forstærkning produkter dannet 188-nt bands med en specifik radiolabeled 188-nt sonde. TC, T. cruzi; NC, negativ kontrol. Genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Sydlige blotting analyse af Trypanosoma cruzi infektioner i emner af menneskelige undersøgelse familier. Familien Andersen - alle 15 fag viste den specifikke nDNA-PCR 188-nt bands. Familien b dannet ialt 35 43 fag (81.4%) særlige nDNA bands. I C-familien dannet blandt 29 medlemmer, 22 (75.8%) nDNA bands. I familien D havde 11 af 21 fag (52,4%) nDNA bands. T. cruzi-specifikke nDNA bands blev bekræftet af kloning og sekventering. Genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Aktivt Trypanosoma cruzi infektioner i sæden ejakulere fra undersøgelse familie frivillige. Infektioner i Chagas patienternes ejakulerer identificeret ved nDNA-PCR 188-bp bands. TC, T. cruzi positiv kontrol. NC, L. braziliensis negativ kontrol. Genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Fænotypen af Trypanosoma cruzi med Chagas sygdom patienters serum antistof. T. cruzi identificeret med Chagas serum IgG antistof, der genkender parasit trypomastigote behandlet med et FITC-mærket monoklonale Ab-anti-humant IgG. Anti-T. cruzi Ab genkender ikke Leishmania braziliensis promastigotes. Mellemværker Vis de negative kontroller. Barer, 20 µm. Reprinted med tilladelse fra udgiveren og forfatter1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 6
Figur 6 . Grafisk repræsentation af ringprøver og nDNA-PCR assays i familien studere befolkning. Gruppe I (n = 10) og gruppe II (n = 20) var den negative kontrol og positive kontrol seraene, henholdsvis fra T. cruzi infektioner med parasitologiske demonstration. Gruppe III (n = 31) inkluderet prøver fra familie emner med 188-bp nDNA bands og specifikke antistoffer til T. cruzi. Gruppe IV (n = 52) består af en prøve fra fag med T. cruzi infektioner opdaget af nDNA-PCR 188-nt amplikoner i mangel af det specifikke antistof. Gruppe V (n = 26) var negative prøveemner bestående af infektionsfri folk i den familie undersøgelse. Genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Heredograms og kortlægning af den Trypanosoma cruzi- inficeret familie befolkning. Figuren viser forskelle blandt nøgletal af anti -T. cruzi antistof og dem af nDNA-PCR assays. Åben firkant og cirkel, negative mandlige og kvindelige. Røde firkanter og cirkler, positiv anti -T. cruzi antistof og nDNA-PCR. Sorte firkanter og cirkler, positive nDNA-PCR alene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 8
Figur 8 . Immuntolerance i kyllinger udklækket af Trypanosoma cruzi- podes æg. A) preimmune antistof profil i mock kontrol kyllinger (n = 10). B) den specifikke antistofrespons i kontrolelementet naive kyllinger udfordret med T. cruzi antigen (n = 20). C) mangel af en specifik immunrespons i kyllinger udklækket af T. cruzi-podes æg efter udfordring med T. cruzi antigen (n = 20). Ekstinktionen forskellen mellem A og C (024 ± 0,17) mod B (0,85 ± 0,6) er statistisk signifikant (p < 0,05). Dette tal er blevet ændret fra reference26 og er genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter.

Figure 9
Figur 9 . Den smitsomme Trypanosoma cruzi i menneskelige ejakulerer udmønter sig i en aktiv murine infektion. Delprøver af Chagas patient ejakulerer blev indpodet i bughulen eller i skeden af mus. Musene blev ofret tre uger efter instillation. Top lane, T. cruzi amastigotes reder i hjertet (venstre) og i skeletmuskulatur (til højre). Bunden lane, T. cruzi amastigote reder i sædlederen (venstre) og i æggelederen (til højre). Indsatsen viser en dividere amastigote (cirkel). Bemærk fraværet af inflammatoriske infiltrater i afsnittene væv. Hæmatoxylin-eosin pletter. Barer: øverst og nederst til venstre, 20 µm; nederst til højre, 10 µm. Reprinted med tilladelse fra udgiveren og forfatter1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10 . Den seksuelt overført smitte af Trypanosoma cruzi infektioner i musen model system af samleje. Transmission af T. cruzi infektioner fra chagasic til naive kammerater fremgår af de specifikke nDNA 188-bp bands afsløret i de sydlige hybridizations. Top lane) Prebreeding profiler af PCR-amplifikation produkter T. cruzi -inficerede mus og naive mus. De ulige tal angiver T. cruzi-inficeret mandlige A til E og kvindelige F-til-jeg musen prøver. Lige tal er naive kvinde (2 til 10) og mandlige (12 til 20) mus. Bunden lane, efter avl, profiler viser, at selv mus 2 til 20 erhvervet T. cruzi infektioner. Genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter1,30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11 . Den Trypanosoma cruzi infektion overføres lodret fra F0 chagasic Forældrekontrol til F1 afkom mus. Chagasic overordnede fremsendes en enkelt avl møde T. cruzi infektioner. T. cruzi-inficerede hundyr blev parret med naive mænd A-E, og de naive kvinder blev parret med T. cruzi -inficeret hannerne F-J. Efter avl, alle stiftere (F0) viste positiv protozo nDNA-PCR 188-bp band. Sydlige blotting afslørede specifikke nDNA bandet efter hybridisering med radiolabeled 188-nt sonden i et flertal af F1 kuld. NC, L. braziliensis negativ kontrol; TC, T. cruzi positiv kontrol. Genoptrykt med tilladelse fra udgiveren og forfatter1,31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12 . Histopatologisk dokumenteret Trypanosoma cruzi seksuelt overførte fra F0 til F1 afkom og immun tolerance i mangel af en betændelsesreaktion. Afsnittene viser vækst af T. cruzi former i epididymis, goniablasts og de seminiferous tubules af F1-mus. Musene blev ofret under bedøvelse, og afsnittene immun peroxidase-farvede blev undersøgt under et mikroskop. Mikrofotografier Vis brunlig immun peroxidase-farvede T. cruzi amastigotes i den interstitielle af bitestiklen ()A) og klumper af amastigotes differentiere til trypomastigotes kaste ind i lumen af de seminiferous tubulus (B, C, og F). Amastigote reden set i et goniablast (D). Positiv kontrol mus seminiferous tubulus normal histologi (E). Bemærk fraværet af inflammatoriske infiltrater i testiklerne af F1 mus viser masser af Chagas parasitter. Giemsas pletten. Barer: A, B, C og E, 20 µm; D og F, 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1. Uoverensstemmelser mellem nøgletal af positive IIF og ELISA eksamener og nDNA-PCR assays i prøverne indsamlet fra menneskelige undersøgelse familier A-til-D *

Grupper ** ELISA: serum anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA-PCR (%)
Kontrol Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - kontrol Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-fri Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Resultaterne af tre uafhængige ELISA og nDNA-PCR assays køre i prøver, der opsamlet i tre forskellige lejligheder på årene 1, 2 og 3. [1]. forstærkning af 188-nt T. cruzi DNA gentager bekræftet af kloning og sekventering.
** Forskelle blandt negative (grupper I og V) og de positive emner (gruppe III og IV) er statistisk signifikant (p < 0,05).
ᵟ forskelle mellem grupper III og IV forklares ved immuntolerance i mangel af T. cruzi antistof nået i 62,6% (52/83) af PCR positive emner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri, vi diskuterer en familie-baseret forskning protokol, der svarede på spørgsmålet om hvorvidt menneskelig Chagas sygdom stammer fra seksuelt overførte intraspecies T. cruzi infektioner. Tidlige studier kunne ikke fremlægge dokumentation for seksuel overførsel af T. cruzi infektioner, sandsynligvis fordi de tilgængelige data og oplysninger om Chagas sygdom blev indhentet separat fra de enkelte3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Konstatering af T. cruzi i de seminiferous tubuli af en dreng (figur 1) blev den gnist, der ansporede kliniske og epidemiologiske undersøgelse. Efter flere årtier, tænkes når familien studere tilgange og de teknologier, der er beskrevet i denne forskning protokol var til rådighed, T. cruzi livscyklus faser dukkede op i den menneskelige sæd1,19.

Den direkte parasitologiske demonstration af protozo i 21 akut Chagas sygdom tilfælde var afgørende for at validere nDNA-PCR forstærkning produkter, som dannede specifikke bands i prøver fra alle fag akut smittet med T. grusom. Dette punkt af pleje laboratorium markør vurderet resultaterne af de immunologiske og nukleinsyre assays. De grundlæggende langsigtede Chagas sygdom familie undersøgelse, derfor kombinerer resultaterne hos mennesker med dem, der opnås i grupper af forsøgsdyr. Forskningen gennemføres i henhold til protokollen afsløret for første gang at T. cruzi er seksuelt overførte infektioner i mennesker1.

Bred forskellen mellem nøgletal fra parasit-specifikke antistof assays og dem fra testene for nukleinsyre angiver, at fleste af nDNA fodspor resulterede fra seksuelt overførte sager i mangel af specifikke anti T. cruzi antistoffer. Således var den seksuelt overført smitte af T. cruzi i familien medlemmerne udstiller positive nDNA i mangel af specifikke IgG antistof immuntolerance.

Immuntolerance blev demonstreret i en kylling modelsystem refraktære over for T. cruzi infektioner efter den første uge af embryo vækst1,25,26,32,33, 34. Derefter, den umodne immunsystem evne til at genkende parasitten, som et fremmed element i kroppen angivet kylling sent modne immunsystemet tolerance over for T cruzi. Disse resultater er tolerance et naturligt fænomen1 som følge af immunsystemets self-anerkendelse og vedligeholdelse af sin egen krop komponenter under fysiologiske tilstande25,26, 32 , 33 , 34. Skift fra delstaten immuntolerance til autoimmune Chagas hjertesygdomme kan derfor være forbundet med effektor celler ændringer som følge af T. cruzi kinetoplast (kDNA) mutationer i værtens genom1 ,2,14,23,25,26.

De kritiske trin i forskning protokol beskriver den vigtigste teknik modifikation og fejlfinding for at videregive de seksuelt overførte Chagas parasitter1,14,23,25, 26: jeg) at vælge undersøgelse familier med tilfælde af akut Chagas sygdom35,36; ii) isolering af vildtype T. cruzi af blod fra de akutte tilfælde; iii) får DNA prøver fra familiernes deltagere blod flagellater, fra Berenice T. cruzi arketype, fra positive deidentified bank DNA-prøver og fra negativt kontrol L. braziliensis; iv) udfører ryddeligt tekniske procedurer til at påvise, at deltagernes flagellates nDNA fodaftryk er identisk Berenice T. cruzi arketypen og af disse positive bank DNA prøver; v) kører uafhængige tredobbelt nDNA footprinting at demonstrere T. cruzi infektioner hos familiemedlemmerne tre gange ét år fra hinanden; vi) sikring af at nDNA-PCR teknik udført på pleje giver resultater bekræftes af kloning og sekventering alle amplikoner udglødet til den specifikke primer angiver, hvilket konsekvent viser T. cruzi 188-nt sekvens 1,25,28,29,30; vii) ved hjælp af høj kvalitet varemærke reagenser til at reproducere antistof titers stadig i serumprøver indsamlet på tre forskellige tidspunkter; viii) familie undersøgelse protokol afslørede den eksisterende live infektion i linje kønsceller ved påvisning af T. cruzi nDNA i mangel af specifikke serumantistoffer i sæd ejakulerer indsamlet fra Chagas parasit-inficerede personer1; ix) perspektivet er, at forskning protokol udviklet til at optrævle de seksuelt overførte T. cruzi infektioner bør videregive på autoktont Chagas sygdom på fem kontinenter; x) nDNA og kDNA fodspor sikker diagnosticering af kronisk asymptomatisk Chagas sygdom i mennesker1,2; xi) i mangel af nDNA, mutationaf T. cruzi kDNA sekvens1,2,23,25,26 alene er et laboratorium markør for at opnå differentialdiagnosticering fra idiopatisk forstørrede cardiomyopatier23,25,37,38,39.

Derudover var de virulente T. cruzi dokumenteret i Chagas patient ejakulerer i stand til at indlede udbredte infektioner efter instillation i mus vagina og ind i sin bughulen. Patologi undersøgelse viste T. cruzi amastigote reder i hjerte- og skeletmuskulatur såvel som i sædlederen og æggelederen. Interessant, parasit reder ikke provokere inflammatoriske reaktioner, som ville hæmme livsvigtige reproduktive funktioner. Fravær af inflammatoriske reaktioner gør den immune privilegium i vital administrativt organ strukturer40,41,42,43,44,45 og derfor forklarer den uncurbed vækst af T. cruzi i de reproduktive organer.

Endvidere forklares de eksperimentelle undersøgelser i chagasic-mus, der opdrættes med naive kammerater yderligere seksuel overførsel af T. cruzi infektioner hos mennesker. Inficerede hunner og hanner overførte T. cruzi infektioner til ikke-inficerede naive kammerater under samleje, og fleste af deres kuld erhvervet T. cruzi lodret overføres fra forældre til afkom. I disse eksperimenter omhandlet den indledende fase vækst af T. cruzi i røret i livmoderen og i seminiferous tubulus og sædlederen, hvor rettigheden immun fandt sted. Derefter, seksuelt overført smitte opstod gennem de parasitære stadier i sæden eller i de uterine sekret i vagina. Immun privilegium40,41,42,43,44,45 er et fænomen, der tillader nogle organer (reproduktive system, øjne og hjerne) til at nedregulere inflammatoriske reaktioner og undgå skader til vigtig, følsom og specifik funktioner40. Hormoner41 og flere immunstoffer nedregulere makrofager41,42,43, naturlige dræberceller41, T-lymfocytter og T-regulerende (langsomme) celler, således iscenesætte den hæmning af en række proinflammatoriske cytokiner og immun-privilegium udløser40,41,42,43,44,45.

Seksuel overførsel af T. cruzi infektioner fra hanner og hunner til naive partnere angiver, at kontrol af Chagas sygdom kræver international solidaritet. Resultaterne drøftes heri tyder på, at mere kreativ forskning er nødvendig. De følgende umiddelbare mål er opnåeligt: jeg) til at udvikle høj overførselshastighed platforme for specifikke og meget følsomme nukleinsyre test for at nå frem til en præcis diagnose, satsning hen til forebyggelse af infektioner overføres ved samleje, blodtransfusion og organtransplantation samt lette kliniske og epidemiologiske undersøgelser til at fastslå diagnosen og forekomsten af Chagas sygdom; ii) til at fremme en multicenter stof udviklingsprogram til at få nye lægemidler for udryddelse af T. cruzi infektioner; og iii) til at gennemføre en passende uddannelse, information og kommunikation program, der omfatter deltagelse af skoler, kirker, sociale organisationer og sundhedsinstitutioner til at forhindre spredning af Chagas sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender laboratoriefaciliteter og Izabela Dourado, Carla Araujo, og klog Gomes kritiske bemærkninger og den tekniske bistand fra Bruno Dalago og Rafael Andrade. Vi er forgældede til fundament til fremme af videnskab (FAPDF), The National Research Council, Ministeriet for videnskab og teknologi (CNPq/MCT) og agenturet for uddannelse menneskelige ressourcer, Undervisningsministeriet (KAPPER / mig), Brasilien, for at støtte disse undersøgelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 143 familie undersøgelse, Trypanosoma cruzi sæd ejakulerer uterin sekretion musen modelsystem vertikal overførsel immun privilegium kylling modelsystem immuntolerance Chagas sygdom.
Seksuelt overført smitte af amerikansk Trypanosomes fra hanner og hunner til Naive hjælpere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter