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Immunology and Infection

Trasmissione sessuale dell'americano Trypanosomes da maschi e femmine ai compagni di Naive

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

L'agente di Trypanosoma cruzi di malattia di Chagas produce infezioni asintomatiche di lunga durata che improvvisamente trasformarsi in patologia clinicamente riconosciuta. Il seguente protocollo di ricerca descrive uno studio epidemiologico a breve termine basati sulla famiglia per svelare il T. cruzi infezione sessualmente trasmessa dal padre alla progenie.

Abstract

Tripanosomiasi americana è trasmesso agli esseri umani da bug triatomine attraverso l'ingestione di alimenti contaminati, da trasfusioni di sangue o accidentalmente in ospedali e laboratori di ricerca. Inoltre, l'infezione di Trypanosoma cruzi è trasmesso congenitamente da una madre chagasic alla prole, ma il contributo del partner maschile alla contaminazione nell'utero è sconosciuto. I risultati di nidi e ciuffi di amastigoti e tripomastigoti nelle cellule del theca dell'ovaia, nel goniablasts e nel lume del tubulo seminifero suggeriscono che T. cruzi infezioni vengono trasmesse sessualmente. Il protocollo di ricerca questo documento presenta i risultati di una popolazione di studio della famiglia risultati parassita nucleare del DNA in cellule mononucleari del sangue diploide e i gameti aploidi dei soggetti umani. Così, tre indipendenti campioni biologici raccolti un anno parte confermato che T. cruzi infezioni sessualmente sono stati trasmessi alla progenie. Interessante, lo specifico anticorpo di T. cruzi era assente nella maggior parte della famiglia progenie che portava la tolleranza immunitaria all'antigene di parassita. Tolleranza immunologica è stata dimostrata in refrattario alla T. cruzi di pollo dopo la prima settimana di sviluppo embrionale, e pulcini nati da uova inoculate flagellati erano in grado di produrre l'anticorpo specifico. Inoltre, l'instillazione dello sperma umano eiacula intraperitonealmente o nella vagina di topi ingenuo ha reso T. cruzi amastigoti nel epididimo, tubulo seminifero, deferenti e tuba uterina con un'assenza di infiammatoria reazioni negli organi immuni privilegiati della riproduzione. L'allevamento di T. cruzi-infetti topi maschi e femmine con i compagni di ingenuo ha provocato acquisizione delle infezioni, che più successivamente sono stati trasmessi alla progenie. Di conseguenza, un robusto programma di formazione, informazione e comunicazione che coinvolge la popolazione e le organizzazioni sociali è ritenuto necessario per prevenire la malattia di Chagas.

Introduction

Il protozoo parassita Trypanosoma cruzi appartenente alla famiglia Trypanosomatidae subisce le fasi del ciclo di vita trypomastigote e amastigote in ospiti mammiferi ed esiste come epimastigotes nel vettore di insetto (Reduviid: eziologico) dell'intestino e in coltura. Negli ultimi decenni, diversi studi hanno dimostrato la presenza di malattia di Chagas in paesi su quattro continenti considerato bug triatomine gratis1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; la dispersione dei tripanosomi americane inizialmente è stata attribuita agli immigrati latino-americani all'emisfero nordico, ma la possibilità che alcuni sono casi autoctoni di malattia di Chagas non può essere negata3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la fonte endogena solo riconoscibile di trasmissione di T. cruzi è stata attribuita al trasferimento della madre chagasic del parassita alla prole in circa il 10% delle gravidanze15; contributo del partner maschile nell'utero infezioni attraverso lo sperma eiacula è rimasto non riconosciuto.

Più di un secolo fa, gli investigatori16,17 osservato intracellulare T. cruzi amastigoti nelle cellule del theca dell'ovaia e nel germe linea cellule dei testicoli dei casi acuti di malattia di Chagas. I nidi e ciuffi di T. cruzi tripomastigoti e amastigoti in cellule del theca dell'ovaia, in goniablasts e nel lume del tubulo seminifero (Figura 1) di casi di malattia di Chagas acuti mortali sviluppano privilegio immune negli organi di riproduzione in assenza dell'infiammatorio si infiltra in18,19. Negli ultimi decenni, alcuni studi sperimentali hanno dimostrato nidi delle forme rotonde amastigote di T. cruzi nel tubulo seminifero, epididimo e dotto deferente anche come in utero, ovaia e tubi di cellule della teca di acutamente infettate topi 1,20,21,22. Inoltre, nel corso di studi della famiglia per documentare il trasferimento di protozoo il DNA mitocondriale parentale Chagas pazienti ai loro discendenti, T. cruzi DNA nucleare (nDNA) è stato verificato in germinale aploide umana linea cellule23, e fasi di ciclo di vita del parassita sono stati osservati nell'eiacula di chagasic topi24. Questi risultati sono in accordo i rapporti sulla tolleranza immunitaria conseguito con la progenie di T. cruzi -infettati padroni di casa in assenza di anticorpo specifico1,25,26. Inoltre, rapporti epidemiologici che ha suggerito la diffusione della malattia di Chagas endemica per gli altri continenti3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 sono ora supportati dagli studi sperimentali mostrano che la malattia di Chagas possa essere trasmessa sessualmente1 . La ricerca attuale presenta un protocollo di studio epidemiologico della famiglia e mostra che T. cruzi infezione si propaga attraverso i rapporti sessuali.

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Protocol

L'essere umano e i comitati di ricerca animale della facoltà di medicina dell'Università di Brasilia ha approvato tutte le procedure con soggetti umani e animali da laboratorio, rispettivamente, nei protocolli di ricerca 2500.167567 e 10411/2011. Il comitato etico di pubblico Ospedale Fondazione Gaspar Vianna (protocollo n º 054/2009 e CONEP 11163/2009) ha approvato i moduli di consenso libero per lo studio sul campo, con estensione al Ministero della salute Commissione nazionale sulla ricerca umana (CONEP 2585/04). Il protocollo è stato adeguato per valutare T. cruzi del DNA nelle cellule mononucleari del sangue diploide e nei gameti aploidi di sperma eiacula. Gli animali di laboratorio hanno ricevuto assistenza umana; i topi, sottoposti a cuore puntura prima del sacrificio, erano sotto anestesia.

1. reclutamento dei partecipanti umani

  1. Garantire che il team di ricerca partecipa in un programma di malattia di Chagas sistema salute per fornire assistenza sanitaria ai pazienti di Chagas.
  2. Reclutare i partecipanti umani da famiglie iscritti al programma, mostrando in almeno un caso con febbre, malessere, mal di testa, tachicardia e l'edema, i principali sintomi clinici del Chagas acuta malattia14.
  3. Fornire assistenza sanitaria al popolo nelle famiglie Studio per un periodo di cinque anni.
  4. Ottenere 15 mL di sangue venoso da partecipanti allo studio in tre occasioni un anno di distanza, dividere il campione in tre aliquote di 5 mL e conservarli in frigorifero a 4 ° C.
  5. Raccogliere 2 mL dello sperma eiacula da familiari volontari adulti e procedere come descritto al punto 3.3.

2. crescita dei parassiti

  1. Utilizzando l'aliquota dal passaggio 1.4, mescolare il sangue con 5 unità di eparina sodica anticlotting; fare una cultura di pendio tramite l'inoculazione di sangue da famiglia partecipanti con la diagnosi della malattia di Chagas acuta.
    1. Inoculare 5 mL di sangue non coagulato in un'inclinazione di agar-sangue di 50 mL tappo a vite tubo plus 5 mL di mezzo di infusione del fegato-Triptosio (LIT) e incubare il campione in uno shaker a 27 ° C per 3 mesi.
    2. Mettere 100 µ l del surnatante mezzo sopra lastre di vetro, coprire con scivolate e ricerca del sangue epimastigotes di T. cruzi sotto il microscopio, ogni quattro settimane.
    3. Raccogliere gli isolati di epimastigote nel surnatante di axeniche LIT medio a 27 ° C; lavare le cellule in PBS pH 7.4, centrifugare a 1.000 x g per 10 min; diluire il epimastigotes nel pellet in 5 mL di mezzo essenziale di Dulbecco modificato (DMEM).
    4. Inoculare i matracci di cultura di L6 muscolo cellule confluenti con 1 x 106 ECI1-a-ECI21 T. cruzi epimastigote isola.
    5. Crescere il T. cruzi ECI1-a-ECI21 e i tripomastigoti archetipo di Berenice in colture di cellule di muscolo L6 in matracci di cultura di 75 mL.
    6. Nutrire le cellule con 15 mL di DMEM a pH 7,4 completati con 5% di siero bovino fetale, 100 UI/mL di penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina, 250 nM L-Glutammina e 5% CO2 a 37 ° C1.
    7. Utilizzare il controllo positivo T. cruzi Berenice tripomastigoti al fenotipo ECI1-a-ECI21 isolati dalla coltura del tessuto, come descritto al punto 5.2.
    8. Crescere il controllo negativo Leishmania braziliensis27 in DMEM completate con 20% siero bovino fetale solo e utilizzare i promastigotes parassita come controllo negativo.
    9. Utilizzare 1 x 106 T. cruzi ECI1-a-ECI21 tripomastigoti nel surnatante da coltura delle cellule per infettare i topi.
    10. Ricerca di T. cruzi tripomastigoti nel sangue coda dopo la prima settimana dell'infezione.
    11. Cerca i nidi di amastigoti in ematossilina-eosina macchiato sezioni del cuore, muscolo scheletrico e gli organi riproduttivi dei topi infetti, un mese da allora in poi.

3. DNA estrazione e analisi PCR

  1. Posizionare 5 mL di sangue (passo 1.4) aliquota in una sterile provetta EDTA ed effettuare centrifugazione in gradiente di densità per 45 min a 3.000 x g. Utilizzare una pipetta per raccogliere le cellule mononucleari dalla fase biancastra sopra le cellule rosse, lavare i globuli bianchi due volte in 5 mL di PBS, pH 7.4, mediante centrifugazione per 10 min a 1.500 x g in un tubo diverso da 15 mL e utilizzare le cellule per l'estrazione di DNA.
  2. Estrarre il DNA da ECI-1 a ECI-21 T. cruzi, dal controllo positivo Berenice T. cruzi, dal controllo negativo L. braziliensis (passo 2.1.8) e dalle cellule mononucleari di sangue di prova della famiglia umana 109 studiare soggetti1 , 27 , 28.
  3. Diluire 2 mL di sperma campioni ottenuti nel passaggio 1.5 in DMEM (1:4, v/v); Incubare per 45 min a 5% CO2 e 37 ° C, recuperare gli spermatozoi dal surnatante dopo centrifugazione per 5 min a 13.000 x ged estrarre il DNA aploide23.
  4. Posizionare 1 mL delle cellule nel tampone di estrazione (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1% SDS, 0,04% proteinasi-K e 1% dithiothreitol) e mescolare le soluzioni di inversione e agitazione.
    1. Centrifugare le soluzioni per 10 min a 13.000 x g e a 25 ° C e trasferire il surnatante viscoso a una colonna di spin.
    2. Centrifugare la colonna di spin per 1 min a 10.000 x g e gettare l'eluato; aggiungere 500 µ l di tampone di associazione alla colonna di spin (Tabella materiali), e centrifugare per 1 min a 12.000 x ge scartare l'eluato.
    3. Aggiungere 600 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin, e centrifugare per 1 min a 12.000 x ge scartare l'eluato.
    4. Ripetere questo passaggio due volte e trasferimento alla colonna di spin in una provetta da centrifuga micro sterili da 1,5 mL.
    5. Aggiungere 100 µ l di buffer di TE, incubare la provetta a temperatura ambiente per 2 min e poi Centrifugare la provetta per 1 min a 12.000 x g. Il tampone nel tubo del microcentrifuge contiene il DNA.
    6. Misurare le concentrazioni di DNA eseguendo le aliquote su gel di agarosio 0.8% e leggendo l'assorbanza a 260 nm con uno spettrofotometro. Conservare i campioni di DNA a-20 ° C fino all'utilizzo nell'analisi PCR.
  5. Uso T. cruzi Tcz1/2 primer ricotto alla sequenza specifico 188-nt specifico del telomero sonda29 ed eseguire la PCR con DNA da sangue e sperma degli oggetti di studio della famiglia, da controllo positivo Berenice T. cruzi e dalla L. braziliensis controllo negativo.
    1. Preparare la miscela PCR con 10 ng di DNA campione, 0,4 µM di ciascuna coppia di primer, 2 U di Taq DNA polimerasi, 0,2 µM dNTP e 15 µM MgCl2 in un volume finale di 25 µ l.
    2. Avviare il programma di amplificazione del DNA a 94 ° C per 30 s per denaturare il modello e raffreddare i campioni a 55 ° C per 30 s. Quindi, incubare i campioni a 94 ° C per 90 s di estendere i primer Ricotti. La temperatura di ritorno a 94 ° C per 30 s per iniziare il ciclo successivo e incubare i campioni altri 3 min a 72 ° C. Alla fine del ciclo 32nd , raffreddare i campioni per 10 min a temperatura ambiente e conservarli in frigorifero a 4 ° C29.
    3. Amplificare una sequenza di ripetizione del telomero T. cruzi DNA temprata al Tcz1/2 primer alle due estremità.
    4. Analizzare i prodotti di amplificazione su gel di agarosio 1,3% e osservare le bande di DNA 188-nt un UV-illuminatore.

4. l'ibridazione del sud

Nota: L'ibridazione del sud era utilizzato per scartare la maggior parte degli ampliconi PCR positivi falsi nel gel dell'agarosi.

  1. Sottoporre i prodotti di amplificazione di PCR da comandi non infetti, da Chagas casi controlli positivi, da 109 campioni di DNA diploide e dal DNA aploide di 21 studio familiare ai partecipanti di ibridazioni del sud .
  2. Impiegare la sonda di sequenza del telomero di DNA specifico di T. cruzi 188-nt ricottura per il Tcz1/2 iniettori indicati; etichettare la sonda con [α -32P] 2'-deossiadenosina trifosfato (dATP) utilizzando un kit di contrassegno dell'iniettore casuale e analizzare i prodotti di amplificazione su gel di agarosio 1,3% a 60 V durante la notte a 4 ° C.
  3. Trasferire il gel ad una membrana di nylon positivamente caricato utilizzando il metodo capillare durante la notte.
  4. Ibridare le bande di DNA trasferite alla membrana di nylon con la sonda radioattiva 188-nt, che lega il digest di EcoR1 del DNA genomic in 25 µ l di buffer di enzima specifico per periodi variabili.
  5. Lavare la membrana due volte per 15 min a 65 ° C con 2 x SSC e 0.1% di SDS.
  6. Esporre le pellicole di raggi x per la membrana di nylon e autoradiograph le bande sulla membrana per una settimana.
  7. Crescere i cloni selezionati da PCR e del sud di ibridazione con i prodotti di amplificazione di PCR di T. cruzi , che sono ibridato con la sonda di DNA radioattiva specifica.
  8. In commercio sequenza i cloni utilizzando i primers Tcz1/2 impostati ricotti a specifici del telomero2,impronta da T. cruzi -23.

5. analisi immunologiche

Nota: La sensibilità e la specificità dell'immunofluorescenza indiretta (IIF) e dell'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) sono stati valutati nel siero da sei pazienti di Chagas con parassitemia dimostrabile e da sei privo di Chagas, compararli siero campioni di banca. Le analisi condotte con le diluizioni doppie del siero in PBS, pH 7.4, ha rivelate che il IIF alle diluizioni 1: 100 ed ELISA densità ottiche (ODs) a 0,150 e sopra separati il positivo dai risultati negativi.

  1. Utilizzare 5 mL di sangue non coagulato aliquota (passo 1.4) conservato a temperatura ambiente per 1 h ed e centrifugare a 1.500 x g per 30 min separare il siero nel surnatante.
  2. Eseguire IIF ed ELISA in triplice copia 1: 100 diluizioni del siero per rilevare gli antigeni T. cruzi e L. braziliensis , come descritto in precedenza28.
  3. IIF
    1. Condurre l'analisi IIF in diluizioni del siero triplici di campioni degli oggetti di 109 studio ottenuti in tre occasioni un anno apart.
    2. Posto 5 sospensioni µ l di formalina 1% - trattati di T. cruzi epimastigotes o L. braziliensis promastigotes su vetrini; Lasciate il pernottamento asciutto di parassiti in una cappa a temperatura ambiente e conservare i vetrini a-20 ° C fino all'utilizzo.
    3. Posto 20 µ l di diluizioni del siero dei pazienti sopra lastre di vetro rivestito con 5 µ l del epimastigotes di T. cruzi formalina-ucciso (10 parassiti / µ l) o L. braziliensis promastigotes.
    4. Incubare il vetrino di vetro coperto con una scivolata per 1h in una camera umida a 37 ° C e lavare tre volte con PBS.
    5. Incubare il vetrino asciugato ad aria con una diluizione di 1:1,000 di un anticorpo di coniglio della fluorescina-etichettati (Tabella materiali) IgG umani per 1h a 37 ° C; lavare e asciugare il vetrino.
    6. Montare il vetrino con un vetrino coprioggetto ed esaminarlo sotto un microscopio a luce UV.
      Nota: Un esame positivo è un verde mela T. cruzi epimastigote sagoma, mostrato nel video.
  4. ELISA
    1. Eseguire un test ELISA per rilevare il T. cruzi e L. braziliensis gli antigeni solubili (1 µ g/100 µ l in tampone carbonato di 0,1 M, pH 9,6) su micropiastra pozzetti.
    2. Incubare le diluizioni del siero di 1: 100 in triplice copia pozzetti per 2 h a temperatura ambiente.
    3. Lavare le piastre tre volte con PBST (PBS contenente 0.5% Tween-20), pH 7,4, soluzione prima dell'essiccazione.
    4. Incubare le piastre con 50 µ l di una diluizione di 1:1,000 di anticorpo di IgG anti-umano di coniglio per 90 min a 37 ° C.
    5. Lavare le piastre tre volte con soluzione PBST e lasciarli asciugare a temperatura ambiente.
    6. Incubare le piastre con 100 µ l di 1:1,000 diluizioni di anti-coniglio capra coniugato di fosfatasi alcalina IgG (Tabella materiali) per 90 min a 37 ° C.
    7. Lavare le piastre tre volte con PBST, aggiungere il fosfato di substrato p-nitro fenil e attendere lo sviluppo del colore.
    8. Leggere l'ODs a 630 nm in un lettore multimodale.
    9. Eseguire la triplice copia diluizioni del siero del test dalla popolazione dello studio e tracciare l'ODs per identificare lo specifico T. cruzi anticorpali.

6. Le valutazioni di tolleranza immune

Nota: Un sistema di modello di pollo è stato utilizzato per testare il T. cruzi infezioni dopo la prima settimana dello sviluppo embrionale.

  1. Inoculare le uova fertili di pollo con 100/10 µ l T. cruzi tripomastigoti raccolte dal terreno di coltura del tessuto; Inoculare il finto controllo uova con 10 T. cruzi tripomastigoti per µ l di terreno di coltura. Sigillare il foro con del nastro adesivo.
  2. Incubare uova di 20 T. cruzi -infettato e un numero uguale di uova fertili di controllo finto a 37 ° C e 65% di umidità per 21 giorni.
  3. Tenere che si schiudono i pulcini nell'incubatrice per 24 h e, successivamente, a 32 ° C in cappe con controllo della temperatura per tre settimane.
  4. Crescere i pulcini nati da uova di T. cruzi -inoculato e da uova di finto controllo alla fase adulta in una camera di pressione aria positiva a 24 ° C, in gabbie individuali collocate nei corridoi separati.
  5. Sfida tutti i pulcini adulti tre volte in sei mesi di età con 107 formalina-ucciso tripomastigoti iniettati per via sottocutanea, settimanale, secondo lo schema nel video.
  6. Prelevare il sangue da una vena di ala di pollo covato dalle uova T. cruzi -inoculato e dai controlli finti quattro settimane dopo l'ultima immunizzazione per ottenere il siero.
  7. Utilizzare il siero di pollo per rilevare lo specifico anticorpo di T. cruzi di IIF ed ELISA come descritto al punto 5 del protocollo.

7. infezione dei topi con T. cruzi da sperma di Chagas patients' eiacula

  1. Utilizzare l'eiacula sperma da un paziente di malattia di Chagas PCR + adulto (passo 1.5) e da un individuo adulto PCR - Chagas-free.
  2. Utilizzare due gruppi di 12 topi BALB/c ingenua di un mese-vecchio tenuto in cappe sotto pressione d'aria positiva a 24 ° C e nutriti cibo ad libitum.
  3. Le aliquote di sperma umane Chagas-positivi (100 µ l) infondere il peritoneo e quantità uguali nella vagina di gruppo-A topi.
  4. Instillare le aliquote di sperma (100 µ l) di controllo privo di Chagas in peritoneo e una pari quantità nella vagina dei topi del gruppo-B.
  5. Sacrificare i topi sperimentali nell'ambito dell'anestesia cinque settimane dopo le instillazioni di sperma e le sezioni di tessuto in base alla colorazione con ematossilina-eosina.
  6. Microscopia di uso per la ricerca di T. cruzi tripomastigoti e amastigoti nel cuore, muscolo scheletrico e gli organi riproduttivi nei gruppi di topi.

8. trasmissione del il T. cruzi infezione da richieste

  1. Utilizzare 10 topi BALB/c sei-settimana-vecchio maschii e femminili negli esperimenti.
  2. Inoculare 5 di sesso maschile e femminili cinque topi intraperitonealmente con 1 x 105 T. cruzi tripomastigoti dalla coltura del tessuto.
  3. Allevare i topi fino a tre mesi di età: gruppo sarà formata da cinque T. cruzi-topi femminili infetti e cinque controllare maschio si accoppia non infette; gruppo II sarà formato da cinque T. cruzi -infettati maschio e cinque controllare compagni femminili non infette. Gruppo III sarà formato da cinque maschi e compagni di controllo femminile cinque ingenuo non infetto.
  4. Casa ogni allevamento coppia in una gabbia posizionata all'interno di una cassetta di sicurezza con una porta di griglia e lock-in 5 mm per impedire la fuga.
  5. Nutrire i topi chow e acqua ad libitum. Raccogliere un totale di 70 svezzamento progenie in gruppi II e io per almeno sei settimane.
  6. Prelievo di sangue dalla puntura di cuore dal parentale (FO) e topi di progenie (F1) nell'ambito dell'anestesia, sacrificare i topi e presentare sezioni del cuore, muscolo scheletrico e gli organi riproduttivi per l'analisi patologica.

9. valutazione di privilegio immune

  1. Ottenere tessuti da T. cruzi-infettati e ingenuo controllare topi (passo 8,6) e tagliare i campioni paraffina-incastonati in 4 sezioni di spessore µm.
  2. Rimuovere la paraffina e disidratare le sezioni su vetrini con diversi cambiamenti di xilene e graduate lavaggi con etanolo 100% al 70%, per 1 min ciascuna.
  3. Incubare le sezioni di tessuto con saponina 0.05% una volta, seguita da tre lavaggi di acqua distillata a temperatura ambiente.
  4. Bloccare le sezioni di tessuto con 5% senza grassi del latte in polvere per 45 min. lavare i vetrini in 0.1 M PBST e incubare le sezioni con il Chagas mouse anti-T. cruzi nel siero o con il siero di controllo non infetto del mouse a un 01:20 diluizione per 2 h.
  5. Lavare i vetrini tre volte per 5 min in PBST e asciutto a temperatura ambiente prima dell'incubazione con una diluizione di 1:1,000 di IgG di anti-topo coniglio coniugato di fosfatasi alcalina.
  6. Sciacquare i vetrini in PBST e aggiungere 100 µ l di 3,3' diaminobenzidina per un'incubazione di 5 min, seguita da tre lavaggi in PBST e colorazione con ematossilina di Harris per 30 s.
  7. Lavare i vetrini in acqua distillata per 5 min, li disidratano in 70%, 80%, 90% ed etanolo al 100% per 1 min e montarli in Glicerina tamponata.
  8. Esaminare i vetrini con un microscopio a campo chiaro e catturare immagini fotografiche con una microcamera con software e un programma analizzatore.
  9. Documentare il privilegio immune del parassita in assenza di reazioni infiammatorie negli organi riproduttivi.

10. statistiche analisi

  1. Utilizzare Edit biomedica per l'analisi di sequenza, eseguire allineamenti con BLAST e determinare la significatività statistica E-value (p < 0,05).
  2. Eseguire un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test di Tukey per confrontare il OD significa più o meno deviazioni standard.

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Representative Results

La ricerca, condotta secondo il protocollo, mirato a rilevare casi acuti della malattia di Chagas dagli esami clinici e parassitologici. Campioni di sangue venosi sono stati sottoposti a esame microscopico diretto e coltura in vitro per la crescita del parassita. Ventuno casi acuti della malattia di Chagas ha mostrato T. cruzi nel sangue. Il protocollo di ricerca protetto l'isolamento di T. cruzi ECI1-ECI21 da acuta malattia di Chagas, e il DNA campioni esposti orme di DNA positivi nel resto della popolazione dello studio: analisi nDNA-PCR hanno reso la sequenza di ripetizione tipica del telomero con le bande di 188-nt presenti così come il T. cruzi Berenice archetipo1. I casi di Chagas e ai loro familiari che si offrì di partecipare allo studio sono stati raggruppati in quattro famiglie1.

In questo studio della famiglia, il T. cruzi nDNA era PCR amplificato con primer imposta1,23 ricotto alla sequenza telomerica specifico da ciascuno dei 21 casi di malattia di Chagas acuti. Queste T. cruzi nDNA ampliconi ibridato con la sonda specifica sequenza radiomarcato (Figura 2); la clonazione e il sequenziamento ha rivelato che gli ampliconi comprendeva il motivo di ripetizione del telomero 188-nt T. cruzi . La specificità di queste procedure di ibridazione è stata indicata nel controllo negativo eseguito con L. braziliensis promastigotes. L'analisi di patologia convalidato che il hemoflagellates nei pazienti di malattia di Chagas acuti erano veramente virulento T. cruzi. Concludiamo che la band di T. cruzi nDNA (188-bp) trovato nel 21 acuta Chagas casi (Figura 2) è una dimostrazione diretta di infezioni persistenti.

Trasmissione sessuale di Trypanosoma cruzi in esseri umani

Per valutare i rapporti delle infezioni T. cruzi , abbiamo applicato il test di acido nucleico per rilevamento ad alta sensibilità delle impronte parassita nella popolazione di studio della famiglia1. In queste analisi di PCR, i prodotti di amplificazione che ibridato con la sonda specifica radiomarcata 188-nt formano nDNA bande a 76,1% (83/109) dei campioni; i risultati dell'ibridazione del sud dei prodotti di amplificazione di nDNA-PCR con la sonda radioattiva 188-nt specifico sono mostrati nella Figura 3. Inoltre, le ibridazioni ha mostrato il DNA del parassita nella linea delle cellule di germe dei membri della famiglia volontari (Figura 4).

IIF è stato impiegato al fenotipo del ECI1 a ECI21 T. cruzi tripomastigoti al siero umano IgG da un campione di banca Chagas malattia del siero con parassitologica dimostrazione del protozoan nel sangue, e della fluorescina coniugato anti-human che IgG è stato utilizzato . T. cruzi Berenice era un controllo positivo per l'anticorpo di Chagas, e il controllo negativo è stato il promastigote della relativa famiglia relativa L. braziliensis. La figura 5 Mostra che la sagoma verde mela positiva dell'archetipo Berenice correla con il selvaggio-tipo busta T. cruzi mostrato nel video.

L'ELISA e IIF ha rivelato lo specifico T. cruzi anticorpi1,28 a 28,4% (31/109) dei campioni. I risultati di ELISA e IIF, come pure quelli dell'amplicone PCR nDNA e ibridazioni del sud , vengono rappresentati in Figura 6. Le discrepanze fra i risultati delle orme di nDNA-PCR e quelli dall'anticorpo specifico saggi sono raffigurati in heredograms (Figura 7), A famiglia, quattro soggetti avevano positivo nDNA e l'anti - anticorpo diT. cruzi e 11 aveva solo il nDNA positivo; cinque i maschi hanno avuti T. cruzi nell'eiaculato sperma. In famiglia B con 44 persone, 11 aveva lo specifico anticorpo di T. cruzi e 23 aveva sia l'anticorpo specifico e il nDNA parassita; sette individui avevano T. cruzi nell'eiaculato sperma. Famiglia C con 29 membri aveva l'anticorpo e il T. cruzi nDNA in cinque individui, e 17 hanno avuti il nDNA parassita da solo; quattro maschi avevano il nDNA-PCR positivo nell'eiaculato sperma. Nella famiglia D, tra 21 soggetti, 11 hanno avuti anticorpo specifici anti -T. cruzi e l'impronta di nDNA e nove hanno avuti nDNA-PCR positiva da solo. Figura 3, Figura 6 e Figura 7 raffigurano le ampie discrepanze fra i risultati, costantemente, in campioni biologici ottenuti da soggetti famiglie in tre esperimenti indipendenti, Esegui un anno apart.

La tabella 1 Mostra le differenze quantitative fra il IIF, ELISA e l'analisi di nDNA-PCR nei campioni dalle famiglie studio umano A-a-D. Le discrepanze tra i rapporti di analisi dell'anticorpo (28,4%) e quelli di saggi positivi dell'acido nucleico (76,1%) sono statisticamente significativo (p < 0,005). In queste famiglie, le differenze tra gruppi di T. cruzi -infettato persone (III e IV) contabilizzate 62,6% (52/83) della popolazione, mostrando una prova positiva dell'acido nucleico da solo. Le ampie discrepanze tra i rapporti delle orme nDNA positivi e quelli della specifica T. cruzi anticorpo sono stati spiegati dagli esperimenti condotti nel sistema modello pollo.

Tolleranza immune

La valutazione delle risposte immunitarie condotta in gruppi di polli allevati alla fase adulta in gabbie individuali nei corridoi separati contenenti ingenuo polli di controllo (A); controllo finto polli nati da uova inoculate con terreno di coltura (B); e polli tratteggiata dal T. cruzi tripomastigoti-inoculato uova (C)26. L'adulto polli nei gruppi B e C sono stati sfidati tre volte con la formalina-ucciso T. cruzi trypomastigote antigene, settimanale, come mostrato nel video. ELISA e i saggi IIF sono stati eseguiti con il siero raccolto dal gruppo A, B e C polli un mese dopo la sfida. Figura 8 Mostra l'assenza dell'anticorpo specifico nel gruppo A e C polli, che contrastava nettamente con la produzione di anticorpi specifici nel gruppo B immunizzati con l'antigene di T. cruzi . I risultati hanno mostrato chiaramente il sistema immunitario tolleranza nel gruppo C ha covato da T. cruzi-inoculato uova.

Trasmissione sessuale di Provare panosoma cruzi in un sistema modello di Mouse

Inoltre, l'infettività di T. cruzi dal liquido seminale di un paziente di Chagas, che è risultato positivo nella PCR e mancava l'anticorpo specifico, è stata dimostrata attraverso instillazioni di 100 µ l di sperma nella cavità peritoneale di topo maschio e attraverso un pari quantità di sperma instillato nella vagina. Cinque settimane più tardi, i nidi di amastigote di T. cruzi sono stati rilevati nel cuore e nei muscoli scheletrici e ciuffi di differenziare i parassiti erano presenti nel lume del vaso deferente e tuba uterina. Interessante, le reazioni infiammatorie distruttive non ha fatto circondano i nidi e ciuffi di amastigotes di T. cruzi (Figura 9).

La valutazione della trasmissione sessuale di T. cruzi infezioni più ulteriormente è stata condotta in due gruppi di topi inoculati intraperitonealmente con 1 x 105 T. cruzi Berenice tripomastigoti forme1,30, 31. Nel gruppo sperimentale, I, 10 T. cruzi -infettati maschi si accoppiò con 10 topi femmina di controllo ingenuo. Nel gruppo sperimentale II, 10 T. cruzi -infettati femmine accoppiate con 10 maschi di controllo ingenuo. La figura 10 Mostra che il T. cruzi-infettati di topo maschio (A-a-E) e il T. cruzi -femminili topi infettati (F-g) ha reso 188-bp nDNA bande (numeri dispari). Dopo la riproduzione, gli accoppiamenti di ingenuo (numeri pari) acquisito prontamente T. cruzi seguendo un unico rapporto sessuale con un compagno di chagasic. Simili ripetere esperimenti eseguiti in condizioni identiche ha confermato che ogni mouse femminile o maschile di ingenuo che sessualmente accoppiato con un T. cruzi-infetto maschio o femmina ha acquistato l'infezione flagellata. Questi fondatori nDNA-positivi (F0) generato progenie che hanno alzato fino all'età di sei settimane. Allora, il test e il controllo non infetti topi erano bled via puntura cuore di raccogliere circa 0,5 mL di sangue. Le analisi di nDNA-PCR hanno mostrato che le infezioni dei fondatori (F0) sessualmente acquisiti sono stati trasmessi alla progenie F1, come testimoniano le bande nDNA 188-bp (Figura 11). La progenie di F1 erano nDNA-positivi in 41 dei 70 (58,6%) campioni esaminati. Di questi topi con bande nDNA indicativi di infezioni verticalmente acquistate, come pochi, come 9 di 41 (22%) hanno avuti anticorpi di T. cruzi .

I topi di progenie F1 sono stati sacrificati nell'ambito dell'anestesia, e i tessuti del corpo sono stati sottoposti ad analisi patologiche e immuni perossidasi-macchiatura. I risultati di questi esperimenti sono mostrati in Figura 12. I risultati per il T. cruzi amastigoti sono stati documentati nelle cellule interstiziali dell'epididimo e in goniablasts; amastigoti differenziarsi in tripomastigoti erano presenti nel lume del tubulo seminifero in assenza di reazioni infiammatorie.

Figure 1
Figura 1 . Trypanosoma cruzi infezione nel tubulo seminifero di un ragazzo che è morto della malattia di Chagas acuta . Microfoto da file di dottore Teixeira, 197018. Le forme di T. cruzi sono in goniablasts e ciuffi di amastigoti e gratuito tripomastigoti (frecce) sono presenti nel lume del tubulo seminifero in assenza di infiltrati infiammatori1. Macchie di ematossilina-eosina. Bar, 20 µm. ristampato con il permesso dell'editore e gli autori1,19.

Figure 2
Figura 2 . L'impronta di Trypanosoma cruzi da acuta malattia di Chagas. I prodotti di amplificazione di T. cruzi nDNA-PCR formano 188-nt bande con una sonda specifica radiomarcata 188-nt. TC, T. cruzi; NC, controllo negativo. Ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Southern blotting analisi di Trypanosoma cruzi infezioni in soggetti dello studio umano famiglie. Famiglia A - tutti i 15 soggetti ha mostrato nDNA-PCR specifiche fasce di 188-nt. In famiglia B, un totale di 35 di 43 soggetti (81,4%) ha formato le bande specifiche nDNA. In famiglia C, tra 29 membri, 22 (75,8%) formata le bande nDNA. In famiglia D, 11 di 21 soggetti (52,4%) hanno avuti le bande nDNA. Il T. cruzi-nDNA specifiche bande sono stati confermati dalla clonazione e sequenziamento. Ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . L'attivo Trypanosoma cruzi infezioni nello sperma eiaculato da volontari di famiglia Studio. Le infezioni in eiacula Chagas pazienti identificati dalle bande di 188-bp nDNA-PCR. TC, T. cruzi controllo positivo. Controllo negativo: NC, L. braziliensis . Ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Il fenotipo della Trypanosoma cruzi con l'anticorpo del siero dei pazienti di malattia di Chagas. T. cruzi identificate con l'anticorpo di IgG del siero di Chagas che riconosce il parassita trypomastigote trattati con una marcato FITC monoclonale Ab anti-IgG umane. L'anti-T. cruzi Ab non riconosce promastigotes braziliensis di Leishmania . Gli inserti Visualizza controlli negativi. Bar, 20 µm. ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 6
Figura 6 . Rappresentazione grafica del ELISAs e analisi nDNA-PCR della famiglia popolazione dello studio. Gruppo I (n = 10) e gruppo II (n = 20) sono stati il controllo negativo e i sieri di controllo positivo, rispettivamente, dalle infezioni di T. cruzi con dimostrazione parassitologica. Gruppo III (n = 31) inclusi campioni provenienti da soggetti familiari con le bande di 188-bp nDNA e anticorpi specifici di T. cruzi. Gruppo IV (n = 52) comprendeva campione da soggetti con T. cruzi infezioni rilevate dagli ampliconi di 188-nt nDNA-PCR in assenza di anticorpo specifico. Gruppo V (n = 26) erano campioni di prova negativa che comprende le persone senza infezione lo studio della famiglia. Ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 . La heredograms e il mapping della Trypanosoma cruzi- infetto popolazione famiglia. La figura mostra le discrepanze tra i rapporti di anti - anticorpo diT. cruzi e quelli dei saggi nDNA-PCR. Piazza aperta e cerchio, negativo maschio e femmina. Quadrati rossi e cerchi, positivo anti - anticorpo diT. cruzi e nDNA-PCR. Quadrati neri ed i cerchi, nDNA-PCR positiva da solo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figure 8
Figura 8 . La tolleranza immunitaria nei polli nati da Trypanosoma cruzi- inoculato uova. A) profilo di anticorpo preimmune nei polli finto controllo (n = 10). Polli di B) la risposta anticorpale specifica nel controllo ingenuo sfidati con l'antigene di T. cruzi (n = 20). C) l'assenza di una risposta immunitaria specifica nei polli nati da T. cruzi-inoculato uova dopo la sfida con l'antigene di T. cruzi (n = 20). La differenza di densità ottica tra A e C (024 ± 0,17) verso B (0.85 ± 0,6) è statisticamente significativo (p < 0,05). Questa figura è stata modificata dal riferimento26 e viene ristampata con il permesso dell'editore e l'autore.

Figure 9
Figura 9 . L'infettiva Trypanosoma cruzi eiacula umana si traduce in un'infezione murina attiva. Le aliquote di Chagas eiacula paziente erano instillate nella cavità peritoneale o nella vagina di topi. I topi sono stati sacrificati tre settimane dopo l'instillazione. Corsia superiore, T. cruzi amastigoti nidi nel cuore (a sinistra) e nel muscolo scheletrico (a destra). Lane di fondo, T. cruzi amastigote nidi in vaso deferente (a sinistra) e la tuba uterina (a destra). L'inserto mostra una demarcazione amastigote (cerchio). Si noti l'assenza di infiltrati infiammatori nelle sezioni del tessuto. Macchie di ematossilina-eosina. Bar: alto e in basso a sinistra, 20 µm; basso a destra, 10 µm. ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10 . La trasmissione sessuale di Trypanosoma cruzi infezioni nel topo modello sistema di rapporto sessuale. La trasmissione delle infezioni T. cruzi da chagasic ai compagni di ingenuo dimostrati dalle bande specifiche nDNA 188-bp ha rivelate nelle ibridazioni del sud . Profili di Prebreeding corsia superiore) dei prodotti di amplificazione di PCR dei topi T. cruzi -infettata e dei topi ingenuo. I numeri dispari indicano il T. cruzi-infettati A maschio-a-E e mouse femminile F-a-I campioni. I numeri pari sono ingenua donna (da 2 a 10) e uomo (da 12 a 20) topi. Lane di fondo, dopo la riproduzione, lo spettacolo di profili che anche topi 2-a-20 acquistati T. cruzi infezioni. Ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1,30. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11 . Il Trypanosoma cruzi infezione verticalmente viene trasferito dalla F0 chagasic parentale per i topi di progenie F1. Il padre di chagasic trasmesso le infezioni di T. cruzi da un incontro singolo allevamento. Il T. cruzi-femmine infetti erano accoppiate ai maschi ingenuo A-E, e le femmine di ingenuo erano accoppiate ai maschi T. cruzi -infettati F-J. Dopo la riproduzione, tutti i fondatori (F0) ha mostrato la band di 188-bp protozoi nDNA-PCR positiva. Macchiarsi del sud ha rivelato il Fascia nDNA specifici dopo l'ibridazione con la sonda radioattiva 188-nt in una maggioranza delle cucciolate F1. NC, L. braziliensis controllo negativo; TC, T. cruzi controllo positivo. Ristampato con il permesso dell'editore e l'autore1,31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12 . L'istopatologia documentato Trypanosoma cruzi sessualmente trasmissibili da F0 F1 progenie e immunitario tolleranza in assenza di una reazione infiammatoria. Le sezioni mostrano crescita delle forme di T. cruzi nell'epididimo, goniablasts e tubuli seminiferi dei topi F1. I topi sono stati sacrificati nell'ambito dell'anestesia, e le sezioni di perossidasi-macchiato immuni sono state esaminate sotto un microscopio. Le microfotografie mostrano brunastro immuni perossidasi-macchiato T. cruzi amastigoti dell'intercapedine dell'epididimo (A) e ciuffi di amastigoti differenziarsi in tripomastigoti capannone nel lume della seminifero tubulo (B, C e F). Il nido di amastigote visto in un goniablast (D). (E) istologia normale del mouse controllo positivo del tubulo seminifero.. Si noti l'assenza di infiltrati infiammatori nei testicoli dei topi F1 risultati carichi dei parassiti Chagas. Di Giemsa. Bar: A, B, C ed E, 20 µm; D e F, 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Le discrepanze tra i rapporti di esami IIF ed ELISA positivi e quelli di analisi nDNA-PCR nei campioni raccolti dalle famiglie studio umano A-a-D *

Gruppi * * ELISA: siero anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA-PCR (%)
Controllo Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - controllo Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-free Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Risultati di tre indipendente ELISA e analisi nDNA-PCR eseguito nei campioni raccolti in tre diverse occasioni a anni 1, 2 e 3. [1]. l'amplificazione del 188-nt T. cruzi DNA ripetere confermata dalla clonazione e sequenziamento.
* * Le differenze tra negativo (gruppi I e V) e i soggetti positivi (gruppi III e IV) sono statisticamente significativo (p < 0,05).
ᵟ le discrepanze tra i gruppi III e IV ha spiegato dalla tolleranza immunitaria in assenza dell'anticorpo T. cruzi raggiunto a 62,6% (52/83) dei soggetti positivi di PCR.

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Discussion

Qui, discutiamo un protocollo di ricerca basate sulla famiglia che ha risposto alla domanda di se la malattia di Chagas umana deriva dalla sessualmente trasmissibili intraspecie T. cruzi infezioni. Primi studi non potevano fornire la prova della trasmissione sessuale di T. cruzi infezioni, probabilmente perché i dati disponibili e le informazioni sulla malattia di Chagas sono stati ottenuti separatamente dai singoli3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Il ritrovamento di T. cruzi nel tubulo seminifero di un ragazzo (Figura 1) è stata la scintilla che stimolato indagini cliniche ed epidemiologiche. Dopo diversi decenni, in teoria quando famiglia studiare approcci e le tecnologie descritte in questo protocollo di ricerca erano disponibili, fasi del ciclo di vita di T. cruzi è apparso nel liquido seminale umano1,19.

La dimostrazione parassitologica diretta del protozoan in 21 casi di malattia di Chagas acuti era cruciale per convalidare i prodotti di amplificazione nDNA-PCR, che formavano bande specifiche in campioni provenienti da tutti i soggetti acutamente infettati con T. cruzi. Questo indicatore di point-of-care laboratorio valutato i risultati dei saggi immunologici e dell'acido nucleico. Il lungo periodo Chagas malattia famiglia studio fondamentale, pertanto, unisce i risultati in esseri umani con quelli ottenuti in gruppi di animali da laboratorio. La ricerca condotta secondo il protocollo ha rivelato per la prima volta che T. cruzi infezioni sono a trasmissione sessuale in esseri umani1.

L'ampia differenza fra i rapporti dall'analisi di parassita-specific dell'anticorpo e quelli dai test di acido nucleico indica che la maggior parte delle impronte nDNA è derivato da casi sessualmente trasmissibili in assenza di specifici anti T. cruzi anticorpi. Così, la trasmissione sessuale di T. cruzi nei membri di famiglia esibendo nDNA positivo in assenza di anticorpo specifico IgG era a causa della tolleranza immunitaria.

Tolleranza immunologica è stata dimostrata in un sistema di modello di pollo refrattario alla T. cruzi infezioni dopo la prima settimana di embrione crescita1,25,26,32,33, 34. Da allora in poi, del sistema immunitario immaturo incapacità di riconoscere il parassita come una componente estera del corpo indicato tolleranza di sistema immunitario maturo fine del pollo verso cruzi di T. In considerazione di questi risultati, la tolleranza è un fenomeno naturale1 derivanti dall'auto-riconoscimento del sistema immunitario e la manutenzione dei suoi stessi componenti corpo sotto condizioni fisiologiche25,26, 32 , 33 , 34. il passaggio dallo stato di tolleranza immune alla malattia di cuore di Chagas autoimmune pertanto può essere associato con modifiche delle cellule effettrici derivando dalle mutazioni di cinetoplasto (kDNA) di T. cruzi dell'host genoma1 ,2,14,23,25,26.

I passaggi critici nel protocollo di ricerca descrivono la modifica principale tecnica e risoluzione dei problemi al fine di divulgare le sessualmente trasmissibili Chagas parassiti1,14,23,25, 26: io) selezione studio famiglie con casi di35,acuta malattia di Chagas36; ii) isolamento di selvaggio-tipo T. cruzi dal sangue dei casi acuti; iii) ottenere campioni di DNA da flagellati di sangue i partecipanti delle famiglie, dall'archetipo Berenice T. cruzi , dai campioni del DNA positivo banca di compararli e dal negativo controllano L. braziliensis; iv) prestazioni ordinate procedure tecniche per dimostrare che il footprint di nDNA flagellati dei partecipanti è identica a quella dell'archetipo Berenice T. cruzi e quelli positivi banca campioni di DNA; footprinting nDNA triplicate in esecuzione indipendente v) per dimostrare le infezioni di T. cruzi nei membri di famiglia in tre occasioni un anno parte; vi) assicurare che la tecnica di nDNA-PCR condotta al punto di cura produce risultati confermate dalla clonazione e sequenziamento tutti gli ampliconi Ricotti al primer specifico imposta, costantemente mostrando quindi la sequenza di T. cruzi 188-nt 1,25,28,29,30; vii) utilizzando reagenti di marchio di qualità per riprodurre i titoli dell'anticorpo ancora in campioni di siero raccolti in tre diversi momenti; viii) il protocollo di studio della famiglia ha rivelato l'infezione diretta esistente nelle cellule germinali linea dopo la dimostrazione del nDNA T. cruzi in assenza di anticorpi specifici in sperma eiacula raccolti da Chagas infettato dal parassita gli individui1; ix) la prospettiva è che il protocollo di ricerca progettato per svelare il sessualmente trasmesse infezioni da T. cruzi deve indicare la malattia di Chagas autoctona nei cinque continenti; x) il nDNA e le orme di kDNA assicurare la diagnosi della malattia di Chagas cronica asintomatica in esseri umani1,2; xi) in assenza del nDNA, la mutazionedi T. cruzi kDNA sequenza1,2,23,25,26 da solo è un marker di laboratorio per realizzare la diagnosi differenziale da cardiomiopatie dilatativa idiopatica23,25,37,38,39.

Inoltre, il virulento T. cruzi documentati nella paziente eiacula Chagas sono stati in grado di inizializzare infezioni diffuse su instillazione nella vagina del mouse e nella sua cavità peritoneale. Lo studio di patologia ha mostrato i nidi di amastigote di T. cruzi nel cuore e nei muscoli scheletrici pure come il dotto deferente e tuba uterina. Interessante, i nidi di parassita non hanno provocato reazioni infiammatorie che ostacolerebbero vitali funzioni riproduttive. L'assenza di reazioni infiammatorie rende il privilegio immune in vitali del corpo funzionali strutture40,41,42,43,44,45 e pertanto spiega la crescita spregiudicata di T. cruzi negli organi riproduttivi.

Inoltre, gli studi sperimentali in topi chagasic che allevato con i compagni di ingenuo spiegato ulteriormente la trasmissione sessuale di T. cruzi infezioni in esseri umani. Le femmine infette e maschi trasmesso le infezioni di T. cruzi ai compagni di ingenuo non infetti durante il rapporto sessuale, e la maggior parte delle loro cucciolate acquisito il T. cruzi verticalmente trasferito dal padre alla progenie. In questi esperimenti, la fase iniziale di cui alla crescita di T. cruzi nel tubo e nell'utero, così come nel tubulo seminifero e deferenti, dove si svolse il privilegio immune. Quindi, la trasmissione sessuale si è verificato attraverso le fasi parassitarie nello sperma o nelle secrezioni dell'utero in vagina. Privilegio immune40,41,42,43,44,45 è un fenomeno che permette alcuni organi (sistema riproduttivo, occhi e cervello) a downregulate le reazioni infiammatorie ed evitare danni a funzioni importanti, sensibili e specifici40. Gli ormoni41 e diversi fattori immunitari downregulate macrofagi41,42,43, cellule natural killer41, T-linfociti e cellule T-regolatorie (Treg), orchestrando così la inibizione di una serie di citochine pro-infiammatorie e immunitarie-privilegio trigger40,41,42,43,44,45.

La trasmissione sessuale di T. cruzi infezioni da maschi e femmine a ingenuo partner indica che il controllo della malattia di Chagas richiede solidarietà internazionale. I risultati discussi qui indicano che sono necessarie ricerche più creativi. I seguenti obiettivi immediati sono realizzabili: io) a sviluppare piattaforme ad alta produttività per specifiche e test altamente sensibile dell'acido nucleico per raggiungere una diagnosi accurata, con l'obiettivo per la prevenzione delle infezioni trasmesse attraverso i rapporti sessuali, le trasfusioni di sangue e trapianti d'organo, nonché facilitare le indagini cliniche ed epidemiologiche per determinare la diagnosi e la prevalenza della malattia di Chagas; ii) a promuovere un programma di sviluppo della droga multicentrata per ottenere nuovi farmaci per l'eradicazione delle infezioni di T. cruzi ; e iii) a implementare una formazione idonea, il programma di informazione e comunicazione che prevede la partecipazione di scuole, chiese, organizzazioni sociali e le istituzioni sanitarie per prevenire la diffusione della malattia di Chagas.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Riconosciamo le strutture di laboratorio e i commenti critici di Izabela Dourado, Carla Araujo e Gomes intelligente e l'assistenza tecnica di Bruno Dalago e Rafael Andrade. Siamo grati alla Fondazione per l'avanzamento di scienza (FAPDF), il Consiglio nazionale delle ricerche, Ministero della scienza e tecnologia (CNPq/MCT) e l'Agenzia per la formazione delle risorse umane, Ministero della pubblica istruzione (CAPES / ME), Brasile, per il supporto di questi indagini.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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References

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Immunologia e infezione numero 143 eiacula sperma studio, Trypanosoma cruzi famiglia secrezione uterina sistema di modello del mouse trasmissione verticale privilegio immune sistema di modello di pollo tolleranza immunitaria malattia di Chagas.
Trasmissione sessuale dell'americano Trypanosomes da maschi e femmine ai compagni di Naive
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Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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