Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Sexuell överföring av amerikanska innebörder från hanar och honor till Naive kompisar

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

Trypanosoma cruzi agenten av Chagas sjukdom ger långvarig asymtomatiska infektioner som plötsligt utvecklas till kliniskt erkända patologi. Följande forskning protokollet beskriver en kort sikt familjebaserade epidemiologiska studie för att nysta upp T. cruzi infektionen överförs sexuellt från förälder till avkomma.

Abstract

Amerikansk trypanosomiasis överförs till människor av triatomine buggar genom intag av förorenade livsmedel, genom blodtransfusioner eller misstag i sjukhus och forskningslaboratorier. Dessutom Trypanosoma cruzi infektionen överförs medfödd från en chagasic mor till hennes avkomma, men den manliga partnerns bidrag till i livmodern kontaminering är okänd. Resultaten av Bon och klumpar av amastigotes och trypomastigotes i theca celler i äggstockarna, i goniablasts och i lumen av sädeskanalerna föreslår att T. cruzi infektioner överförs sexuellt. Det presenteras resultaten av en familj studiepopulationen visar parasit nuclear DNA i de diploida mononukleära cellerna och i den haploida könsceller försökspersoner i forskning-protokollet häri. Tre oberoende biologiska prover samlas in ett år isär bekräftade således att T. cruzi infektioner var sexuellt överförbara till avkomma. Intressant, specifikt T. cruzi antikropp var frånvarande i flesta av familjens avkommor som bar immuntolerans till antigenen som parasit. Immuntolerans visades i kyckling refraktära mot T. cruzi efter den första veckan av embryonal tillväxt och kycklingar som kläckts från ägg FLAGELLAT-inokuleras kunnat inte producera den specifika antikroppen. Dessutom instillationen av mänsklig sperma får utlösning intraperitonealt eller i naiva möss gav T. cruzi amastigotes i bitestiklarna, seminifera tubuli, sädesledaren och livmoder röret med en avsaknad av inflammatorisk vagina reaktioner i immun privilegierade organen i reproduktion. Uppfödning av T. cruzi-infekterade manliga och kvinnliga möss med naiva kompisar resulterade i förvärvet av de infektioner som överfördes senare till avkomman. Därför anses ett robust utbildning, information och kommunikation program som handlar om befolkning och sociala organisationer nödvändigt att förebygga Chagas sjukdom.

Introduction

Den protozo parasiten Trypanosoma cruzi tillhörande familjen Trypanosomatidae genomgår trypomastigote och amastigote livscykelstadier i däggdjur värdar och finns som epimastigotes i insekt-vektorn (Reduviid: Triatominae) gut och i axenic kultur. Under de senaste decennierna har flera studier visat förekomsten av Chagas sjukdom i länder på fyra kontinenter ansåg triatomine bugg fri1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. spridningen av amerikanska innebörder tillskrevs initialt latinamerikanska invandrare till norra halvklotet, men möjligheten att vissa är autoktont fall av Chagas sjukdom kan inte längre förnekas3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. T. cruzi överföring endast igenkännliga endogena källan har tillskrivits chagasic moderns överföring av parasiten till avkomman hos cirka 10% av graviditeter15; den manliga partnerns bidrag till i livmodern infektioner genom sperma får utlösning har förblivit okänd.

Över ett århundrade sedan, utredare16,17 observerade intracellulära T. cruzi amastigotes i theca celler i äggstockarna och i grodden linje cellerna i testiklarna av akuta fall av Chagas sjukdom. Det Bon och klumpar av T. cruzi trypomastigotes och amastigotes i theca celler i äggstockarna, goniablasts och lumen av sädeskanalerna (figur 1) dödlig akut Chagas sjukdom fall utveckla immun privilegium i organen av reproduktion i avsaknad av inflammatorisk infiltrerar18,19. Under de senaste decennierna har några experimentella studier visat Bon av runda amastigote former av T. cruzi i seminifera tubuli, bitestiklar och sädesledaren såväl som i livmodern, rör och äggstock theca celler av acutely infekterade möss 1,20,21,22. Dessutom under familj studier att dokumentera överföring av protozo mitokondrie-DNA från föräldrarnas Chagas patienter att deras ättlingar, T. cruzi nuclear DNA (nDNA) kontrollerades i mänskliga haploida könsceller linje celler23, och parasiten livscykelstadier observerades i de får utlösning av chagasic möss24. Dessa fynd är ense med rapporter om de immuntolerans uppnås genom avkomman av T. cruzi -smittade värdar i avsaknad av den specifika antikropp1,25,26. Dessutom epidemiologiska rapporter som föreslog spridningen av endemisk Chagas sjukdom till andra kontinenter3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 stöds nu av experimentella studier visar att Chagas sjukdom kan överföras sexuellt1 . Den nuvarande undersökningen presenterar en epidemiologisk familj studieprotokoll och visar att T. cruzi infektion sprids genom samlag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Människan och djur forskning utskott fakulteten på universitetet i Brasilia godkände alla förfaranden med försökspersoner och försöksdjur, respektive i forskningsprotokoll 2500.167567 och 10411 2011. Den etiska kommittén av den offentliga Foundation sjukhus Gaspar Vianna (protokoll nr 054/2009 och 2009-CONEP 11163) godkände formulären samtycket för fältstudien, med förlängning till ministeriet för hälsa nationella kommissionen på mänsklig forskning (CONEP 2585/04). Protokollet justerades för att bedöma T. cruzi DNA i diploida mononukleära blodceller och haploida könsceller av sperma får utlösning. Laboratoriedjur fick mänsklig omsorg; möss, utsätts hjärtat punktering innan offer, var under narkos.

1. rekrytering av mänskliga deltagare

  1. Se till att forskarna deltar i ett System Chagas sjukdom hälsoprogram att leverera sjukvård till Chagas patienter.
  2. Rekrytera mänskliga deltagare från familjer inskrivna i programmet, visar åtminstone ett fall med feber, allmän sjukdomskänsla, huvudvärk, takykardi och ödem, de viktigaste kliniska symtomen av akut Chagas sjukdom14.
  3. Leverera hälso-och sjukvård till människor i studien familjer för en period av fem år.
  4. Få 15 mL venöst blod från studiedeltagarna vid tre tillfällen ett år ifrån varandra, dela in provet i tre 5 mL alikvoter och förvara dem i kylskåp vid 4 ° C.
  5. Samla 2 mL av de sperma får utlösning från vuxna frivilliga familjemedlemmar och fortsätt enligt beskrivningen i steg 3.3.

2. tillväxt av parasiter

  1. Använder alikvoten från steg 1.4, blanda blodet med 5 enheter av Pradaxas natriumheparin; göra en lutning kultur genom inympning av blod från familj deltagare med diagnosen akut Chagas sjukdom.
    1. Inokulera 5 mL av den mänskliga antikoagulans till en 50 mL skruvlock tube blodagar slant plus 5 mL av levern infusion-Tryptos medium (LIT) och inkubera provet i en shaker vid 27 ° C i 3 månader.
    2. Placera 100 μl av supernatanten medium ovanpå objektglas, täck med följesedlar och Sök efter blod T. cruzi epimastigotes under mikroskopet, var fjärde vecka.
    3. Skörda de epimastigote isolat i supernatanten axenic LIT medium vid 27 ° C; Tvätta cellerna i PBS pH 7,4, Centrifugera vid 1 000 x g under 10 minuter; Späd epimastigotes i pelleten i 5 mL Dulbeccos modifierade viktigt medium (DMEM).
    4. Inokulera konfluenta L6 muskel cell kultur kolvar med 1 x 106 ECI1-till-ECI21 T. cruzi epimastigote isolerar.
    5. Växer den T. cruzi ECI1-till-ECI21 och den Berenike arketyp trypomastigotes i L6 muskel cellkulturer i 75 mL kultur kolvar.
    6. Flöde celler med 15 mL DMEM vid pH 7,4 kompletteras med 250 nM L-glutamin och 5% CO2 vid 37 ° C1, 100 µg/mL streptomycin, penicillin 100 IE/mL, 5% fetalt bovint serum.
    7. Använd den positiva kontrollen T. cruzi Berenike trypomastigotes till fenotypen ECI1-till-ECI21 isolaten från vävnadsodling, som beskrivs i steg 5.2.
    8. Växer den negativa kontrollen Leishmania braziliensis27 i DMEM kompletteras med 20% fetalt bovint serum endast, och använda den parasit promastigotes som en negativ kontroll.
    9. Använd 1 x 106 T. cruzi ECI1-till-ECI21 trypomastigotes i supernatanten från cellkulturen för att infektera möss.
    10. Sök för T. cruzi trypomastigotes i svansen blodet efter den första veckan av infektionen.
    11. Sök Bon amastigotes i hematoxylin-eosin färgade delar av hjärta, skelettmuskel, och reproduktiva organ hos de infekterade möss, en månad därefter.

3. DNA-extraktion och PCR-analyser

  1. Placera 5 mL blod (steg 1.4) alikvotens i ett sterilt EDTA-rör, och utföra täthet lutning centrifugering för 45 min vid 3000 x g. Använd en pipett att skörda de mononukleära cellerna från fasen vitaktig ovan erytrocyter, tvätta vita cellerna två gånger i 5 mL PBS, pH 7,4, genom centrifugering för 10 min vid 1 500 x g i en olika 15 mL tub, och använda cellerna för de DNA-extraktionen.
  2. Extrahera DNA från ECI-1 till ECI-21 T. cruzi, från den positiva kontrollen Berenike T. cruzi, från den negativa kontrollen L. braziliensis (steg 2.1.8), och från de test mononukleära blodcellerna 109 mänskliga familjens studera ämnen1 , 27 , 28.
  3. Späd 2 mL av de spermier produktproverna i steg 1,5 i DMEM (1:4, v/v); Inkubera i 45 min på 5% CO2 och 37 ° C, återställa spermier från supernatanten efter centrifugering för 5 min vid 13 000 x goch extrahera den haploida DNA23.
  4. Placera 1 mL av cellerna i utvinning buffert (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1% SDS, 0,04% proteinas-K och 1% Ditiotreitol), och blanda lösningarna av inversion och skakar.
    1. Centrifugera lösningar för 10 min till 13 000 x g och 25 ° C, och överföra trögflytande supernatanten till en spin kolumn.
    2. Centrifugera kolumnen spin för 1 min vid 10 000 x g och kassera eluatet; Tillsätt 500 µL bindande buffert till kolumnen spin (Tabell för material), Centrifugera det i 1 min på 12 000 x goch kassera eluatet.
    3. Lägga till 600 µL tvätt buffert i kolumnen spin, Centrifugera det i 1 min på 12 000 x goch kassera eluatet.
    4. Upprepa detta två gånger och överföra den spin kolumnen till ett micro sterila 1,5 mL centrifugrör.
    5. Tillsätt 100 µL av TE buffert, Inkubera röret i rumstemperatur i 2 min och sedan Centrifugera röret för 1 min på 12 000 x g. Bufferten i mikrocentrifug röret innehåller DNA.
    6. Mäta DNA koncentrationer genom att köra portioner på en 0,8% agarosgel och genom att läsa absorbansen vid 260 nm med en spektrofotometer. Lagra de DNA-proverna vid-20 ° C fram till användning i PCR-analysen.
  5. Användning T. cruzi Tcz1/2 primers glödgas till specifika 188-nt särskilda telomeren sekvensen sond29 och köra PCR med DNA från familj studie försökspersonernas blod och sperma, Berenike T. cruzi positiv kontroll och den L. braziliensis negativ kontroll.
    1. Förbered PCR blandningen med 10 ng templat-DNA, 0,4 µM för varje par av primers, 2 U av Taq-DNA-polymeras, 0,2 µM dNTP och 15 µM MgCl2 i en 25 µL slutlig volym.
    2. Inleda programmet DNA förstärkning vid 94 ° C i 30 s för att denaturera mallen, och cool proverna till 55 ° C för 30 s. Sedan, inkubera proverna vid 94 ° C i 90 s att förlänga glödgad primers. Tillbaka temperaturen till 94 ° C i 30 s att inleda nästa cykel och inkubera proverna en ytterligare 3 min vid 72 ° C. I slutet av 32nd cykeln, svalka proverna för 10 min i rumstemperatur, och förvara dem i kylskåp vid 4 ° C29.
    3. Förstärk en T. cruzi DNA telomeren upprepningssekvensen glödgas till Tcz1/2 primers på båda extremiteter.
    4. Analysera de förstärkning produkterna på en 1,3% agarosgel och observera banden 188-nt DNA på en UV-lampa.

4. södra hybridisering

Obs: Södra hybridisering användes för att kasta de flesta av de falskt positiva PCR-amplikoner i agarosgel.

  1. Ämne de PCR-amplifiering produkterna från icke-infekterade kontroller från Chagas fall positiva kontroller, från 109 prover av diploida DNA och haploida DNA från 21 familj studiedeltagarna till södra hybridizations.
  2. Anställa T. cruzi 188-nt DNA-specifika telomeren sekvens sonden glödgas till Tcz1/2 primers visas; etikett sonden med [α -32P] 2'-deoxyadenosin adenosintrifosfat (dATP) använder en slumpmässig primer märkning kit och analysera förstärkning produkter på en 1,3% agarosgel på 60 V över natten vid 4 ° C.
  3. Överföra gelen till ett positivt laddade nylon membran med metoden kapillär över natten.
  4. Hybridisera banden DNA överförs till nylon membran med radiomärkt 188-nt sond, som binder de EcoR1 smälter av genomisk DNA i 25 µL av enzym-specifika bufferten för variabel perioder.
  5. Tvätta membranet två gånger under 15 minuter vid 65 ° C med 2 x SSC och 0,1% SDS.
  6. Exponera X-ray filmer till nylon membran och autoradiograph band på membranet i en vecka.
  7. Växa de kloner som valts från PCR och södra hybridisering med T. cruzi PCR amplifiering produkter, som är hybridiseras med specifika radiomärkt DNA sond.
  8. Kommersiellt sekvens klonerna använder Tcz1/2 primers som glödgad till T. cruzi -specifika telomeren fotavtryck2,23.

5. immunologiska analyser

Anmärkning: Känsligheten och specificiteten av den indirekt immunofluorescens (IIF) och den enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) bedömdes i serum från sex Chagas patienter med påvisbara parasitemia och sex Chagas-fri, deidentified serum Bank prover. Analyserna utfördes med de dubbla serumspädningarna i PBS, pH 7,4, avslöjade att IIF på 1: 100 utspädningar och de ELISA optiska densiteterna (ODs) vid 0,150 och ovanför separerade positivt från de negativa resultaten.

  1. Använd 5 mL av antikoagulans alikvotens (steg 1.4) förvaras i rumstemperatur i 1 h och centrifugera det 1.500 x g för 30 min att separera serum i supernatanten.
  2. Utföra OOM och ELISA i tre exemplar 1: 100 serumspädningar att upptäcka T. cruzi och L. braziliensis antigenerna som tidigare beskrivits28.
  3. OOM
    1. Genomföra IIF analysen i tre exemplar serumspädningar av 109 studie försökspersonernas produktproverna vid tre tillfällen ett år ifrån varandra.
    2. Placera 5 µL suspensioner av formalin 1% - behandlade T. cruzi epimastigotes eller L. braziliensis promastigotes på objektglas; Låt torka över natten parasiter i en huva i rumstemperatur och lagra glas glasen vid-20 ° C fram till användning.
    3. Placera 20 µL av patienternas serumspädningar ovanpå objektglas bestruket med 5 µL av formalin-dödade (10 parasiter/µL) T. cruzi epimastigotes eller L. braziliensis promastigotes.
    4. Inkubera i glasskiva täckt med en slip för 1 h i en fuktig kammare vid 37 ° C och tvätta tre gånger med PBS.
    5. Inkubera i lufttorkad glasskiva med en 1:1,000 utspädning fluorescein-märkt kanin antikroppar (Tabell för material) till humant IgG för 1 h vid 37 ° C; Tvätta och torka i bilden.
    6. Montera bilden med ett täckglas och undersöka det under en UV ljusmikroskop.
      Obs: En positiv tentamen är en äppelgrön T. cruzi epimastigote siluett, visas i videon.
  4. ELISA
    1. Kör en ELISA för att upptäcka den T. cruzi och L. braziliensis lösliga antigener (1 µg/100 µL i 0,1 M karbonat buffert, pH 9,6) på bestruket mikroplattan brunnar.
    2. Inkubera i 1: 100 serumspädningar i tre exemplar belagda brunnar för 2 h i rumstemperatur.
    3. Tvätta plattorna tre gånger med PBST (PBS med 0,5% Tween-20), pH 7,4, lösning före torkning.
    4. Inkubera plattorna med 50 µL av en 1:1,000 utspädning av kanin-anti-humant IgG-antikropp under 90 minuter vid 37 ° C.
    5. Tvätta plattorna tre gånger med PBST lösning och låt dem torka i rumstemperatur.
    6. Inkubera plattorna med 100 µL av 1:1,000 utspädningar av alkaliskt fosfatas-konjugerad get anti-kanin IgG (Tabell för material) under 90 minuter vid 37 ° C.
    7. Tvätta plattorna tre gånger med PBST, lägga till substratet p-nitro fenyl fosfatet och vänta på färgutveckling.
    8. Läs ODs vid 630 nm i en Plattläsare med multimode.
    9. Kör de tre exemplar utspädningarna av serumen från studiepopulationen och rita ODs för att identifiera specifika T. cruzi antikropp titrar.

6. bedömningar av immuntolerans

Obs: Kyckling modellsystem användes för att testa T. cruzi infektioner efter den första veckan av embryots utveckling.

  1. Inokulera bördiga hönsägg med 100/10 µL T. cruzi trypomastigotes skördas från vävnadsodling medium; Inokulera håna kontroll ägg med 10 T. cruzi trypomastigotes per µL odlingsmedium. Täta hålet med tejp.
  2. Inkubera 20 T. cruzi -infekterade ägg och ett lika stort antal håna kontroll fertila ägg vid 37 ° C och 65% luftfuktighet i 21 dagar.
  3. Håll ungarna att kläcka i inkubatorn för 24 h och därefter vid 32 ° C i huvor med temperaturkontroll i tre veckor.
  4. Växa de kycklingar som kläckts från T. cruzi -inokuleras ägg och håna kontroll ägg till vuxen scenen i ett positivt luft trycket rum på 24 ° C, i enskilda burar placeras i separata gångar.
  5. Utmana alla vuxna kycklingar trefalt vid sex månaders ålder med 107 formalin-dödade trypomastigotes injiceras subkutant, varje vecka, enligt schemat i videon.
  6. Dra blod från en wing ven kycklingar som kläckts från ägg T. cruzi -inokuleras och håna kontrollerna fyra veckor efter den senaste immunisering att få serumet.
  7. Använda kyckling serumet för att identifiera specifika T. cruzi antikropp av OOM och ELISA som beskrivs i steg 5 i protokollet.

7. infektion av möss med T. cruzi från Chagas patienternas sperma får utlösning

  1. Använd de sperma får utlösning från en vuxen PCR + Chagas sjukdom patient (steg 1,5) och vuxen PCR - Chagas-fri individ.
  2. Använda två grupper av 12 en månad gamla BALB/c naiva möss hållits i huvor under positiva lufttryck vid 24 ° C och utfodrats mat ad libitum.
  3. Ingjuta de mänskliga Chagas-positiv sperma alikvoter (100 µL) in i peritoneum och lika mängder i slidan grupp-A möss.
  4. Ingjuta de kontroll Chagas-fri sperma alikvoter (100 µL) i bukhinnan och lika mycket i slidan av grupp-B möss.
  5. Offra de experimentella möss under narkos fem veckor efter de sperma instillations och färgning med hematoxylin-eosin som omfattas av avsnitten vävnad.
  6. Använda mikroskopi för att söka för T. cruzi trypomastigotes och amastigotes i hjärta, skelettmuskel och reproduktionsorganen hos grupper av möss.

8. överföring av de T. cruzi infektion av samlag

  1. Använd 10 manliga och kvinnliga sex veckor gamla BALB/c-möss i experimenten.
  2. Inokulera fem manliga och fem honmöss intraperitonealt med 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes från vävnad kulturen.
  3. Föder upp möss tills tre månader ålder: Jag kommer att vara bildat av fem T. cruzi-infekterade honmöss och fem kontroll noninfected manliga kompisar; grupp II kommer att bildas av fem T. cruzi -infekterade manliga och fem kontroll noninfected kvinnliga kompisar. Grupp III kommer att bildas av fem manliga och fem kvinnliga kontroll naiva infekterade kompisar.
  4. Hus varje häckande par i en bur placerad inuti ett värdeskåp med 5 mm rutnät och lock-in dörr att förhindra rymning.
  5. Mata möss chow och vatten ad lib. Höja totalt 70 avvänjning avkommor i grupperna II och jag i minst sex veckor.
  6. Dra blod genom hjärtat punktering från föräldrarnas (FO) och avkomma (F1) möss under anestesi, offra möss och lämna delar av hjärta, skelettmuskel, och reproduktiva organ för patologiska analys.

9. bedömning av immun privilegium

  1. Få vävnader från T. cruzi-infekterad och naiv styra möss (steg 8,6), och skär paraffin-inbäddat proverna i 4 µm tjocka sektioner.
  2. Ta bort paraffinet och torkar ut avsnitten på objektglas med flera ändringar av xylen och graderade tvättar med 100% till 70% etanol, för varje 1 min.
  3. Inkubera i vävnaden avsnitt med 0,05% saponin en gång, följt av tre destillerat vatten tvättar vid rumstemperatur.
  4. Blockera avsnitten vävnad med 5% fettfri mjölkpulver för 45 min. Tvätta objektglasen i 0,1 M PBST och inkubera avsnitten med Chagas musen anti-T. cruzi serum eller infekterade mus kontrollserum på en 1:20 utspädning för 2 h.
  5. Tvätta bilderna trefalt för 5 min i PBST och torrt i rumstemperatur före inkubation med en 1:1,000 utspädning av alkaliskt fosfatas-konjugerad kanin antimus IgG.
  6. Skölj glasen i PBST och tillsätt 100 µL av 3,3' Diaminobenzidin för en 5 minuters inkubation, följt av tre tvättar med PBST och counterstaining med Harris hematoxylin för 30 s.
  7. Tvätta objektglasen i destillerat vatten i 5 min, torka dem i 70%, 80%, 90% och 100% etanol för 1 min och montera dem i buffrad glycerin.
  8. Granska bilderna med en ljus-fältet ljusmikroskop och ta fotobilder med en microkamera med programvara och ett analyzer-program.
  9. Dokumentera immun förmånen av parasiten i avsaknad av inflammatoriska reaktioner i fortplantningsorganen.

10. statistiska analyser

  1. Använda biomedicinsk redigera för sekvensanalys, utföra anpassningar med BLAST och bestämma de E-value statistisk signifikansen (p < 0,05).
  2. Utföra en enkel variansanalys (ANOVA) och Tukey testet att jämföra OD betyder plus eller minus standardavvikelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna forskning, som bedrivs enligt protokollet, syftar till att upptäcka akuta fall av Chagas sjukdom genom kliniska och parasitologiska tentor. Venöst blodproverna utsattes för direkt mikroskopisk undersökning och in vitro-kultur för parasit tillväxt. Tjugoen akuta fall av Chagas sjukdom visade T. cruzi i blod. Forskning protokollet säkrade isolering av T. cruzi ECI1-ECI21 från akut Chagas sjukdom och DNA prover uppvisade positiva DNA fotspår i resten av studiepopulationen: nDNA-PCR-analyser gett typiska telomeren upprepningssekvensen med 188-nt banden närvarande liksom T. cruzi Berenike arketyp1. Fall som Chagas och deras familjemedlemmar som frivilligt att delta i studien grupperades i fyra familjer1.

I denna familj studie var den T. cruzi nDNA PCR amplifieras med primer sätter1,23 glödgas till specifika telomeren sekvensen från var och en av de 21 akuta Chagas sjukdomsfall. Dessa T. cruzi nDNA amplikoner hybridiseras med radiomärkt sekvensk sond (figur 2). den kloning och sekvensering avslöjade att amplikoner består T. cruzi 188-nt telomeren upprepa motivet. Specificiteten av procedurerna hybridisering visades i den negativa kontrollen utförs med L. braziliensis promastigotes. Patologi analys valideras att hemoflagellaters hos akut Chagas sjukdom var verkligen virulenta T. cruzi. Vi dra slutsatsen att T. cruzi nDNA (188-bp) bandet hittade 21 akut Chagas fall (figur 2) är en direkt demonstration av ihållande infektioner.

Sexuell överföring av Trypanosoma cruzi hos människor

Utvärdera nyckeltalen av T. cruzi infektioner, tillämpat vi det nukleinsyra testet för hög känslighet detektion av parasiten fotavtrycken i familjen studie befolkningen1. I dessa PCR-analyser, förstärkning produkter som hybridiseras med specifika radiomärkt 188-nt sond bildades nDNA band 76,1% (83/109) för testproverna; resultaten av södra hybridisering av nDNA-PCR amplifiering produkter med specifika 188-nt radiomärkt sonden visas i figur 3. Dessutom visade hybridizations parasiten DNA i raden bakteriecellen av de frivilliga familjemedlemmarna (figur 4).

OOM var anställd till fenotyp i ECI1 till ECI21 T. cruzi trypomastigotes med humant serum IgG från en Chagas sjukdom bank serumprov med parasitologiska demonstration av protozo i blodet, och en fluorescein konjugerade anti-humant IgG användes . T. cruzi Berenike var en positiv kontroll för Chagas antikroppen, och den negativa kontrollen var promastigote av dess familj relativa L. braziliensis. Figur 5 visar att positiva äppelgrön silhuetten av Berenike urtypen korrelerar med vildtyp T. cruzi kuvert visas i videon.

De ELISA och IIF avslöjade specifika T. cruzi antikroppar1,28 i 28,4% (31/109) för testproverna. Resultaten av ELISA och IIF, samt dem från nDNA-PCR-amplikon och södra hybridizations, ritas i figur 6. Skillnaderna bland resultaten av nDNA-PCR fotspår och de från den specifika antikroppen analyser skildras i heredograms (figur 7), familjen A, fyra individer hade positiva nDNA och anti -T. cruzi antikroppen och 11 hade endast den positiv nDNA; fem hanar hade T. cruzi i sperma ejakulat. I familjen B med 44 personer, 11 hade specifika T. cruzi antikropp och 23 hade både den specifika antikroppen och den parasit nDNA; sju personer hade T. cruzi i sperma ejakulat. Familj C med 29 medlemmar hade antikroppen och den T. cruzi nDNA i fem individer, och 17 hade den parasit nDNA ensam; fyra män hade de nDNA-PCR-positiva i sperma ejakulat. I D-familjen, bland 21 11 hade specifika anti -T. cruzi antikroppen och nDNA fotavtryck, och nio hade positiva nDNA-PCR ensam. Figur 3, figur 6 och figur 7 skildra de breda avvikelserna bland resultaten, konsekvent, i de biologiska prover som erhållits från familj ämnen i tre oberoende experiment kör ett år ifrån varandra.

Tabell 1 visar de kvantitativa skillnaderna mellan IIF, ELISA och de nDNA-PCR assays i prover från mänskliga studie familjerna A-till-D. Skillnaderna mellan nyckeltalen av antikropp analyser (28,4%) och positiva nukleinsyra analyser (76,1%) är statistiskt signifikant (p < 0,005). I dessa familjer stod skillnaderna mellan grupper av T. cruzi -infekterade människor (III och IV) för 62,6% (52/83) av befolkningen, visar en positiv nucleic acid test ensam. De breda avvikelserna bland nyckeltalen av positiva nDNA fotspår och de av de särskilda T. cruzi antikropp förklarades av de experiment som utförs i systemet kyckling modell.

Immuntolerans

Utvärdering av immunsvaret utfördes i grupper av kycklingar upp till vuxen scenen i enskilda burar i separata gångar innehållande naiva kontroll kycklingar (A). håna kontroll kycklingar som kläckts från ägg som inokulerats med odlingsmedium (B). och kycklingar som kläckts från T. cruzi trypomastigotes-inokuleras ägg (C)26. Vuxen kycklingar i grupp B och C utmanades tre gånger med det formalin-dödade T. cruzi trypomastigote antigen, veckovis, som visas i videon. ELISA och IIF analyserna kördes med serumet insamlade från grupp A, B och C kycklingar en månad efter utmaning. Figur 8 visar avsaknad av den specifika antikroppen i grupp A och C hönor, som kontrasterar skarpt med specifik antikroppsproduktion i grupp B som immuniserats med T. cruzi antigenet. Resultaten visade tydligt immun tolerans i grupp C kläckts från den T. cruzi-inokuleras ägg.

Sexuell överföring av Försök panosoma cruzi i mus modellsystem

Dessutom smittsamhet för T. cruzi från Chagas patientens ejakulat, som testade positivt i PCR och saknade den specifika antikroppen, demonstrerades genom instillations av 100 µL av sperma in i bukhålan hos hanmöss och genom en lika stor mängd sperma ingjutit i slidan. Fem veckor senare T. cruzi amastigote Bon upptäcktes i hjärtat och skelettmuskulaturen och klumpar av differentiering parasiter var närvarande i lumen av sädesledaren och livmoder röret. Intressant, de destruktiva inflammatoriska reaktionerna inte omger Bon och klumpar av den T. cruzi amastigotes (figur 9).

Bedömningen av sexuell överföring av T. cruzi infektioner genomfördes ytterligare i två grupper av möss som inokulerats intraperitonealt med 1 x 105 T. cruzi Berenike trypomastigotes former1,30, 31. I experimentella gruppen I, 10 T. cruzi -infekterade män parad med 10 naiva kontroll honmöss. I experimentell grupp II, 10 T. cruzi -infekterade honor parat med 10 naiva kontroll hanar. Figur 10 visar att i T. cruzi-infekterad hanmöss (A-till-E) och den T. cruzi -infekterade honmöss (F-g) gav 188-bp nDNA band (udda nummer). Efter avel förvärvade de naiva kompisar (jämna nummer) lätt T. cruzi efter en unik sexuellt möte med en chagasic kompis. Liknande upprepa experiment som utförs under identiska förhållanden bekräftas att varje naiva kvinnliga eller manliga mus som sexuellt parad med en T. cruzi-infekterade manliga eller kvinnliga förvärvade flagellate infektionen. Dessa nDNA-positiv grundare (F0) genererade avkomma som de upp till sex veckors ålder. Sedan testet och kontroll infekterade möss var bled via hjärtat punktering att samla cirka 0,5 mL blod. De nDNA-PCR-analyserna visade att grundarnas (F0) sexuellt förvärvade infektioner överfördes till på F1-avkomman, vilket framgår av de 188-bp nDNA band (figur 11). På F1-avkomman var nDNA-positiva i 41 av 70 (58,6%) proverna undersökas. Av dessa möss med nDNA band tyder på vertikalt förvärvade infektioner, så lite som 9 av 41 (22%) hade T. cruzi antikroppar.

F1 avkommor mössen offrades under narkos och kroppsvävnader utsattes för patologiska och immun peroxidas-färgning analyser. Resultaten av dessa experiment visas i figur 12. Resultaten för den T. cruzi amastigotes dokumenterades i de interstitiella cellerna av bitestiklarna och goniablasts; amastigotes differentiera till trypomastigotes fanns i lumen av sädeskanalerna i avsaknad av inflammatoriska reaktioner.

Figure 1
Figur 1 . Trypanosoma cruzi infektion i de seminifera tubuli av en pojke som dog av akut Chagas sjukdom . Microphotograph från läkare Teixeiras fil, 197018. Formulären för T. cruzi är i goniablasts och klumpar av amastigotes och gratis trypomastigotes (pilar) är närvarande i lumen av de seminifera tubuli i avsaknad av inflammatoriska infiltrat1. Hematoxylin-eosin fläckar. «««Bar, 20 µm. Reprinted med tillstånd från förlaget och författarna1,19.

Figure 2
Figur 2 . Fotavtryck av Trypanosoma cruzi från akut Chagas sjukdom. T. cruzi nDNA-PCR amplifiering produkterna bildas 188-nt band med en specifik radiomärkt 188-nt sond. TC, T. cruzi; NC, negativ kontroll. Återges med tillstånd från utgivaren och författaren1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Södra blotting analys av Trypanosoma cruzi infektioner hos mänskliga studie familjer. Familjen Andersson - alla 15 patienter visade specifika nDNA-PCR 188-nt band. Familjen B bildade totalt 35 av 43 patienter (81,4%) banden specifika nDNA. Familj c bildade bland 29 medlemmar, 22 (75,8%) banden nDNA. I D-familjen hade 11 av 21 patienter (52,4%) banden nDNA. Den T. cruzi-specifika nDNA band bekräftades av kloning och sekvensering. Återges med tillstånd från utgivaren och författaren1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Aktivt Trypanosoma cruzi infektioner i sädesvätskan ejakulat från studie familj frivilliga. Infektioner i Chagas patienternas får utlösning identifieras av banden nDNA-PCR 188-bp. TC, T. cruzi positiv kontroll. NC, L. braziliensis negativ kontroll. Återges med tillstånd från utgivaren och författaren1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Fenotypen av Trypanosoma cruzi med Chagas sjukdom patienternas serum antikroppar. T. cruzi identifieras med den Chagas serum-IgG-antikropp som känner igen den parasit trypomastigote behandlas med en FITC-märkt monoklonal Ab anti-humant IgG. Anti-T. cruzi Ab identifierar inte Leishmania braziliensis promastigotes. Inläggningar visar de negativa kontrollerna. Barer, 20 µm. Reprinted med tillstånd från utgivaren och författaren1. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 6
Figur 6 . Grafisk representation av ELISAs och nDNA-PCR-analyser i familjen studie befolkningen. i grupp (n = 10) och grupp II (n = 20) var den negativa kontrollen och de positiva kontrollsera, respektive från T. cruzi infektioner med parasitologiska demonstration. Grupp III (n = 31) inkluderade prover från familj försökspersoner med 188-bp nDNA band och specifika antikroppar till T. cruzi. Grupp IV (n = 52) bestått provet från försökspersoner med T. cruzi infektioner upptäcks av den nDNA-PCR 188-nt amplikoner i avsaknad av den specifika antikroppen. Grupp V (n = 26) var negativa prover bestående av sjukdomsfri människorna i studien familj. Återges med tillstånd från utgivaren och författaren1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 . Den heredograms och kartläggning av den Trypanosoma cruzi- smittade familjebefolkningen. Figuren visar skillnaderna bland företagets nyckeltal anti -T. cruzi antikropp och de av de nDNA-PCR-analyserna. Öppna torget och cirkel, negativa hane och hona. Röda fyrkanter och cirklar ochT. cruzi antikropp positiva anti - nDNA-PCR. Svarta fyrkanter och cirklar, positiva nDNA-PCR ensam. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 8
Figur 8 . Den immun toleransen hos kycklingar som kläckts från Trypanosoma cruzi- inokuleras ägg. (A) preimmune antikropp profil i håna kontroll kycklingar (n = 10). B) den specifik antikroppsreaktion i kontrollen naiva kycklingar utmanas med T. cruzi antigenet (n = 20). C) avsaknaden av ett specifikt immunsvar hos kycklingar som kläckts från den T. cruzi-inokuleras ägg efter utmaning med T. cruzi antigenet (n = 20). Optisk densitet skillnaden mellan A och C (024 ± 0,17) mot B (0,85 ± 0,6) är statistiskt signifikant (p < 0,05). Denna siffra har ändrats från referens26 och återges med tillstånd från förlaget och författaren.

Figure 9
Figur 9 . Den smittsamma Trypanosoma cruzi i mänskliga får utlösning översätter till en aktiv murina infektion. Alikvoter av Chagas patienten får utlösning var ingjutit in i bukhålan eller i möss vagina. Mössen offrades tre veckor efter instillation. Översta lane, T. cruzi amastigotes Bon i hjärtat (vänster) och i skelettmuskulaturen (höger). Botten lane, T. cruzi amastigote Bon i den sädesledaren (vänster) och i livmoder röret (höger). Skäret visar en avdelande amastigote (cirkel). Lägg märke till avsaknaden av inflammatoriska infiltrat i avsnitten vävnad. Hematoxylin-eosin fläckar. Barer: övre och nedre vänstra, 20 µm; längst ned till höger, 10 µm. Reprinted med tillstånd från utgivaren och författaren1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10 . Sexuell överföring av Trypanosoma cruzi infektioner i musen modell system av samlag. Överföringen av T. cruzi infektioner från chagasic till naiva kompisar framgår av särskilda nDNA 188-bp banden avslöjade i de södra hybridizations. Översta lane) Prebreeding profiler av PCR-amplifiering produkter av T. cruzi -infekterade möss och naiva möss. Udda siffrorna anger den T. cruzi-infekterade manliga A-till-E och kvinnliga F-till-I mus prover. Även siffrorna är naiv kvinna (2-till-10) och hane (12-till-20) möss. Botten lane, efter avel, profiler showen som även möss 2-till-20 förvärvade T. cruzi infektioner. Återges med tillstånd från förlaget och författaren1,30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11 . Den Trypanosoma cruzi infektionen överförs vertikalt från de F0 chagasic föräldraledighet till F1 avkommor möss. Den chagasic föräldern överförs T. cruzi infektioner av en enda avel möter. Den T. cruzi-infekterade kvinnor parades naiva män A-E och naiva honorna parades till T. cruzi -infekterade hanarna F-J. Efter avel visade alla grundarna (F0) positiva protozo nDNA-PCR 188-bp bandet. Södra blotting visade specifika nDNA bandet efter hybridisering med radiomärkt 188-nt sonden i en majoritet av F1 kullar. NC, L. braziliensis negativ kontroll; TC, T. cruzi positiv kontroll. Återges med tillstånd från förlaget och författaren1,31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12 . Den histopatologi som dokumenterade Trypanosoma cruzi sexuellt överförbara från F0 till F1 avkommor och immun tolerans i avsaknad av en inflammatorisk reaktion. Avsnitten visar tillväxt av T. cruzi former i bitestiklarna, goniablasts och sädeskanalerna av F1 möss. Mössen offrades under anestesi, och avsnitten immun peroxidas-färgade undersöktes under ett mikroskop. Mikrofotografier Visa brunaktig immun peroxidas-färgade T. cruzi amastigotes i den interstitiella av bitestiklarna (A) och klumpar av amastigotes differentiera till trypomastigotes skjul i lumen av de seminifera tubuli (B, C, och F). Amastigote boet sett i en goniablast (D). Positiv kontroll musens seminifera tubuli normal histologi (E). Lägg märke till avsaknaden av inflammatoriska infiltrat i testiklarna av F1 möss visar massor av Chagas parasiter. Giemsas fläcken. Barer: A, B, C och E, 20 µm; D och F, 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Tabell 1. Skillnaderna mellan företagets nyckeltal positivt IIF och ELISA tentor och nDNA-PCR assays i prover som samlats in från de mänskliga studie familjerna A-till-D *

Grupper ** ELISA: serum anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA-PCR (%)
Jag-Control Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - Control Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28,4 31/109 28,4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-free Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Resultatet av tre oberoende ELISA och nDNA-PCR-analyser som kör i proven uppsamlade i tre olika tillfällen vid år 1, 2 och 3. [1]. förstärkning av de 188-nt T. cruzi DNA upprepa bekräftas av kloning och sekvensering.
** Skillnaderna bland negativa (grupper I och V) och den positiva ämnen (grupp III och IV) är statistiskt signifikant (p < 0,05).
ᵟ skillnaderna mellan grupperna III och IV som förklaras av den immun toleransen i avsaknad av T. cruzi antikroppen uppnås i 62,6% (52/83) av PCR-positiva patienterna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Häri, vi diskuterar en familjebaserade forskningsprotokoll som besvarade frågan om huruvida mänskliga Chagas sjukdom härrör från sexuellt överförbara artspecifika T. cruzi infektioner. Tidiga studier kunde inte bevisa sexuell överföring av T. cruzi infektioner, förmodligen eftersom tillgängliga data och information om Chagas sjukdom erhölls separat från de enskilda3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Konstaterandet av T. cruzi i de seminifera tubuli av en pojke (figur 1) var gnistan som sporrade klinisk och epidemiologisk undersökning. Efter flera årtionden, möjligen när familjen studerar metoder och de tekniker som beskrivs i denna forskningsprotokoll fanns tillgängliga, T. cruzi livscykelstadier verkade i mänskliga ejakulat1,19.

Den direkta parasitologiska demonstrationen av protozo i 21 akut Chagas sjukdomsfall var avgörande för att validera nDNA-PCR amplifiering produkterna, som bildat särskilda band i prover från alla ämnen acutely infekterade med T. cruzi. Denna point-of-care laboratorium markör utvärderas resultaten av immunologiska och nukleinsyra analyserna. Grundläggande långsiktiga Chagas sjukdom familj studien, kombinerar därför resultaten hos människor med sådana som erhållits i grupper av försöksdjur. Forskningen bedrivs enligt protokollet visade för första gången att T. cruzi infektioner överförs sexuellt i människor1.

Breda skillnaden mellan nyckeltalen från parasit-specifika antikroppar analyserna och de från nucleic acid tester visar att majoriteten av nDNA fotavtrycken resulterade från sexuellt överförbara fall i avsaknad av specifika anti T. cruzi antikroppar. Sexuell överföring av T. cruzi i familjemedlemmar uppvisar positiva nDNA i avsaknad av den specifika IgG-antikroppen var alltså på grund av immuntolerans.

Immuntolerans visades i kyckling modellsystem refraktära mot T. cruzi infektioner efter den första veckan av embryo tillväxt1,25,26,32,33, 34. Därefter, omogna immunförsvarets oförmåga att känna igen parasiten som ett främmande inslag i kroppen anges den kyckling sent mogna immunsystemet tolerans mot T cruzi. Med tanke på dessa resultat är tolerans ett naturligt fenomen1 som följer av immunförsvarets self-erkännande och underhåll av sin egen kropp komponenter under fysiologiska betingelser25,26, 32 , 33 , 34. övergången från staten av immuntolerans till autoimmuna Chagas hjärtsjukdom kan därför associeras med effektor cell ändringar som följer T. cruzi kinetoplasten (kDNA) mutationer i värdens genomet1 ,2,14,23,25,26.

De kritiska steg i protokollet forskning beskriva huvudsakliga teknik ändring och felsökning för att avslöja de sexuellt överförbara Chagas parasiter1,14,23,25, 26: jag) att välja studie familjer med fall av akut Chagas sjukdom35,36. ii) isolera av vildtyp T. cruzi från blodet av akuta fall; iii) att få DNA-prover från familjer deltagare blod flagellater, från Berenice T. cruzi urtypen, från positiv deidentified bank DNA-prover och från negativ kontroll L. braziliensis; iv) utför tidy tekniska förfaranden för att visa att deltagarnas flagellater nDNA fotavtryck är identisk till det av Berenike T. cruzi arketypen och av dessa positiva bank DNA prover; v) igång oberoende tre exemplar nDNA fotavtryck att demonstrera de T. cruzi infektionerna hos familjemedlemmar vid tre tillfällen ett år isär; vi) att säkerställa att nDNA-PCR tekniken genomfördes vid tidpunkten för vård ger resultat bekräftas av kloning och sekvensering alla de amplikoner glödgas till specifika primern uppsättningar, således genomgående visar sekvensen för T. cruzi -188-nt 1,25,28,29,30; vii) med hög kvalitet varumärke reagens för att reproducera de antikroppsnivåerna var fortfarande i serumprov insamlade vid tre olika tidpunkter; viii) familj studieprotokollet avslöjade befintliga levande infektionen i könscellerna vid demonstrationen av den T. cruzi nDNA i avsaknad av specifika serumantikroppar i sperma får utlösning som samlats in från Chagas parasit-infekterade individer1; ix) perspektiv är att protokollet forskning utformad att nysta upp den sexuellt överförbara T. cruzi infektioner bör offentliggöra den autoktona Chagas sjukdomen på fem kontinenter; x) i nDNA och kDNA fotspår säker diagnos av kronisk asymptomatisk Chagas sjukdom i människor1,2. xi) i avsaknad av nDNA, mutationav den T. cruzi kDNA sekvens1,2,23,25,26 ensam är en laboratorium markör för att uppnå den differentiella diagnosen från idiopatisk dilaterad kardiomyopati23,25,37,38,39.

Dessutom, kunde den virulenta T. cruzi dokumenterade i Chagas patienten får utlösning inleda utbredda infektioner vid instillation i mus slidan och in i dess bukhålan. Patologi studien visade T. cruzi amastigote Bon i hjärtat och skelettmuskulaturen samt i sädesledaren och livmoder röret. Intressant, parasit Bon inte provocera inflammatoriska reaktioner som skulle hindra vitala reproduktiva funktioner. Avsaknad av inflammatoriska reaktioner återger immun förmånen i vitala funktionell kropp strukturer40,41,42,43,44,45 och därför förklarar uncurbed tillväxten av T. cruzi i fortplantningsorganen.

Dessutom förklaras de experimentella studierna i chagasic möss som uppvuxna med naiva kompisar ytterligare sexuell överföring av T. cruzi infektioner hos människor. Den smittade tikar och hanar överförda T. cruzi infektioner till de icke-infekterade behandlingsnaiva kompisar under samlag, och majoriteten av sina kullar förvärvade den T. cruzi vertikalt överförs från förälder till avkomma. I dessa experiment avses den inledande fasen tillväxten av T. cruzi i röret i livmodern, samt i de seminifera tubuli och sädesledaren, där privilegiet immun ägde rum. Sedan, sexuell överföring skett genom de parasitiska stadierna i sperma eller i livmodern sekret i slidan. Immun privilegium40,41,42,43,44,45 är ett fenomen som gör att vissa organ (reproduktiva systemet, ögon och hjärna) till downregulate inflammatoriska reaktioner och undvika att skada viktiga, känsliga och specifika funktioner40. Hormoner41 och flera immun faktorer downregulate makrofager41,42,43, naturliga mördarceller41, T-lymfocyter och T-reglerande (Treg) celler, således iscensättandet den hämning av ett antal proinflammatoriska cytokiner och immun-privilegium utlösare40,41,42,43,44,45.

Sexuell överföring av T. cruzi infektioner från män och kvinnor att naiva partner anger att kontroll av Chagas sjukdom kräver internationell solidaritet. Resultaten diskuteras häri tyder på att mer kreativ forskning behövs. Följande omedelbara mål kan uppnås: jag) att utveckla hög genomströmning plattformar för specifika och känsliga nukleinsyra testning för att nå en korrekt diagnos, sikte för förebyggande av infektioner som överförs via samlag, blodtransfusion och organtransplantation samt underlätta kliniska och epidemiologiska undersökningar för att fastställa diagnos och prevalensen av Chagas sjukdom; ii) att främja en multicenter drog utvecklingsprogram att få nya läkemedel för utrotning av T. cruzi infektioner; och iii) att genomföra en lämplig utbildning, information och kommunikation program som inkluderar deltagande skolor, kyrkor, sociala organisationer och hälso-och sjukvårdsinstitutioner att förhindra spridningen av Chagas sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner laboratorium och de kritiska synpunkterna av Izabela Dourado, Carla Araujo, och smart Gomes och tekniskt bistånd av Bruno Dalago och Rafael Andrade. Vi står i skuld till stiftelsen för befordran av vetenskap (FAPDF), National Research Council, ministeriet för vetenskap och teknik (CNPq/MCT) och byrån för mänskliga resurser, Undervisningsministeriet (uddar / mig), Brasilien, för att stödja dessa utredningar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Tags

Immunologi och infektion fråga 143 familj studie, Trypanosoma cruzi sperma får utlösning uterin sekretion mus modellsystem vertikal överföring immun privilegium kyckling modellsystem immuntolerans Chagas sjukdom.
Sexuell överföring av amerikanska innebörder från hanar och honor till Naive kompisar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter