Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Seksuele transmissie van Amerikaanse trypanosomen van mannetjes en vrouwtjes te naïeve Mates

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

De Trypanosoma cruzi agent van de ziekte van Chagas produceert langdurig asymptomatische infecties die abrupt tot klinisch erkende pathologie uitgroeien. Het volgende onderzoeksprotocol beschrijft een short-run programma gezinsgerichte epidemiologische studie om te ontrafelen de T. cruzi infectie van bovenliggende seksueel overgedragen aan nakomelingen.

Abstract

Amerikaanse Trypanosomiase wordt overgedragen op mensen door triatomine insecten door de inname van besmet voedsel, door bloedtransfusies of per ongeluk in ziekenhuizen en onderzoekslaboratoria. Bovendien, de Trypanosoma cruzi infectie is aangeboren van een chagasic moeder op haar nageslacht overgedragen, maar de mannelijke partner bijdrage aan besmetting in de baarmoeder is onbekend. De bevindingen van nesten en bosjes van amastigotes en trypomastigoten in de theca cellen van de eierstok, in de goniablasts en in het lumen van seminiferous buisjes suggereren dat T. cruzi infecties seksueel worden verzonden. Het onderzoeksprotocol hierin presenteert de resultaten van een familie studie populatie met nucleaire DNA van de parasiet in de diploïde bloed mononucleaire cellen en in de haploïde geslachtscellen proefpersonen. Dus, drie onafhankelijke biologische monsters verzameld van een jaar uit elkaar bevestigd dat T. cruzi infecties seksueel werden doorgegeven aan de nakomelingen. Interessant is dat de specifieke antilichaam T. cruzi was afwezig in de meerderheid van de familie nakomelingen die droeg immuun tolerantie voor de parasiet-antigeen. Immuun tolerantie werd aangetoond in kip vuurvaste aan T. cruzi na de eerste week van embryonale groei en kuikens uitgekomen van de eieren Flagellata-geïnoculeerd konden het specifieke antilichaam produceren. Bovendien, de toediening van het menselijk sperma ejaculeert intraperitoneally of in de vagina van naïeve muizen leverde T. cruzi amastigotes in de bijbal, seminiferous zaadvormende, zaadleiders en uteriene buis met een afwezigheid van inflammatoire Reacties in de immuun bevoorrechte organen van de voortplanting. Het fokken van T. cruzi-besmette mannelijke en vrouwelijke muizen met naïef stuurlieden resulteerde in de verwerving van de infecties, die later werden overgedragen aan de nakomelingen. Dus, een robuuste educatie, informatie en communicatie programma, dat de bevolking en de maatschappelijke organisaties houdt is noodzakelijk om te voorkomen dat de ziekte van Chagas.

Introduction

De eencellige parasiet Trypanosoma cruzi die behoren tot de familie Trypanosomatidae ondergaat trypomastigote en amastigoot stadia van de levenscyclus in zoogdieren hosts en bestaat als epimastigotes in de insect-vector (Reduviid: Triatominae) darmen en in een cultuur. In de afgelopen decennia hebben verschillende studies aangetoond de aanwezigheid van de ziekte van Chagas in landen op vier continenten beschouwd als triatomine bug vrije1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; de spreiding van de Amerikaanse trypanosomen werd aanvankelijk toegeschreven aan Latijns-Amerikaanse immigranten naar het noordelijk halfrond, maar de mogelijkheid dat sommige autochtone gevallen van de ziekte van Chagas zijn kan niet langer worden geweigerd,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. de slechts herkenbaar endogene bron van T. cruzi overdracht is toegekend aan de overdracht van de moeder van de chagasic van de parasiet op het nageslacht in ongeveer 10% van de zwangerschappen15; de mannelijke partner bijdrage aan in de baarmoeder infecties via sperma ejaculeert is onbekend gebleven.

Meer dan een eeuw geleden, onderzoekers16,17 waargenomen intracellulaire T. cruzi amastigotes in de theca cellen van de eierstok en in de kiem lijn cellen van de testikels van de acute gevallen van de ziekte van Chagas. De nesten en bosjes van T. cruzi trypomastigoten en amastigotes in theca cellen van de eierstok, in goniablasts en in het lumen van seminiferous buisjes (Figuur 1) van fatale acute Chagas-ziekte gevallen ontwikkelen immuun voorrecht in de organen van reproductie in de afwezigheid van inflammatoire infiltreert18,19. In de afgelopen decennia, hebben een paar experimentele studies aangetoond nesten van de ronde amastigoot vormen van T. cruzi in de seminiferous zaadvormende, bijbal en zaadleiders zo goed zoals in de baarmoeder, de buizen en de eierstok theca cellen van acuut geïnfecteerde muizen 1,20,21,22. Bovendien, in de loop van familie studies voor het documenteren van de overdracht van protozoan mitochondriaal DNA van ouderlijke Chagas patiënten aan hun nakomelingen, T. cruzi nucleair DNA (nDNA) werd gecontroleerd in menselijke haploïde kiem lijn cellen23, en parasiet levenscyclus fasen werden waargenomen in de ejaculeert van chagasic muizen24. Deze bevindingen zijn in overleg met de verslagen over de immuun tolerantie bereikt door het nakroost van T. cruzi -besmette hosts in de afwezigheid van de specifieke antilichaam1,25,26. Bovendien, epidemiologische verslagen wordt voorgesteld de verspreiding van endemische ziekte van Chagas aan de andere continenten3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 worden nu ondersteund door experimentele studies waaruit blijkt dat de ziekte van Chagas kan seksueel worden overgedragen1 . Het huidige onderzoek presenteert een epidemiologische studie van familie-protocol en laat zien dat T. cruzi infectie zich door geslachtsgemeenschap voortplant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De mens en het dier onderzoekscommissies van de Faculteit Geneeskunde van de Universiteit van Brasilia goedgekeurd alle procedures met menselijke proefpersonen en proefdieren, respectievelijk, in een onderzoeksprotocol 2500.167567 en 10411/2011. De ethische commissie van de openbare Stichting ziekenhuis Gaspar Vianna (protocol nº 054/2009 en CONEP 11163/2009) keurt de gratis toestemmingsformulieren voor de studie van het veld, met extensie aan het ministerie van gezondheid National Commission on Human onderzoek (CONEP 2585/04). Het protocol werd aangepast om te kunnen beoordelen van T. cruzi DNA in diploïde bloed mononucleaire cellen en haploïde geslachtscellen van sperma ejaculeert. De proefdieren ontvangen humane zorg; de muizen, onderworpen aan hart punctie voordat offer, waren onder verdoving.

1. aanwerving van menselijke deelnemers

  1. Zorg ervoor dat het onderzoeksteam deelneemt aan een systeem Health Program voor Chagas-ziekte te leveren van gezondheidszorg aan patiënten van Chagas.
  2. Menselijke deelnemers uit gezinnen ingeschreven in het programma, waarin ten minste één geval met koorts, malaise, hoofdpijn, tachycardie en oedeem, de belangrijkste klinische symptomen van de acute ziekte van Chagas14werven.
  3. Het leveren van gezondheidszorg aan de mensen in de gezinnen van de studie voor een periode van vijf jaar.
  4. De studiedeelnemers 15 mL veneuze bloed verkrijgen bij drie gelegenheden een jaar uit elkaar, het monster in drie 5 mL aliquots verdelen en bewaar ze in de koelkast bij 4 ° C.
  5. Verzamelen van 2 mL van het sperma ejaculeert van volwassen vrijwilligers familieleden en ga verder zoals beschreven in stap 3.3.

2. de groei van parasieten

  1. Met behulp van het afgepipetteerde deel uit stap 1.4, meng het bloed met 5 eenheden van anticlotting Natrium heparine; Maak een helling cultuur door het enten van bloed aan de familie deelnemers met de diagnose van acute ziekte van Chagas.
    1. Inoculeer 5 mL van de unclotted menselijk bloed in een 50 mL schroefdop buis bloed-agar inslag plus 5 mL van lever infusie-tryptose medium (LIT) en Incubeer het monster in een shaker bij 27 ° C gedurende 3 maanden.
    2. Plaats 100 µL van het supernatant medium op de top van glas dia's, bedek met slips en zoek naar bloed T. cruzi epimastigotes onder de Microscoop, per vier weken.
    3. Oogst van de isolaten van epimastigote in het supernatant van een LIT medium bij 27 ° C; wassen van de cellen in PBS pH 7.4, centrifuge op 1.000 x g gedurende 10 minuten; Verdun de epimastigotes in de pellet in 5 mL van de Dulbecco gemodificeerde essentiële medium (DMEM).
    4. De confluente L6 spier cel cultuur kolven worden geënt met 1 x 106 ECI1-aan-ECI21 T. cruzi epimastigote isoleert.
    5. Groeien de T. cruzi ECI1-aan-ECI21 en de Berenice archetype trypomastigoten in L6 spier celculturen in flessen van 75 mL cultuur.
    6. Voeden cellen met 15 mL DMEM met een pH van 7,4 aangevuld met 5% foetale runderserum 100 IU/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 250 nM L-glutamine, en 5% CO2 bij 37 ° C1.
    7. Gebruik de positieve controle T. cruzi Berenice trypomastigoten aan fenotype de ECI1-aan-ECI21 isolaten uit weefselkweek, zoals beschreven in stap 5.2.
    8. De negatieve controle Leishmania braziliensis27 in DMEM aangevuld met 20% foetale runderserum alleen groeien, en gebruik de parasiet promastigoten als een negatieve controle.
    9. 1 x 106 T. cruzi ECI1-aan-ECI21 trypomastigoten in het supernatant van de cultuur van de cel gebruiken om te infecteren van muizen.
    10. Zoeken naar T. cruzi trypomastigoten in het staart bloed na de eerste week van de infectie.
    11. Zoek de nesten van amastigotes in de Haematoxyline-eosine gekleurd secties van het hart, de skeletspieren en de voortplantingsorganen van de geïnfecteerde muizen, één maand daarna.

3. DNA-extractie en PCR-analyses

  1. Plaats 5 mL van het bloed (stap 1.4) aliquoot in een steriele EDTA-buis en dichtheid kleurovergang centrifugeren voor 45 min bij 3000 x guitvoeren. Gebruik een pipet te oogsten van de mononucleaire cellen uit de witachtige fase boven de rode bloedcellen, wassen van de witte bloedcellen tweemaal in 5 mL PBS, pH 7.4, door middel van centrifugeren gedurende 10 minuten bij 1.500 x g in een verschillende 15 mL-buis, en de cellen gebruiken voor de DNA-extractie.
  2. Uitpakken van het DNA van ECI-1 naar ECI-21 T. cruzi, van de positieve controle Berenice T. cruzi, van de negatieve controle L. braziliensis (stap 2.1.8), en uit de test bloed mononucleaire cellen van 109 mensengemeenschap studie onderwerpen1 , 27 , 28.
  3. Verdunde 2 mL van het spermastaaltje verkregen in stap 1.5 in DMEM (1:4, v/v); Incubeer gedurende 45 min op 5% CO2 en 37 ° C, herstellen van spermacellen van het supernatans dat na het centrifugeren voor 5 min op 13.000 x g, en haal de haploïde DNA-23.
  4. 1 mL van de cellen in extractie buffer plaatsen (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1% SDS, 0,04% proteïnase-K en 1% dithiothreitol), en vermeng de oplossingen door inversie en schudden.
    1. Centrifugeer de oplossingen voor 10 min op 13.000 x g en 25 ° C, en het visceuze supernatant overbrengen in een spin-kolom.
    2. De kolom van de spin voor 1 min bij 10.000 x g centrifugeren en gooi het eluaat; toevoegen van 500 µL bindende buffer naar de spin kolom (Tabel of Materials), het gedurende 1 minuut op 12.000 x gcentrifugeren en negeren het eluaat.
    3. 600 µL wassen buffer toevoegen aan de kolom van de spin, het gedurende 1 minuut op 12.000 x gcentrifugeren en negeren het eluaat.
    4. Herhaal deze stap tweemaal, en de spin kolom overbrengen in een steriele 1,5 mL micro centrifugebuis.
    5. Voeg 100 µL van TE de buffer, Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, en vervolgens de buis voor 1 min op 12.000 x gcentrifugeren. De buffer in de microcentrifuge buis bevat het DNA.
    6. Meten van concentraties van DNA door te voeren aliquots op een 0,8% agarose gel en door het lezen van de absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer. De DNA-monsters bij-20 ° C bewaren tot gebruik in de analyse van PCR.
  5. Gebruik T. cruzi Tcz1/2 primers gegloeid in de reeks specifieke 188-nt specifieke telomeer sonde29 en uitvoeren van de PCR met DNA van de familie studie onderwerpen bloed en sperma, van de positieve controle van Berenice T. cruzi en van de L. braziliensis negatieve controle.
    1. De PCR-mix met 10 ng sjabloon DNA, 0.4 µM van elk paar inleidingen, 2 U van polymerase van DNA Taq, 0,2 µM dNTPs en 15 µM MgCl2 in een 25 µL eindvolume voor te bereiden.
    2. Starten van het programma versterking DNA bij 94 ° C gedurende 30 s te denatureren van de sjabloon, cool de monsters tot 55 ° C voor 30 s. Vervolgens, Incubeer de monsters bij 94 ° C gedurende 90 s uit te breiden van de ontharde inleidingen. De temperatuur terug naar 94 ° C gedurende 30 s tot de volgende cyclus starten en Incubeer de monsters een extra 3 min bij 72 ° C. Aan het einde van de 32nd -cyclus, de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur afkoelen en bewaar ze in de koelkast bij 4 ° C29.
    3. Een T. cruzi DNA telomeer herhalen reeks gegloeid aan de Tcz1/2 inleidingen op beide uitersten versterken.
    4. Analyseer de versterking producten op een agarose gel van 1,3% en observeren van de 188-nt DNA bands op een UV-illuminator.

4. zuidelijke hybridisatie

Opmerking: Zuidelijke hybridisatie werd gebruikt voor het negeren van de meeste van de valse positieve PCR waarbij in de agarose gel.

  1. De PCR versterking producten uit niet-geïnfecteerde besturingselementen, van Chagas zaak positieve controles, uit 109 proefmonsters van diploïde DNA en haploïde DNA van 21 familie studiedeelnemers naar zuidelijke kruisingen onderwerpen.
  2. Dienst van de sonde met telomere opeenvolging van T. cruzi 188-nt DNA-specifieke is gegloeid aan de inleidingen van de Tcz1/2 getoond; label van de sonde met [α -32P] 2'-deoxyadenosine trifosfaat (dATP) met behulp van een willekeurige primer labeling kit, en analyseren van de amplificatie producten op een agarose gel van 1,3% op 60 V's nachts bij 4 ° C.
  3. De gel overbrengen in een positief geladen nylon membraan met behulp van de capillaire methode 's nachts.
  4. De DNA-bands overgebracht naar het nylon membraan met de radiolabeled sonde van de 188-nt, die de EcoR1 digests van de genomic DNA in 25 µL van het enzym-specifieke buffer voor variabele periodes bindt te vermengen.
  5. Wassen het membraan tweemaal gedurende 15 minuten bij 65 ° C met 2 x SSC en 0,1% SDS.
  6. Bloot de X-ray films aan de nylon membraan en autoradiograph de bands op het membraan voor één week.
  7. Groeien de klonen geselecteerd van PCR en zuidelijke kruising met de T. cruzi PCR versterking producten, die zijn gekruist met de specifieke radiolabeled sonde van het DNA.
  8. Commercieel volgnummer de klonen met behulp van de Tcz1/2 inleidingen ontharde tot en met de T. cruzi -specifieke telomeer voetafdruk2,23instellen.

5. immunologische tests

Opmerking: De gevoeligheid en specificiteit van de indirecte immunofluorescentie (IIF) en de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA) werden beoordeeld in het serum van zes Chagas patiënten met aantoonbare parasitemia en zes Chagas-gratis, deidentified serum monsters van de Bank. De tests uitgevoerd met de dubbele serum verdunningen in PBS, pH 7.4, bleek dat de IIF in 1:100 verdunningen en de ELISA optische dichtheid (ODs) op 0.150 en boven de positieve van de negatieve resultaten gescheiden.

  1. Gebruik 5 mL van de unclotted bloed aliquoot (stap 1.4) bewaard bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, en het Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 30 minuten om te scheiden van het serum in de bovendrijvende substantie.
  2. Het uitvoeren van IIF en ELISA in drievoudige 1:100 verdunningen van het serum te detecteren de T. cruzi en L. braziliensis antigenen zoals eerder beschreven28.
  3. IIF
    1. Het gedrag van de IIF-test in drievoudige serum verdunningen van de 109 studie onderwerpen monsters bij drie gelegenheden een jaar uit elkaar.
    2. Plaats 5 µL schorsingen van de formaline 1% - behandeld T. cruzi epimastigotes of L. braziliensis promastigoten in glas dia's; Laat de parasieten droge overnachting in een kap bij kamertemperatuur en de dia's van glas bij-20 ° C bewaren tot gebruik.
    3. Plaats 20 µL van de patiëntenverenigingen verdunningen van het serum bovenop glas dia's bedekt met 5 µL van de formaline-gedood (10 parasieten/µL) T. cruzi epimastigotes of L. braziliensis promastigoten.
    4. Incubeer het glasplaatje bedekt met een slip gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij 37 ° C en wassen driemaal met PBS.
    5. Incubeer de aan glasplaatje met een verdunning van de 1:1,000 van een konijn fluoresceïne-gelabeld antilichaam (Tabel van materialen) aan menselijke IgG gedurende 1 uur bij 37 ° C; was en droog de dia.
    6. Monteren van de dia met een cover slip en deze te behandelen onder een UV licht microscope.
      Opmerking: Een positieve examen is een appelgroen T. cruzi epimastigote silhouet, getoond in de video.
  4. ELISA
    1. Uitvoeren van een ELISA om de T. cruzi en de L. braziliensis oplosbare antigenen (1 µg/100 µL in 0,1 M carbonaat buffer, pH 9,6) op gecoate microplate putten te detecteren.
    2. Incubeer de 1:100 serum verdunningen in drievoudige gecoate wells gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    3. Wassen van de platen driemaal met PBST (PBS met 0,5% Tween-20), pH 7.4, oplossing vóór het drogen.
    4. Incubeer de platen met 50 µL van een verdunning van de 1:1,000 van konijn anti-menselijke IgG antilichamen tegen 90 min bij 37 ° C.
    5. Spoel de platen driemaal met PBST oplossing en laten drogen bij kamertemperatuur.
    6. Incubeer de platen met 100 µL 1:1,000 verdunningen van alkalische fosfatase-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (Tabel of Materials) gedurende 90 minuten bij 37 ° C.
    7. Wassen van de platen driemaal met PBST, het substraat p-nitro fenyl fosfaat toevoegen en wacht voor de ontwikkeling van de kleur.
    8. Lees de ODs op 630 nm in een multimode-afleesapparaat.
    9. De drievoudige verdunningen van het testserum uitvoeren vanaf de studie bevolking en uitzetten van de ODs ter identificatie van de specifieke T. cruzi antilichamen titers.

6. beoordeling van immuun tolerantie

Opmerking: Een kip modelsysteem werd gebruikt voor het testen van T. cruzi infecties na de eerste week van embryo-ontwikkeling.

  1. Vruchtbare kippeneieren inoculeren met 100/10 µL T. cruzi trypomastigoten geoogst van weefselkweek medium; Inoculeer mock controle eieren met 10 T. cruzi trypomastigoten per µL cultuurmedium. Zegel van het gat met tape.
  2. Incubeer 20 T. cruzi -besmette eieren en een gelijk aantal mock controle vruchtbare eieren bij 37 ° C en 65% luchtvochtigheid gedurende 21 dagen.
  3. Houd de kuikens dat Luik in de incubator gedurende 24 uur en daarna bij 32 ° C in afzuigkappen met temperatuurregeling voor drie weken.
  4. Groeien de kuikens uitgebroed van T. cruzi -geïnoculeerd eieren en van eieren van de mock controle naar de volwassen fase in een positieve lucht druk kamer bij 24 ° C, in afzonderlijke kooien geplaatst in gescheiden doorgangen.
  5. Daag alle volwassen kuikens driemaal op zes maanden oud met 107 formaline-gedood trypomastigoten geïnjecteerd subcutaan, wekelijks, volgens de regeling in de video.
  6. Bloed trekken in een ader van de vleugel van kippen uitgekomen van de eieren T. cruzi -geënt en van de mock besturingselementen vier weken na de laatste vaccinatie te verkrijgen van het serum.
  7. Het kip-serum gebruiken voor het detecteren van de specifieke T. cruzi antilichaam door IIF en ELISA zoals beschreven in stap 5 van het protocol.

7. infectie van muizen met T. cruzi van Chagas patiënten sperma ejaculeert

  1. Gebruik de sperma ejaculeert uit een volwassen PCR + Chagas ziekte patiënt (stap 1.5) en van een volwassene PCR - Chagas-vrije individu.
  2. Twee groepen van 12 een-maand-oude BALB/c naïef muizen hield in afzuigkappen onder positieve luchtdruk bij 24 ° C en gevoed voedsel ad libitumgebruiken.
  3. De menselijke Chagas-positieve sperma aliquots (100 µL) inboezemen in de buikvlies en gelijke hoeveelheden in de vagina van de groep-A muizen.
  4. De controle Chagas-gratis sperma aliquots (100 µL) naar het buikvlies en een gelijke hoeveelheid in de vagina van de groep-B muizen inboezemen.
  5. Offeren de experimentele muizen onder verdoving vijf weken na de instillations van het sperma en de weefselsecties onverminderd met Haematoxyline-eosine-kleuring.
  6. Microscopie gebruiken om te zoeken naar T. cruzi trypomastigoten en amastigotes in het hart, de skeletspieren en de voortplantingsorganen in groepen van muizen.

8. overdracht van de T. cruzi infectie door geslachtsgemeenschap

  1. Gebruik 10 mannelijke en vrouwelijke zes weken oude BALB/c muizen in de experimenten.
  2. Inoculeer vijf mannelijke en vijf vrouwelijke muizen intraperitoneally met 1 x 105 T. cruzi trypomastigoten uit de weefselkweek.
  3. De muizen fokken tot drie maanden oud: groep ik zal worden gevormd door vijf T. cruzi-geïnfecteerde vrouwelijke muizen en vijf controle noninfected mannelijke vrienden; groep II zal worden gevormd door vijf T. cruzi -besmette mannelijke en vijf controle noninfected vrouwelijke mates. Groep III zal worden gevormd door de vijf mannelijke en vijf vrouwelijke controle naïef-niet geïnfecteerde stuurlieden.
  4. Huis elke fokken paar in een kooi geplaatst binnen een veilige doos met een 5 mm raster en lock-in deur ter voorkoming van ontsnapping.
  5. Feed de muizen chow en water ad libitum. Een totaal van 70 spenen nakomelingschap in de groepen II en ik gedurende ten minste zes weken te verhogen.
  6. Trekken van bloed door hart punctie uit de ouderlijke (FO) en de nakomelingen (F1) muizen onder verdoving, offeren de muizen en secties van het hart, de skeletspieren en de voortplantingsorganen pathologische p.a. indienen.

9. beoordeling van immuun privilege

  1. Het verkrijgen van weefsels van T. cruzi-besmet en naïef beheersen van muizen (stap 8.6), en snijd de paraffine-ingebedde monsters in 4 µm dik secties.
  2. Verwijder de paraffine en uitdrogen van de secties op glas dia's met diverse wijzigingen van xyleen en gesorteerde wast met 100% tot 70% ethanol, voor elke 1 min.
  3. Incubeer de weefselsecties met 0,05% saponine eens, gevolgd door drie gedestilleerd water wast bij kamertemperatuur.
  4. Blokkeren de weefselsecties met 5% nonfat melkpoeder voor 45 min. Wash de dia's in 0,1 M PBST en Incubeer de secties met de Chagas muis anti-T. cruzi serum of met het niet-geïnfecteerde muis controleserum op een 1:20 verwatering voor 2 h.
  5. De dia's thrice gedurende 5 minuten wassen in PBST en droog bij kamertemperatuur voordat incubatie met een 1:1,000 verdunning van alkalische fosfatase-geconjugeerd konijn-antimuis IgG.
  6. Spoel de dia's in PBST en voeg 100 µL van 3,3' diaminobenzidine voor een 5 min incubatie, gevolgd door drie wast met PBST en counterstaining met Harris Haematoxyline voor 30 s.
  7. De dia's in gedestilleerd water gedurende 5 minuten wassen, ze uitdrogen in 70%, 80%, 90% en 100% ethanol voor 1 min en mount ze in gebufferde glycerine.
  8. De dia's met een heldere-veld lichte Microscoop te onderzoeken, en foto-opnamen met een microcamera met software en een analyzer-programma.
  9. Het document van het immuun voorrecht van de parasiet in de afwezigheid van ontstekingsreacties in de voortplantingsorganen.

10. statistische analyses

  1. Biomedische bewerken voor sequentieanalyse gebruiken, uitvoeren van afstemmingen met BLAST en bepalen van de statistische significantie van de E-value (p < 0,05).
  2. Het uitvoeren van een one-way variantieanalyse (ANOVA) en de test Tukey te vergelijken van de middelen van de OD plus of minus een standaardafwijking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit onderzoek, uitgevoerd overeenkomstig het protocol, gericht op het detecteren van acute gevallen van de ziekte van Chagas met klinische en parasitologische examens. Veneuze bloedmonsters werden onderworpen aan directe microscopisch onderzoek en in vitro cultuur voor groei van de parasiet. Eenentwintig acute gevallen van de ziekte van Chagas toonde T. cruzi in bloed. Het onderzoeksprotocol beveiligd het isolement van T. cruzi ECI1-ECI21 van acute ziekte van Chagas en de DNA-monsters tentoongesteld positieve DNA voetafdrukken in het restant van de studie bevolking: nDNA-PCR testen leverde de typische telomeer herhalen reeks met de huidige evenals de T. cruzi Berenice archetype1188-nt bands. De gevallen van Chagas en hun familieleden die vrijwillig deel te nemen aan de studie werden gegroepeerd in vier families1.

In deze familie studie was de T. cruzi nDNA PCR versterkt met primer ingesteld1,23 gegloeid in de reeks specifieke telomeer uit elk van de 21 acute Chagas-ziekte gevallen. Deze T. cruzi nDNA waarbij gekruist met de specifieke volgorde van de radiolabeled sonde (Figuur 2); de klonen en sequentiebepaling bleek dat de waarbij het T. cruzi 188-nt telomeer herhalen motief bestaat. De specificiteit van deze procedures kruising werd getoond in de negatieve controle uitgevoerd met L. braziliensis promastigoten. De analyse van de pathologie gevalideerd dat de hemoflagellates in de acute Chagas-ziekte patiënten echt virulente waren T. cruzi. We concluderen dat de band T. cruzi nDNA (188-bp) gevonden in de 21 acute Chagas gevallen (Figuur 2) is een directe demonstratie van persistente infecties.

Seksuele overdracht van Trypanosoma cruzi bij de mens

Om te beoordelen van de verhoudingen van de T. cruzi infecties, wij de nucleic acid test voor de opsporing van de hoge gevoeligheid van de footprints van de parasiet in de familie studie bevolking1toegepast. Deze PCR testen, de versterking producten die met de specifieke radiolabeled sonde van 188-nt gekruist nDNA bands in opgericht 76,1% (83/109) van de proefstukken benadert; de resultaten van de zuidelijke kruising van de nDNA-PCR versterking producten met de specifieke 188-nt radiolabeled sonde worden weergegeven in Figuur 3. Bovendien bleek de kruisingen de parasiet DNA in de lijn van de geslachtscellen van de vrijwilliger gezinsleden (Figuur 4).

IIF was werkzaam aan de ECI1 fenotype te ECI21 T. cruzi trypomastigoten met het menselijk serum IgG uit een Chagas ziekte bank serummonster met parasitologische demonstratie van de protozoan in het bloed, en een fluoresceïne geconjugeerd anti-menselijke die IgG werd gebruikt . T. cruzi Berenice was een positieve controle voor het antilichaam van Chagas en de negatieve controle de promastigote van haar familie relatieve L. braziliensis. Figuur 5 toont dat het positieve appelgroen silhouet van het archetype van Berenice met de wild-type correleert T. cruzi envelop weergegeven in de video.

De ELISA en IIF geopenbaard de specifieke T. cruzi antilichamen1,28 in 28,4% (31/109) van de proefstukken benadert. De resultaten van de ELISA en IIF, evenals die van de nDNA-PCR amplicon en zuidelijke kruisingen, worden weergegeven in Figuur 6. De verschillen tussen de resultaten van de nDNA-PCR voetafdrukken en die van het specifieke antilichaam testen zijn afgebeeld in het heredograms (Figuur 7), familie A, vier onderwerpen had positieve nDNA en het anti -T. cruzi antilichaam en 11 waren alleen de positieve nDNA; vijf mannen hadden T. cruzi in het ejaculaat van sperma. In de familie B met 44 personen, 11 had de specifieke T. cruzi antilichaam en 23 had zowel het specifieke antilichaam en de nDNA van de parasiet; zeven personen had T. cruzi in het ejaculaat van sperma. Familie C met 29 leden hadden het antilichaam en de T. cruzi nDNA in vijf personen, en 17 de parasiet nDNA alleen; vier mannen hebben de positieve nDNA-PCR in het ejaculaat van sperma. In familie D, onder 21 11 had het specifieke anti -T. cruzi antilichaam en de voetafdruk van nDNA en negen had positieve nDNA-PCR alleen. Figuur 3, Figuur 6 en Figuur 7 verbeelden de grote verschillen tussen de resultaten, consequent, in de biologische monsters afkomstig van familie onderwerpen in drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd één jaar uit elkaar.

Tabel 1 toont de kwantitatieve verschillen tussen het IIF, de ELISA en de nDNA-PCR-testen in de monsters uit de studie van de menselijke families A-naar-D. De verschillen tussen de ratio's van antilichaam tests (28,4%) en die van de positieve nucleïnezuur assays (76,1%) zijn statistisch significant (p < 0.005). In deze families goed de verschillen tussen groepen T. cruzi -besmette mensen (III en IV) voor 62,6% (52/83) van de bevolking, een positieve nucleic acid test alleen tonen. De grote verschillen tussen de ratio's van positieve nDNA voetafdrukken en die van de specifieke T. cruzi antilichaam werden toegelicht door de experimenten in de kip modelsysteem.

Immuun tolerantie

De evaluatie van de immuunrespons uitgevoerd in groepen van kippen verhoogd tot het volwassen stadium in afzonderlijke kooien in gescheiden doorgangen met naïef controle kippen (A); mock controle kuikens uitgebroed uit eieren geënt met kweekmedium (B); en kippen uitgebroed uit de T. cruzi trypomastigoten-geïnoculeerd eieren (C)26. De volwassen kippen in de groepen B en C drie keer met de formaline-gedood werden uitgedaagd T. cruzi trypomastigote antigeen, wekelijks, zoals in de video. De ELISA en de IIF-tests zijn uitgevoerd met het serum verzameld uit groep A, B en C kippen één maand na de uitdaging. Figuur 8 toont het gebrek aan het specifieke antilichaam in groep A en C kippen, die scherp in met de productie van specifieke antistoffen in groep B geïmmuniseerd met het antigeen T. cruzi contrast . De resultaten toonden duidelijk aan de immune tolerantie in groep C uitgebroed uit de T. cruzi-eieren geënt.

Seksuele transmissie van Probeer panosoma cruzi in een modelsysteem muis

Bovendien bleek de infectiviteit van T. cruzi van Chagas patiënt ejaculaat, die positief in de PCR getest en miste het specifieke antilichaam, via instillations van 100 µL van sperma in de peritoneale holte van mannelijke muizen en via een gelijke hoeveelheid sperma de vagina ingeprent. Vijf weken later, de T. cruzi amastigoot nesten werden ontdekt in het hart en debeenderspieren en bosjes differentiëren van parasieten in het lumen van de zaadleiders en uteriene buis aanwezig waren. Interessant is dat deed de destructieve ontstekingsreacties niet omringen de nesten en de bosjes van het T. cruzi amastigotes (Figuur 9).

De beoordeling van de seksuele transmissie van T. cruzi infecties werd verder uitgevoerd in twee groepen muizen intraperitoneally geënt met 1 x 105 T. cruzi Berenice trypomastigoten vormen1,30, 31. In de experimentele groep I, 10 T. cruzi -mannetjes gekruist met 10 naïef controle vrouwelijke muizen geïnfecteerd. In de experimentele groep II, 10 T. cruzi -besmet vrouwtjes gedekt met 10 naïef controle mannetjes. Figuur 10 laat zien dat de T. cruzi-besmette mannelijke muizen (A-te-E) en de T. cruzi -geïnfecteerde vrouwelijke muizen (F-tot en met G) leverde 188-bp nDNA bands (oneven nummers). Fokken verwierf de naïeve mates (even nummers) gemakkelijk T. cruzi na een unieke seksuele ontmoeting met een chagasic partner. Soortgelijke herhalen experimenten onder identieke omstandigheden bevestigd dat elke naïef vrouwelijke of mannelijke muis die seksueel met een T. cruzi gekruist-besmette mannelijke of vrouwelijke verworven de Flagellata infectie. De oprichters van deze nDNA-positieve (F0) gegenereerd nakomelingen die zij naar tot de leeftijd van zes weken voren. Dan, de test en de controle niet-geïnfecteerde muizen bled via hart punctie moesten verzamelen van ongeveer 0,5 mL bloed. De nDNA-PCR-testen is gebleken dat de stichters (F0) seksueel verworven infecties werden doorgegeven aan het nageslacht van de F1, zoals blijkt uit de 188-bp nDNA bands (Figuur 11). De nakomelingen van de F1 waren nDNA-positieve in 41 van de 70 (58,6%) monsters onderzocht. Van deze muizen met nDNA bands suggestief van verticaal verworven infecties, zo weinig zoals 9 van 41 (22%) had T. cruzi antilichamen.

De F1 nakomelingen muizen werden opgeofferd onder verdoving en de lichaamsweefsels werden onderworpen aan pathologische en immuun peroxidase-kleuring analyses. De resultaten van deze experimenten worden weergegeven in Figuur 12. De resultaten voor de amastigotes T. cruzi werden gedocumenteerd in de interstitiële cellen van de bijbal en goniablasts; amastigotes differentiëren in trypomastigoten waren aanwezig in het lumen van seminiferous buisjes in het ontbreken van ontstekingsreacties.

Figure 1
Figuur 1 . Trypanosoma cruzi infectie in de seminiferous zaadvormende van een jongen die stierf van acute ziekte van Chagas . Microphotograph vanuit dokter Teixeira de bestand, 197018. De T. cruzi vormen zijn in goniablasts, en bosjes amastigotes en gratis trypomastigoten (pijlen) zijn aanwezig in het lumen van de seminiferous zaadvormende in de afwezigheid van inflammatoire infiltreert1. De Haematoxyline-eosine vlekken. Bar, 20 µm. herdrukt met toestemming van de uitgever en de auteurs1,19.

Figure 2
Figuur 2 . De voetafdruk van Trypanosoma cruzi van acute ziekte van Chagas. De T. cruzi nDNA-PCR versterking producten gevormd 188-nt bands met een specifieke radiolabeled sonde van 188-nt. TC, T. cruzi; NC, negatieve controle. Overgenomen met toestemming van de uitgever en de auteur1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Zuidelijke bevlekken analyse van Trypanosoma cruzi infecties in de onderwerpen van menselijke studie gezinnen. Familie A - alle 15 onderwerpen toonde de specifieke nDNA-PCR 188-nt bands. In familie B vormde een totaal van 35 van de 43 onderwerpen (81,4%) de specifieke nDNA-banden. In familie C vormde tussen 29 leden, 22 (75,8%) de nDNA bands. Familie d had 11 van 21 onderwerpen (52,4%) de nDNA bands. De T. cruzi-specifieke nDNA bands werden bevestigd door klonen en sequentiebepaling. Overgenomen met toestemming van de uitgever en de auteur1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . De actieve Trypanosoma cruzi infecties in het sperma ejaculeren van studie familie vrijwilligers. De infecties in Chagas patiënten ejaculeert geïdentificeerd door de banden van de 188-bp nDNA-PCR. TC, T. cruzi positieve controle. NC, L. braziliensis negatieve controle. Overgenomen met toestemming van de uitgever en de auteur1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Het fenotype van Trypanosoma cruzi met de Chagas ziekte patiënten serum antilichaam. T. cruzi geïdentificeerd met de Chagas serum IgG antilichamen die de trypomastigote van de parasiet herkent met een FITC-geëtiketteerden monoclonal Ab anti-menselijke IgG behandeld. De anti-T. cruzi Ab herkent Leishmania braziliensis promastigoten niet. De inzetstukken tonen de negatieve controles. Bars, 20 µm. herdrukt met toestemming van de uitgever en de auteur1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 6
Figuur 6 . Grafische weergave van de ELISAs en de nDNA-PCR testen in de familie studie bevolking. Groep I (n = 10) en groep II (n = 20) waren van de negatieve controle en de positieve controlesera, respectievelijk, van T. cruzi infecties met parasitologische demonstratie. Groep III (n = 31) monsters van familie onderwerpen met de 188-bp nDNA bands en specifieke antilichamen aan T. cruziopgenomen. Groep IV (n = 52) samengesteld monster van onderwerpen met T. cruzi infecties gedetecteerd door de nDNA-PCR 188-nt waarbij bij gebrek aan het specifieke antilichaam. Groep V (n = 26) waren negatief test samples, bestaande uit de infectie-vrije mensen in de familie studie. Overgenomen met toestemming van de uitgever en de auteur1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 . De heredograms en de toewijzing van de Trypanosoma cruzi- familie bevolking besmet. De figuur toont de verschillen tussen de ratio's van de anti -T. cruzi antilichaam en die van de nDNA-PCR-testen. Open vierkant en cirkel, negatieve man en vrouw. Rode vierkanten en cirkels, positieve anti -T. cruzi antilichaam en nDNA-PCR. Zwarte vierkanten en cirkels, positieve nDNA-PCR alleen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 8
Figuur 8 . De immuun tolerantie bij kuikens uitgebroed uit Trypanosoma cruzi- eieren geïnoculeerd. A) preimmune antilichaam profiel in de mock controle kippen (n = 10). B) de specifieke antilichaamrespons in het besturingselement naïef kippen uitgedaagd met de T. cruzi antigeen (n = 20). C) het ontbreken van een specifieke immuunrespons bij kuikens uitgebroed uit de T. cruzi-eieren na uitdaging met het antigeen T. cruzi geënt (n = 20). Het verschil van de optische dichtheid tussen A en C (024 ± 0,17) naar B (0,85 ± 0,6) is statistisch significant (p < 0,05). Dit cijfer is gewijzigd van referentie26 , en is herdrukt met toestemming van de uitgever en de auteur.

Figure 9
Figuur 9 . De infectieuze Trypanosoma cruzi in menselijke ejaculeert vertaalt zich in een actieve lymfkliertest infectie. Aliquots van Chagas patiënt ejaculeert waren ingeprent in de peritoneale holte of in de vagina van muizen. De muizen werden opgeofferd drie weken na toediening. Top lane, T. cruzi amastigotes nesten in het hart (links) en in de skeletspieren (rechts). Onderkant lane, T. cruzi amastigoot nesten in de zaadleiders (links) en in de baarmoeder buis (rechts). De invoegen toont een scheidslijn amastigoot (cirkel). Let op het ontbreken van inflammatoire infiltreert in de weefselsecties. De Haematoxyline-eosine vlekken. Bars: boven- en onderkant links, 20 µm; rechtsonder, 10 µm. herdrukt met toestemming van de uitgever en de auteur1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10 . De seksuele transmissie van Trypanosoma cruzi infecties in de muis model systeem door geslachtsgemeenschap. De transmissie van het T. cruzi infecties van chagasic naïef stuurlieden aangetoond door de specifieke nDNA 188-bp bands geopenbaard in de zuidelijke kruisingen. Top lane) Prebreeding profielen van de PCR versterking producten van de T. cruzi -besmette muizen en de naïeve muizen. De oneven nummers geven de T. cruzi-besmette mannelijke A-te-E en F-aan-ik vrouwelijke muis monsters. De even nummers zijn naïeve vrouw (2-tot-10) en mannelijke (12-tot-20) muizen. Onder de lane, na het kweken, de profielen tonen aan dat zelfs muizen 2-tot-20 verworven T. cruzi infecties. Overgenomen met toestemming van de uitgever en de auteur1,30. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11 . De Trypanosoma cruzi infectie wordt verticaal overgedragen van de ouderlijke F0-chagasic naar de F1 nakomelingen muizen. De chagasic ouder verzonden de T. cruzi infecties door een enkele fokken ontmoeting. De T. cruzi-besmette vrouwen werden gedekt door naïef mannetjes A-E, en de naïeve vrouwtjes werden gedekt door de T. cruzi -besmet mannetjes F-J. Na fokken, alle oprichters (F0) toonde de positieve eencellige nDNA-PCR 188-bp-band. Southern blotting geopenbaard de specifieke nDNA-band na de kruising met de radiolabeled sonde 188-nt in een meerderheid van de nesten van de F1. NC, L. braziliensis negatieve controle; TC, T. cruzi positieve controle. Overgenomen met toestemming van de uitgever en de auteur1,31. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 12
Figuur 12 . De histopathologie gedocumenteerd Trypanosoma cruzi seksueel overdraagbare van F0 tot F1 nageslacht en immuun tolerantie in de afwezigheid van een ontstekingsreactie. De secties tonen groei van de T. cruzi vormen in de bijbal, goniablasts en de seminiferous tubuli van de F1-muizen. De muizen werden opgeofferd onder verdoving en de immuun peroxidase gebeitste secties werden onderzocht onder een microscoop. De photomicrographs Toon bruinachtig immuun peroxidase gebeitste T. cruzi amastigotes in de interstitiële van de bijbal ()A) en bosjes amastigotes differentiëren in trypomastigoten werpen in het lumen van de seminiferous zaadvormende (B, C en F). De amastigoot nest gezien in een goniablast (D). Van de positieve controle muis seminiferous zaadvormende normale histologie (E). Let op het ontbreken van inflammatoire infiltreert in de teelballen van de F1-muizen met ladingen van de Chagas parasieten. De Giemsa-kleuring. Bars: A, B, C en E, 20 µm; D en F, 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1. De verschillen tussen de ratio's van positieve IIF en ELISA examens en die van nDNA-PCR testen in de monsters verzameld uit de studie van de menselijke families A-naar-D *

Groepen ** ELISA: serum anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA-PCR (%)
-Control Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - Control Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-free Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Resultaten van drie onafhankelijke ELISA en nDNA-PCR-tests uitvoeren in de monsters die in drie verschillende gelegenheden op jaar 1, 2 en 3. [1]. de versterking van de 188-nt- T. cruzi DNA Herhaal bevestigd door klonen en sequentiebepaling.
** De verschillen tussen (groepen I en V) negatieve en de positieve onderwerpen (groepen III en IV) zijn statistisch significant (p < 0,05).
ᵟ de verschillen tussen de groepen III en IV te verklaren door de immuun tolerantie in de afwezigheid van het antilichaam T. cruzi bereikt in 62,6% (52/83) van de positieve PCR-onderwerpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin bespreken wij een onderzoeksprotocol gezinsgerichte die beantwoord de vraag of de mens de ziekte van Chagas vloeit uit seksueel overdraagbare intraspecies T. cruzi voort infecties. Vroege studies kon niet aantonen dat de seksuele transmissie van T. cruzi infecties, waarschijnlijk omdat de beschikbare gegevens en informatie over de ziekte van Chagas afzonderlijk werden verkregen uit de individuele3,-4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Het vinden van T. cruzi in de seminiferous zaadvormende van een jongen (Figuur 1) was de vonk die klinisch en epidemiologisch onderzoek gestimuleerd. Na decennia, denkbaar wanneer familie studeren benaderingen en de technologieën beschreven in dit onderzoeksprotocol beschikbaar waren, T. cruzi levenscyclus stadia verscheen in de menselijke ejaculaat1,19.

De directe parasitologische demonstratie van de protozoan in 21 acute Chagas-ziekte gevallen was cruciaal voor het valideren van de nDNA-PCR versterking producten, die specifieke bands in monsters van alle onderwerpen scherp besmet met T. cruzi opgericht. Deze point-of-care laboratorium markering geëvalueerd de resultaten van de immunologische en nucleic acid tests. De fundamentele lange-termijn Chagas ziekte familie studie, combineert daarom de bevindingen bij de mens met die verkregen in groepen van proefdieren. Het onderzoek volgens het protocol onthuld voor de eerste keer dat T. cruzi infecties zijn seksueel overdraagbare in mens1.

Het brede verschil tussen de ratio's van de parasiet-specifieke antilichaam testen en die van de tests van de nucleïnezuur geeft aan dat de meerderheid van de footprints van de nDNA gevolg van SOA gevallen in de afwezigheid van specifieke anti T. cruzi antilichamen. Dus, de seksuele transmissie van T. cruzi in de familie leden exposeren van positieve nDNA bij gebrek aan de specifieke IgG antilichamen was te wijten aan immuun tolerantie.

Immuun tolerantie werd aangetoond in een kip modelsysteem vuurvaste T. cruzi infecties na de eerste week van embryonale groei1,25,26,32,33, 34. Daarna het onrijpe immuunsysteem onvermogen om te herkennen van de parasiet, zoals een buitenlandse component van het lichaam van de kip laat volwassen immuunsysteem tolerantie ten opzichte van T cruzi. Gezien deze resultaten is tolerantie een natuurverschijnsel1 als gevolg van het immuunsysteem zelf-erkenning en het onderhoud van zijn eigen lichaam componenten onder fysiologische omstandigheden25,26, 32 , 33 , 34. de verschuiving van de Braziliaanse deelstaat immuun tolerantie-doorbraak tot auto-immune ziekte van Chagas hart kan daarom worden geassocieerd met effector cel wijzigingen als gevolg van T. cruzi kinetoplast (kDNA) mutaties in van de host genoom1 ,2,14,23,25,26.

De kritische stappen in het onderzoeksprotocol beschrijven de belangrijkste techniek wijziging en probleemoplossing om te onthullen van de seksueel overdraagbare Chagas parasieten1,14,23,25, 26: ik) selecteren studie gezinnen met gevallen van acute Chagas ziekte35,36; ii) isoleren van wild-type T. cruzi uit het bloed van de acute gevallen; iii) verkrijgen DNA-monsters uit de families deelnemers bloed flagellaten, van de Berenice T. cruzi archetype van positieve deidentified bank DNA-monsters en van de negatieve controle L. braziliensis; iv) presterende netjes technische procedures om aan te tonen dat de deelnemers flagellaten nDNA voetafdruk identiek aan die van het archetype van Berenice T. cruzi en die positieve bank DNA-monsters is; v) operationeel onafhankelijke drievoudige nDNA footprinting om aan te tonen van de T. cruzi infecties in de gezinsleden bij drie gelegenheden een jaar uit elkaar; vi) ervoor te zorgen dat de techniek van de nDNA-PCR uitgevoerd op het punt van zorg resultaten bevestigd levert door klonen en het rangschikken van alle waarbij gegloeid om de specifieke primer ingesteld, dus consequent tonen de T. cruzi 188-nt volgorde 1,25,28,29,30; vii) met behulp van kwalitatief hoogwaardige handelsmerk reagentia te reproduceren de antilichamen titers nog in serummonsters verzameld op drie verschillende tijdstippen; viii) het protocol van de familie studie bleek de bestaande live infectie in de geslachtscellen van de lijn bij de demonstratie van de nDNA T. cruzi bij ontstentenis van specifieke serum antistoffen in het sperma ejaculeert verzameld van Chagas parasiet-besmet individuen1; ix) de vooruitzichten is dat het onderzoeksprotocol ontworpen te ontrafelen de seksueel overdraagbare infecties T. cruzi dient de autochtone Chagas-ziekte op vijf continenten; x) de nDNA en de kDNA voetafdrukken veilig de diagnose van chronische asymptomatische Chagas-ziekte in mensen1,2; xi) bij gebrek aan de nDNA, de mutatievan het T. cruzi kDNA reeks1,2,23,25,26 alleen is een laboratorium marker voor het bereiken van de differentiaaldiagnose van de idiopathische verwijde hartziekten23,25,37,38,39.

Bovendien konden de virulente T. cruzi gedocumenteerd in Chagas patiënt ejaculeert initiëren van wijdverbreide infecties bij instillation in de vagina van de muis en in haar buikvlies holte. De pathologie studie toonde T. cruzi amastigoot nesten in het hart en debeenderspieren zo goed als in de zaadleiders en uteriene buis. Interessant is dat de parasiet nesten deed niet leiden tot ontstekingsreacties die vitale reproductieve functies zou belemmeren. Het ontbreken van ontstekingsreacties maakt het immuun voorrecht in vitale functioneel orgaan structuren40,41,42,43,44,45 en daarom verklaart de uncurbed groei van T. cruzi in de voortplantingsorganen.

Bovendien, de experimentele studies bij chagasic muizen die met naïef stuurlieden gefokt verder uitgelegd de seksuele transmissie van T. cruzi infecties bij de mens. De besmette vrouwtjes en mannetjes verzonden de T. cruzi infecties aan de niet-geïnfecteerde naïef-mates tijdens geslachtsgemeenschap, en de meerderheid van hun nesten verworven de T. cruzi verticaal overgedragen van bovenliggende aan nakomelingen. In deze experimenten waarnaar de beginfase wordt de groei van T. cruzi in de buis en in de baarmoeder, evenals in de seminiferous zaadvormende en de zaadleider, waar het immuun voorrecht plaatsgevonden heeft. Vervolgens, seksuele transmissie plaatsgevonden door de parasitaire stadia in het sperma of in de baarmoeder afscheidingen in de vagina. Immuun privilege40,41,42,43,44,45 is een fenomeen waarmee sommige organen (reproductieve systeem, ogen en hersenen) naar downregulate ontstekingsreacties en voorkomen van schade aan belangrijke, gevoelige en specifieke functies40. Hormonen41 en verschillende immuun factoren downregulate macrofagen41,42,43, natural killer cellen41T-lymfocyten en T-regulerende (Walter) cellen, aldus orkestreren van de remming van een aantal proinflammatoire cytokines en immuun-privilege triggers40,41,42,43,44,45.

De seksuele transmissie van T. cruzi infecties van mannetjes en vrouwtjes naïef partners geeft aan dat de controle van de ziekte van Chagas internationale solidariteit vereist. De resultaten besproken hierin suggereren dat meer creatieve onderzoek nodig is. De volgende onmiddellijke doelstellingen zijn haalbaar: ik) te ontwikkelen voor high-throughput platformen voor specifieke en zeer gevoelige nucleïnezuur testen om een accurate diagnose, aiming voor de preventie van infecties overgedragen door geslachtsgemeenschap, bloedtransfusie en orgaantransplantatie, alsmede het vergemakkelijken van de klinische en epidemiologische onderzoeken om te bepalen van de diagnose en de prevalentie van de ziekte van Chagas; ii) ter bevordering van een multicenter drug development programma om nieuwe drugs voor de uitroeiing van T. cruzi infecties; en iii) uit te voeren van een passend onderwijs-, voorlichtings- en communicatiestrategie programma waarin de deelname van scholen, kerken, maatschappelijke organisaties, en instellingen voor gezondheidszorg om te voorkomen dat de verspreiding van de ziekte van Chagas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij erkennen de laboratoriumfaciliteiten en de kritische opmerkingen van Izabela Dourado, Carla Araujo, en slimme Gomes en de technische bijstand van Bruno Dalago en Rafael Andrade. We zijn dank verschuldigd aan de Stichting voor de vooruitgang van wetenschap (FAPDF), The National Research Council, ministerie van wetenschap en technologie (CNPq/MCT), en het Agentschap voor opleiding Human Resources, ministerie van onderwijs (CAPES / ME), Brazilië, voor de ondersteuning van deze onderzoeken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Tags

Immunologie en infecties probleem 143 familie studie, Trypanosoma cruzi sperma ejaculeert baarmoeder secretie muis modelsysteem verticale overdracht immuun bevoegdheid kip modelsysteem immuun tolerantie de ziekte van Chagas.
Seksuele transmissie van Amerikaanse trypanosomen van mannetjes en vrouwtjes te naïeve Mates
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter