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Immunology and Infection

Sexuelle Übertragung von amerikanischen Trypanosomen von Männchen und Weibchen zu Naive Mates

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

Die Trypanosomen Trypanosoma Agent der Chagas-Krankheit produziert langlebige asymptomatische Infektionen, die abrupt in klinisch anerkannten Pathologie zu entwickeln. Die folgenden Forschungs-Protokoll beschreibt eine kurzfristige familienbasierte epidemiologische Studie um die T. Trypanosoma Infektion, sexuell übertragbare von übergeordneten an Nachkommen zu entwirren.

Abstract

Amerikanische Trypanosomiasis ist durch Triatomine Fehler durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln, durch Bluttransfusionen oder versehentlich in Krankenhäusern und Forschungslaboren auf den Menschen übertragen. Darüber hinaus die Trypanosomen Trypanosoma Infektion wird Geburt an einer Chagasic Mutter auf ihre Nachkommen übertragen, aber der männliche Partner Beitrag im Mutterleib Kontamination ist unbekannt. Die Ergebnisse der Nester und Klumpen von Amastigoten und Trypomastigotes in der Theca-Zellen des Eierstocks, der Goniablasts und in das Lumen der seminiferous Röhrchen legen nahe, dass T. Trypanosoma Infektionen sexuell übertragen werden. Die Forschungs-Protokoll hier präsentiert die Ergebnisse einer Familie Studie Bevölkerung zeigt Parasit Zellkern-DNA in den diploiden mononukleären Blutzellen und in der haploiden Gameten von Versuchspersonen. So bestätigte drei unabhängige biologische Proben ein Jahr auseinander, daß T. Trypanosoma Infektionen sexuell an Nachkommen übertragen wurden. Interessant ist, die spezifischen T. Trypanosoma Antikörper fehlte in den meisten Familien nachkommen, die Immuntoleranz gegen die Parasiten-Antigen zu langweilen. Immuntoleranz zeigte sich nach der ersten Woche des embryonalen Wachstums im refraktär gegenüber T. Trypanosoma Huhn und Küken schlüpften aus den Eiern ist geimpft waren nicht in der Lage, die spezifischen Antikörper zu produzieren. Darüber hinaus ejakuliert der Instillation des menschlichen Spermas, intraperitoneal oder in die Scheide der naive Mäuse ergab T. Trypanosoma Amastigoten im Nebenhoden, seminiferous Röhrchen, Samenleiter und uterine Rohr mit einer Abwesenheit von entzündlichen Reaktionen in den immun privilegierte Organen der Reproduktion. Die Zucht von T. Trypanosoma-infizierten männliche und weibliche Mäusen mit naiven Kumpels führte Erwerb der Infektionen, die später auf die Nachkommen übertragen wurden. Daher gilt eine robuste Bildung, Information und Kommunikation Programm, die die Bevölkerung und sozialen Organisationen umfasst notwendig, Chagas-Krankheit zu verhindern.

Introduction

Einzelliger Parasit Trypanosomen Trypanosoma aus der Familie Trypanosomatidae erfährt Trypomastigote und Amastigote Lebenszyklusphasen Säugetier-Wirte und existiert als Epimastigotes im Insekt-Vektor (Reduviid: Triatominae) Darm und in axenic Kultur. In den letzten Jahrzehnten zeigen mehrere Studien die Anwesenheit der Chagas-Krankheit in Ländern auf vier Kontinenten betrachtet Triatomine Fehler kostenlos1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; die Streuung der amerikanischen Trypanosomen wurde zunächst lateinamerikanischen Einwanderer in der nördlichen Hemisphäre zugeschrieben, aber die Möglichkeit, dass einige autochthone Fälle der Chagas-Krankheit kann nicht mehr geleugnet werden,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. die nur erkennbar endogenen Übertragungsquelle T. Trypanosoma hat die Chagasic Mutter Übertragung des Parasiten auf die Nachkommen in etwa 10 % der Schwangerschaften15; zugeschrieben worden der männliche Partner Beitrag im Mutterleib Infektionen durch Sperma ejakuliert ist unerkannt geblieben.

Vor mehr als einem Jahrhundert Ermittler16,17 beobachtet intrazellulären T. Trypanosoma Amastigoten in der Theca-Zellen des Eierstocks und der Keim Linie Zellen der Hoden von akuten Fällen der Chagas-Krankheit. Die Nester und Klumpen von T. Trypanosoma Trypomastigotes und Amastigoten in Theca-Zellen des Eierstocks, in Goniablasts und in das Lumen der seminiferous Röhrchen (Abbildung 1) der tödlichen akuten Chagas Krankheit Fälle entwickeln immun Privileg in den Organen des Reproduktion in Ermangelung von entzündliche Infiltrate18,19. In den letzten Jahrzehnten ein paar experimentelle Studien haben Nester der Runde Amastigote Formen von T. Trypanosoma in seminiferous Röhrchen, Nebenhoden und Samenleiter als auch in der Gebärmutter, Röhren und Eierstock Theca-Zellen von akut infizierten Mäusen gezeigt 1,20,21,22. Darüber hinaus im Laufe der Familie Studien, die Übertragung von Protozoen zu dokumentieren, mitochondriale DNA von elterlichen Chagas Patienten an ihre Nachkommen, T. Trypanosoma Kern-DNA (nDNA) wurde in menschlichen haploiden Keimzellen Linie Zellen23, überprüft, und Parasit Lebenszyklusphasen wurden in die ejakuliert Chagasic Mäuse24beobachtet. Diese Erkenntnisse sind im Einvernehmen mit Berichten über die Immuntoleranz durch die Nachkommen von T. Trypanosoma -infizierten Hosts in Ermangelung der spezifischen Antikörper1,25,26erreicht. Darüber hinaus epidemiologische Berichte, die die Verbreitung der Chagas-Krankheit endemisch auf den anderen Kontinenten3,4,5,6,7,8 vorgeschlagen ,9,10,11,12,13 sind nun unterstützt durch experimentelle Studien zeigen, dass die Chagas-Krankheit, die sexuell übertragen werden kann1 . Diese Untersuchung stellt eine epidemiologische Familie Studienprotokoll und zeigt, dass T. Trypanosoma Infektion durch Geschlechtsverkehr propagiert.

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Protocol

Der Mensch und das Tier Forschung Ausschüsse von der medizinischen Fakultät der Universität von Brasilia alle Verfahren mit Menschen und Versuchstieren, bzw. im Forschungsprotokolle 2500.167567 und 10411/2011 genehmigt. Die Ethik-Kommission der öffentlichen Stiftung Krankenhaus Gaspar Vianna (Protokoll Nr. 054/2009 und CONEP 11163/2009) genehmigt die freie Zustimmung-Formulare für die Feldstudie mit Erweiterung auf der Ministerium der Gesundheit National Commission on Human Research (CONEP 2585/04). Das Protokoll wurde angepasst, um T. Trypanosoma DNA in diploiden mononukleären Blutzellen und haploiden Gameten von Sperma ejakuliert zu beurteilen. Die Versuchstiere erhielten humane Pflege; die Mäuse, Herz Punktion vor Opfer, unterzogen wurden unter Narkose.

1. Rekrutierung von menschlichen Teilnehmern

  1. Sicherstellen Sie, dass das Research-Team beteiligt sich in ein System Chagas Krankheit Gesundheitsprogramm Chagas Patienten medizinische Versorgung anzubieten.
  2. Rekrutieren Sie menschliche Teilnehmer aus Familien, die in das Programm eingeschrieben in mindestens einem Fall mit Fieber, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Tachykardie und Ödeme, die wichtigsten klinischen Symptome der akuten Chagas Krankheit14zeigt.
  3. Liefern Sie Gesundheitsversorgung für die Menschen in den Familien Studie über einen Zeitraum von fünf Jahren.
  4. Erhalten Sie 15 mL venöses Blut aus der Studienteilnehmer dreimal ein Jahr auseinander, die Probe in drei 5 mL-aliquoten teilen und aufbewahren im Kühlschrank bei 4 ° C.
  5. Sammle 2 mL Sperma ejakuliert von Erwachsenen ehrenamtlichen Familienmitgliedern und fahren Sie wie unter Punkt 3.3 beschrieben.

2. Wachstum des Parasiten

  1. Mit den Aliquoten aus Schritt 1.4, das Blut mit 5 Einheiten von blutgerinnungshemmender Natrium Heparin mischen; machen Sie eine Steigung Kultur durch die Impfung von Blut von Familie Teilnehmer mit der Diagnose einer akuten Chagas-Krankheit.
    1. 5 mL unclotted menschliches Blut in ein 50 mL Schraubverschluss Rohr Blutagar schräge plus 5 mL Leber Aufguss-Tryptose Medium (LIT) zu impfen, und 3 Monate die Probe in einem Shaker bei 27 ° C inkubieren.
    2. Legen Sie 100 µL des Mediums Überstand auf Objektträger, Decken mit Zettel und Suche nach Blut T. Trypanosoma Epimastigotes unter die Lupe genommen, alle vier Wochen.
    3. Ernten Sie die Epimastigote-Isolate im Überstand der axenic LIT Medium bei 27 ° C; Waschen Sie die Zellen in PBS pH-Wert 7,4, Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min; verdünnen Sie die Epimastigotes im Pellet in 5 mL Dulbeccos veränderten wesentliche Medium (DMEM).
    4. Impfen die konfluierende L6 Muskel Zellkulturflaschen mit 1 x 106 ECI1-ECI21 T. Trypanosoma Epimastigote isoliert.
    5. Wachsen Sie die T. Trypanosoma ECI1, ECI21 und Berenice Archetyp Trypomastigotes in L6 Muskel Zellkulturen in 75 mL Kulturflaschen.
    6. Füttern Sie Zellen mit 15 mL DMEM bei pH 7.4 mit 5 % fötalen Rinderserum, 250 nM L-Glutamin und 5 % CO2 bei 37 ° C1100 IU/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin ergänzt.
    7. Verwenden Sie der Positivkontrolle T. Trypanosoma Berenice Trypomastigotes, Phänotyp der ECI1-ECI21-Isolate aus Gewebekultur, wie im Schritt 5.2 beschrieben.
    8. Wachsen Sie die Negativkontrolle Leishmania Braziliensis27 in DMEM mit 20 % fötalen Rinderserum nur ergänzt, und verwenden Sie die Parasiten Promastigotes als Negativkontrolle.
    9. Verwenden Sie 1 x 106 T. Trypanosoma ECI1-ECI21 Trypomastigotes im Überstand von der Zellkultur, um Mäuse zu infizieren.
    10. Suche nach T. Trypanosoma Trypomastigotes im Heck Blut nach der ersten Woche der Infektion.
    11. Suchen Sie die Nester der Amastigoten in Hämatoxylin-Eosin gefärbt Abschnitte des Herz, Skelettmuskel und Fortpflanzungsorgane der infizierte Mäuse, einen Monat danach.

3. DNA-Extraktion und PCR-Analysen

  1. 5 mL Blut (Schritt 1.4) in ein steriles Röhrchen EDTA aliquoten und durchführen Sie Dichte-Gradienten-Zentrifugierung für 45 min bei 3.000 X g. Verwenden Sie eine Pipette, um der mononukleären Zellen aus der weißliche Phase über den roten Zellen zu ernten, waschen die weißen Zellen zweimal in 5 mL PBS, pH 7,4, durch Zentrifugation für 10 min bei 1.500 X g in einer anderen 15 mL Tube, und verwenden Sie die Zellen für die DNA-Extraktion.
  2. ECI-1 zu ECI-21 T. Trypanosoma, aus der Positivkontrolle Berenice T. Trypanosoma, von der negativen Kontrolle L. Braziliensis (Schritt 2.1.8), die DNA extrahieren und aus den Test mononukleären Blutzellen von 109 Menschheitsfamilie Studie Themen1 , 27 , 28.
  3. Verdünnte 2 mL Spermaproben in Schritt 1.5 in DMEM (1:4, V/V); 45 min um 5 % CO2 und 37 ° C inkubieren Sie, wiederherstellen Sie Spermien aus der Überstand nach Zentrifugation für 5 min bei 13.000 X g, und extrahieren Sie der haploiden DNA-23.
  4. Platz 1 mL der Zellen im Extraktionspuffer (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1 % SDS, 0,04 % Proteinase-K und 1 % Dithiothreitol), und die Lösungen von Inversion und schütteln zu mischen.
    1. Zentrifugieren Sie die Lösungen für 10 min bei 13.000 x g und 25 ° C und übertragen Sie den viskosen Überstand an einer Spin-Spalte.
    2. Die Spin-Spalte für 1 min bei 10.000 X g Zentrifugieren und das Eluat zu verwerfen; der Spin-Spalte (Table of Materials) 500 µL Bindung Puffer hinzu, für 1 min bei 12.000 X gZentrifugieren Sie, und entsorgen Sie das Eluat.
    3. 600 µL waschen Puffer auf die Spin-Spalte hinzufügen, für 1 min bei 12.000 X gZentrifugieren und das Eluat zu verwerfen.
    4. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, und übertragen Sie die Spin-Spalte auf eine sterile 1,5 mL Mikro Zentrifugenröhrchen.
    5. Fügen Sie 100 µL TE-Puffer, das Rohr auf 2 min bei Raumtemperatur inkubieren, und dann das Rohr für 1 min bei 12.000 X gzentrifugieren. Der Puffer im Microcentrifuge Schlauch enthält die DNA.
    6. DNA-Konzentration zu messen, indem man Aliquoten auf einem 0,8 % Agarose-Gel und durch das Lesen der Absorption bei 260 nm mit einem Spektrophotometer. Speichern Sie die DNA-Proben bei-20 ° C bis zur Verwendung in der PCR-Analyse.
  5. Verwendung T. Trypanosoma Tcz1/2 Primer auf die spezifischen 188-nt spezifische Telomer-Sequenz geglüht Sonde29 und führen die PCR mit DNA aus der Familie Probanden Blut und Sperma, aus der Berenice T. Trypanosoma positiv-Kontrolle und die L. Braziliensis Negativkontrolle.
    1. Bereiten Sie die PCR Mischung mit 10 ng Schablone DNA, 0,4 µM jedes Paars von Grundierungen, 2 U Taq DNA-Polymerase, 0,2 µM dNTPs und 15 µM MgCl2 in einem 25 µL Endvolumen.
    2. Initiieren der DNA Verstärkung Programm bei 94 ° C für 30 s zu denaturieren die Vorlage, und kühlen die Proben auf 55 ° C für 30 s. Inkubieren Sie dann, die Proben bei 94 ° C für 90 s, die geglühten Primer zu verlängern. Die Rücklauftemperatur auf 94 ° C für 30 s, um den nächsten Zyklus zu initiieren und inkubieren Sie die Proben eine zusätzliche 3 min bei 72 ° C. Am Ende des Zyklus 32Nd kühlen Sie die Proben 10 min bei Raumtemperatur, und speichern Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C-29.
    3. Ein T. Trypanosoma DNA Telomere Wiederholsequenz geglüht, Tcz1/2 Primer an beiden Enden zu verstärken.
    4. Analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf einem 1,3 % Agarose-Gel zu und beobachten Sie 188-nt DNA-Bänder auf einem UV-Strahler.

4. Southern -Hybridisierung

Hinweis: Southern -Hybridisierung wurde verwendet, um die meisten die falsche positive PCR-Amplifikate im Agarosegel zu verwerfen.

  1. PCR-Amplifikationsprodukte von nicht infizierten Kontrollen von Chagas Fall Positivkontrollen aus 109 Proben von diploiden DNA und haploiden DNA 21 Familie Studienteilnehmer zur südlichen Hybridisierungen zu unterwerfen.
  2. Beschäftigen Sie die T. Trypanosoma 188-nt DNA-spezifischen Telomere Sequenz Sonde geglüht, die Tcz1/2 Primer gezeigt; Beschriften Sie die Sonde mit [α -32P] 2'-Deoxyadenosine Triphosphat (dATP) mit einer zufälligen Grundierung labeling Kit, und analysieren Sie die Amplifikationsprodukte auf einem 1,3 % Agarose-Gel bei 60 V über Nacht bei 4 ° C.
  3. Übertragen Sie das Gel in einer positiv geladenen Nylon-Membran mit der Kapillare Methode über Nacht.
  4. Hybridisieren Sie die DNA-Bänder mit der radioaktiven 188-nt-Sonde, die die EcoR1-Übersichten der genomischen DNA in 25 µL des Puffers Enzym-spezifische für Variable Zeiträume bindet an die Nylon-Membran übertragen.
  5. Waschen Sie die Membran zweimal für 15 min bei 65 ° C mit 2 X SSC und 0,1 % SDS.
  6. Röntgenfilme, die Nylon-Membran und Autoradiograph die Bands auf der Membran für eine Woche aussetzen.
  7. Wachsen Sie die Klone von PCR und Southern -Hybridisierung mit der T. Trypanosoma PCR Verstärkung Produkte, die mit der bestimmten radioaktiven DNA-Sonde hybridisiert werden ausgewählt.
  8. Kommerziell-Sequenz die Klone mit Tcz1/2 Primer set geglüht, der T. Trypanosoma -spezifische Telomer-Bilanz2,23.

5. immunologische Tests

Hinweis: Die Sensitivität und Spezifität der indirekte Immunfluoreszenz (IIF) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) beurteilte im Serum von sechs Chagas Patienten mit nachweisbaren Parasitemia und aus sechs Chagas-free deidentifiziert Serum Bank-Proben. Die Assays mit doppelten Serum Verdünnungen in PBS, pH 7,4, ergab, dass die IIF bei Verdünnungen von 1: 100 und die ELISA optische Dichte (ODs) 0,150 und über die negativen Ergebnisse die positiven getrennt durchgeführt.

  1. Verwenden Sie 5 mL des unclotted Blutes aliquoten (Schritt 1.4) bei Raumtemperatur 1 Stunde aufbewahrt und Zentrifugieren sie 1.500 x g für 30 min, das Serum im Überstand zu trennen.
  2. Führen Sie IIF und ELISA in dreifacher Ausfertigung 1: 100 Serum Verdünnungen, wie zuvor beschrieben28. T. Trypanosoma und L. Braziliensis Antigene zu erkennen
  3. IIF
    1. Führen Sie die IIF-Assay in dreifacher Ausfertigung Serum Verdünnungen von 109 Versuchspersonen Proben dreimal ein Jahr auseinander.
    2. Platz 5 µL Suspensionen von dem Formalin 1 % - behandelt T. Trypanosoma Epimastigotes oder L. Braziliensis Promastigotes auf Glas-Objektträger; lassen Sie die Parasiten über Nacht trocknen in eine Haube bei Raumtemperatur und speichern Sie der Objektträger bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.
    3. Platz 20 µL der Patienten Serum Verdünnungen auf Objektträger beschichtet mit 5 µL des Formalin getötet (10 Parasiten/µL) T. Trypanosoma Epimastigotes oder L. Braziliensis Promastigotes.
    4. Inkubieren Sie die Glas-Folie bedeckt mit einem Slip für 1 h in einer feuchten Kammer bei 37 ° C und dreimal mit PBS waschen.
    5. Inkubieren Sie der luftgetrocknete Objektträger mit einer 1:1,000 Verdünnung eines Kaninchen Fluorescein-markierten Antikörpers (Table of Materials), menschliche IgG für 1 h bei 37 ° C; Waschen und Trocknen der Folie.
    6. Montieren Sie die Folie mit einem Deckglas und unter einem UV-Licht-Mikroskop zu untersuchen.
      Hinweis: Eine positive Prüfung ist ein Apfelgrün T. Trypanosoma Epimastigote Silhouette, in dem Video gezeigt.
  4. ELISA
    1. Führen Sie ein ELISA um T. Trypanosoma und L. Braziliensis lösliche Antigene (1 µg/100 µL in 0.1 M Karbonat-Puffer, pH 9,6) auf beschichteten Mikrotestplatte Brunnen zu erkennen.
    2. Inkubieren Sie die Serum-Verdünnungen 1: 100 in dreifacher Ausfertigung beschichteten Vertiefungen für 2 h bei Raumtemperatur.
    3. Die Platten dreimal mit PBST waschen (PBS mit 0,5 % Tween-20), pH 7,4, Lösung vor dem Trocknen.
    4. Inkubieren Sie die Platten mit 50 µL einer 1:1,000 Verdünnung der Kaninchen Anti-Human-IgG-Antikörper für 90 min bei 37 ° c
    5. Waschen Sie die Platten dreimal mit PBST Lösung und bei Zimmertemperatur trocknen lassen.
    6. Inkubieren Sie die Platten mit 100 µL 1:1,000 Verdünnungen der alkalischen Phosphatase konjugiert Ziege Anti-Kaninchen IgG (Table of Materials) für 90 min bei 37 ° c
    7. Die Platten dreimal mit PBST waschen, fügen Sie das Substrat p-Nitro-Phenyl-Phosphat und warten auf die Farbentwicklung.
    8. Lesen Sie die ODs bei 630 nm in einem multimode-Platte-Reader.
    9. Führen Sie die dreifacher Verdünnungen des Testserums aus der Studienpopulation und Plotten der ODs Ermittlung die spezifischen Antikörper-Titer T. Trypanosoma .

6. Bewertung der Immuntoleranz

Hinweis: Ein Huhn-Modell-System wurde zur T. Trypanosoma Infektionen nach der ersten Woche der Embryonalentwicklung zu testen.

  1. Impfen Sie befruchteten Huhneier mit 100/10 µL T. Trypanosoma Trypomastigotes aus Gewebe Kulturmedium geerntet; mock Kontrolle Eier mit 10 T. Trypanosoma Trypomastigotes pro µL Kulturmedium zu impfen. Das Loch mit Klebeband abdichten.
  2. 21 Tage inkubieren Sie 20 T. Trypanosoma -infizierten Eiern und eine gleiche Anzahl von mock Kontrolle befruchteten Eier bei 37 ° C und 65 % Luftfeuchtigkeit.
  3. Halten Sie den Küken, dass Luke in den Inkubator für 24 h und danach, bei 32 ° C im Hauben mit Temperaturregelung für drei Wochen.
  4. Wachsen Sie die Küken geschlüpft von T. Trypanosoma -geimpft Eier und mock Kontrolle Eier zu Erwachsenen Stadium in einem positiven Luft Druck Raum bei 24 ° C, in einzelnen Käfigen in getrennte Gänge gelegt.
  5. Fordern Sie die Erwachsenen Küken dreimal im Alter von sechs Monaten mit 107 Formalin getötet Trypomastigotes injiziert subkutan, wöchentlich, nach dem Schema im Video.
  6. Zeichnen Sie Blut aus einer Armvene Flügel der Hühner schlüpfen aus den Eiern T. Trypanosoma -geimpft und von der simulierten Steuerung vier Wochen nach der letzten Impfung, das Serum zu erhalten.
  7. Das Huhn Serum verwenden, um die spezifischen erkennen T. Trypanosoma Antikörper durch IIF und ELISA wie in Schritt 5 des Protokolls beschrieben.

7. eine Infektion der Mäuse mit T. Trypanosoma von Chagas Patienten Sperma ejakuliert

  1. Verwenden Sie das Sperma ejakuliert von einem Erwachsenen PCR + Chagas Krankheit Patienten (Schritt 1.5) und von einem Erwachsenen PCR - Chagas-freie Individuum.
  2. Verwenden Sie zwei Gruppen von 12 ein-Monat-alte BALB/c naive Mäuse in Hauben unter positiver Luftdruck bei 24 ° C gehalten und Essen Ad Libitumgefüttert.
  3. Die menschlichen Chagas-Positive Samen Aliquote (100 µL) in das Peritoneum und gleiche Mengen in die Scheide der Gruppe-A-Mäuse zu vermitteln.
  4. Die Kontrolle Chagas-freien Samen Aliquote (100 µL) in das Peritoneum und eine gleiche Menge in die Scheide der Gruppe-B-Mäuse zu vermitteln.
  5. Opfern Sie fünf Wochen nach der Sperma-Arbeiten der experimentellen Mäuse unter Narkose zu und die Gewebeschnitte nach Färbung mit Hämatoxylin-Eosin.
  6. Verwenden Sie Mikroskopie, um T. Trypanosoma Trypomastigotes und Amastigoten in Herz, Skelettmuskel und Fortpflanzungsorgane in Gruppen von Mäusen zu suchen.

8. Übertragung der T. Trypanosoma Infektion durch Geschlechtsverkehr

  1. Verwenden Sie 10 männliche und weibliche sechs Wochen alten BALB/c Mäusen in den Experimenten.
  2. Fünf männliche und fünf weibliche Mäuse intraperitoneal mit 1 x 105 T. Trypanosoma Trypomastigotes aus der Gewebekultur zu impfen.
  3. Die Mäuse zu züchten, bis zum Alter von drei Monaten: Gruppe ich durch fünf T. Trypanosoma entsteht-infizierten weiblichen Mäusen und fünf Steuern noninfected männlichen Kameraden; Gruppe II wird gebildet von fünf T. Trypanosoma -infizierten männlichen und fünf noninfected weiblichen Kumpels zu kontrollieren. Gruppe III wird durch fünf männliche und fünf weibliche Kontrolle naiv nicht infizierten Kameraden gebildet werden.
  4. Haus jedes Brutpaar in einem Käfig in einen Safe mit einer 5 mm-Raster und Lock-in-Tür platziert, die Flucht zu verhindern.
  5. Füttern Sie die Mäuse, Chow und Wasser ad libitum. Insgesamt 70 Entwöhnung Stammarten in Gruppen II und ich für mindestens sechs Wochen zu erhöhen.
  6. Blut durch Herz Punktion aus dem elterlichen (FO) und Nachkommen (F1) Mäuse in Narkose, die Mäuse zu opfern, und legt Abschnitte des Herz, Skelettmuskel und Fortpflanzungsorgane für pathologische Analyse.

9. Beurteilung der immun-Privileg

  1. T. TrypanosomaGewebe einzuholen-infiziert und naive Mäuse (Schritt 8,6) zu kontrollieren und Paraffin-eingebetteten Proben in 4 µm dicke Abschnitte geschnitten.
  2. Das Paraffin entfernen und die Abschnitte auf Objektträger mit einigen Änderungen von Xylol und abgestuften Waschungen mit 100 % bis 70 % Ethanol, 1 min. zu entwässern.
  3. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte mit 0,05 % Saponin einmal, gefolgt von drei wäscht von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur.
  4. Blockieren die Gewebeschnitte mit 5 % fettfreie Trockenmilch für 45 min. Wash Folien in 0,1 M PBST und inkubieren Sie die Abschnitte mit der Chagas Maus Anti-T. Trypanosoma Serum oder das nicht-infizierte Maus Kontrollserum bei einem 01:20 Verdünnung für 2 h.
  5. Waschen Sie die Folien für 5 min in PBST und trocken bei Raumtemperatur vor der Inkubation mit einem 1:1,000 Verdünnung der alkalischen Phosphatase konjugiert Kaninchen Anti-Maus IgG.
  6. Spülen Sie die Folien in PBST und fügen 100 µL 3,3' Diaminobenzidine für eine 5 min Inkubation, gefolgt von drei Waschungen mit PBST und Gegenfärbung mit Hämatoxylin Harris für 30 s.
  7. Waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 5 min in 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol für 1 min zu entwässern Sie und im gepufferten Glyzerin zu montieren.
  8. Prüfen Sie die Folien mit einem Lichtmikroskop Hellfeld und Foto-Aufnahmen mit einer Mikrokamera mit Software und einem Analysator-Programm.
  9. Das Immunsystem Privileg des Parasiten in Ermangelung von Entzündungsreaktionen in den reproduktiven Organen zu dokumentieren.

10 statistische Analysen

  1. Biomedizinischen bearbeiten verwenden für Sequenzanalysen, Achsen mit BLAST durchführen und bestimmen die E-Value statistische Signifikanz (p < 0,05).
  2. Führen Sie ein One-Way Varianzanalyse (ANOVA) und der Tukey-Test die OD-Mittel plus oder minus Standardabweichungen zu vergleichen.

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Representative Results

Diese Forschung, die nach dem Protokoll soll akute Fälle der Chagas-Krankheit durch klinische und parasitologischen Prüfungen zu erkennen. Venöse Blutproben wurden direkte mikroskopische Untersuchung und in-vitro-Kultur für Parasiten Wachstum ausgesetzt. Einundzwanzig akute Fälle der Chagas-Krankheit zeigten T. Trypanosoma im Blut. Die Forschungs-Protokoll gesichert die Isolation von T. Trypanosoma ECI1-ECI21 von akuten Chagas-Krankheit, und die DNA-Muster ausgestellt positiven DNA-Spuren in den Rest der Bevölkerung Studie: nDNA-PCR-Assays ergab die typischen Telomer-Wiederholsequenz mit den 188-nt-Bands sowie T. Trypanosoma Berenice Archetyp1vorhanden. Die Chagas-Fälle und ihre Familienangehörigen, die sich zur Teilnahme an der Studiums freiwillig wurden in vier Familien1gruppiert.

In dieser Familie Studie war T. Trypanosoma nDNA PCR verstärkt mit Primer1,23 geglüht, die spezifische Telomer-Sequenz aus jedem der 21 akuten Chagas Krankheit Fälle setzt. Diese T. Trypanosoma nDNA Amplifikate hybridisiert mit bestimmten radioaktiven Reihenfolge Sonde (Abbildung 2). die Klonierung und Sequenzierung ergab, dass der Amplifikate T. Trypanosoma 188-nt Telomer repeat Motiv umfasste. Die Besonderheit dieser Hybridisierung Verfahren zeigte sich in der negativen Kontrolle mit L. Braziliensis Promastigotes durchgeführt. Die Pathologie-Analyse bestätigt, dass die Hemoflagellates bei den akuten Chagas Krankheitpatienten wirklich virulent wurden T. Trypanosoma. Wir schlussfolgern, dass die T. Trypanosoma nDNA (188-bp) Band in den 21 akute gefunden Chagas Fällen (Abbildung 2) ist ein direkter Beweis für persistente Infektionen.

Sexuelle Übertragung von Trypanosoma Trypanosomen beim Menschen

Um das Verhältnis von T. Trypanosoma Infektionen zu bewerten, haben wir die Nukleinsäure-Test für hohe Empfindlichkeit der Parasit Fußabdrücke in der Familie Studie Bevölkerung1angewandt. In diesen PCR-Assays die Verstärkung-Produkte, die mit der bestimmten radioaktiven 188-nt-Sonde hybridisiert 76,1 % (83/109) der Prüflinge nDNA Bands gegründet; die Ergebnisse der Southern Hybridisierung der nDNA-PCR Verstärkung Produkte mit der bestimmten radioaktiven 188-nt-Sonde sind in Abbildung 3dargestellt. Darüber hinaus zeigte die Hybridisierungen der Parasit DNA in der Keimbahn der freiwilligen Familienmitglieder (Abbildung 4).

IIF wurde eingesetzt, um die ECI1 Phänotyp, ECI21 T. Trypanosoma Trypomastigotes mit humanem Serum IgG aus einer Chagas Krankheit Serumprobe Bank mit parasitologischen Demonstration von Protozoen im Blut und ein Fluorescein konjugierten Anti-Human IgG verwendet wurde . T. Trypanosoma Berenice war eine Positivkontrolle für die Chagas-Antikörper und die negative-Kontrolle der Promastigote seiner Familie relative L. Braziliensis. Abbildung 5 zeigt, dass die positive Apfelgrün Silhouette des Archetyps Berenice mit dem Wildtyp korreliert T. Trypanosoma Umschlag in dem Video gezeigt.

Die ELISA und IIF offenbart die spezifischen T. Trypanosoma Antikörper1,28 in 28,4 % (31/109) der Prüflinge. Die Ergebnisse des ELISA und IIF sowie aus der nDNA-PCR Amplifikate und südlichen Hybridisierungen sind in Abbildung 6dargestellt. Die Unterschiede zu den Ergebnissen der nDNA-PCR Fußabdrücke und aus der spezifischen Antikörper Assays in der Heredograms (Abbildung 7), Familie A, vier Themen dargestellt hatte positive nDNA undT. Trypanosoma Antikörpers Anti- und 11 hatten nur die positiven nDNA; fünf Männer hatte T. Trypanosoma im Sperma Ejakulat. Familie B mit 44 Personen, 11 hatten die spezifischen T. Trypanosoma Antikörper, 23 hatte der spezifischen Antikörper und die Parasiten nDNA; sieben Personen hatte T. Trypanosoma im Sperma Ejakulat. Familie C mit 29 Mitgliedern hatte der Antikörper und T. Trypanosoma nDNA in fünf Personen, und 17 hatte der Parasit nDNA allein; vier Männer hatten die nDNA-PCR-positiven im Sperma Ejakulat. Familie D unter 21 Themen 11 hatte der spezifischen Anti -T. Trypanosoma Antikörper und der nDNA-Footprint und neun hatte positive nDNA-PCR allein. Abbildung 3, Abbildung 6 und Abbildung 7 zeigen die breite Diskrepanzen zu den Ergebnissen, konsequent, die biologischen Proben aus familiären Themen in drei unabhängigen Experimenten laufen ein Jahr auseinander.

Tabelle 1 zeigt die quantitativen Unterschiede zwischen der IIF, ELISA und die nDNA-PCR-Assays in den Proben aus der Humanstudie Familien A-d Die Unterschiede zwischen der Verhältnisse der Antikörper Assays (28,4 %) und der positiven Nukleinsäure-Assays (76,1 %) sind statistisch signifikante (p < 0,005). Die Unterschiede zwischen den Gruppen von T. Trypanosoma -infizierten Menschen (III und IV) entfielen in diesen Familien 62,6 % (52/83) der Bevölkerung, zeigt einen positiven Nukleinsäure-Test allein. Die breite Diskrepanzen unter das Verhältnis der positiven nDNA Fußabdrücke und derjenigen der spezifischen T. Trypanosoma Antikörper durch die Experimente im Modellsystem Huhn erklärt wurden.

Immuntoleranz

Die Auswertung der Immunantworten durchgeführt in Gruppen von Hühnern angehoben, um die Erwachsenen Stadium in einzelnen Käfigen in getrennten Gängen mit naiven Kontrolle Hühner (A); Mock Kontrolle Hühner schlüpfen aus Eiern geimpft mit Kulturmedium (B); und Hühner aus T. Trypanosoma Trypomastigotes beimpft Eier (C)26geschlüpft. Die Erwachsene Hühner in Gruppen B und C dreimal, mit Formalin-getötet aufgefordert wurden T. Trypanosoma Trypomastigote Antigen, wöchentlich, wie im Video gezeigt. Der ELISA und der IIF-Assays wurden mit dem Serum gesammelt von Gruppe A, B und C Hühner einen Monat nach Herausforderung ausgeführt. Abbildung 8 zeigt das Fehlen von spezifischen Antikörper in Gruppe A und C Hühner, die scharf mit der spezifischen Antikörper-Produktion in der Gruppe B mit dem T. Trypanosoma Antigen immunisiert kontrastiert. Die Ergebnisse zeigten deutlich die Immune Toleranz in der Gruppe C aus T. Trypanosomageschlüpft-Eier geimpft.

Sexuelle Übertragung von Versuchen Sie es Panosoma Trypanosoma in einem Maus-Modell-System

Die Infektiosität von T. Trypanosoma aus einem Chagas Patienten Ejakulat, die in der PCR positiv getestet und es fehlte ihnen die spezifischen Antikörper, zeigte sich darüber hinaus durch Arbeiten von 100 µL des Samens in der Bauchhöhle des männlichen Mäusen und durch eine gleicher Menge an Sperma in die Scheide eingeflößt. Fünf Wochen später, die T. Trypanosoma Amastigote Nester erkannt wurden, in die Herzen und den Skelettmuskeln und Klumpen von Parasiten zu unterscheiden waren in das Lumen der Samenleiter und uterine Tube. Interessanterweise die zerstörerischen Entzündungsreaktionen nicht die Nester und Klumpen von T. Trypanosoma Amastigoten (Abbildung 9) umgeben.

Die Bewertung der sexuellen Übertragung von T. Trypanosoma Infektionen wurde weiter in zwei Gruppen von Mäusen intraperitoneal geimpft mit 1 x 105 T. Trypanosoma Berenice Trypomastigotes Formen1,30durchgeführt, 31. In der Versuchsgruppe I, 10 T. Trypanosoma -Männchen verpaart mit 10 naiv Kontrolle weiblichen Mäusen infiziert. In experimentellen Gruppe II infiziert 10 T. Trypanosoma -Weibchen verpaart mit 10 naiv Kontrolle Männchen. Abbildung 10 zeigt, dass die T. Trypanosoma-infizierten männliche Mäusen (A bis E) und der T. Trypanosoma -infizierten weibliche Mäusen (F-g) ergab 188 bp nDNA Bands (ungerade Zahlen). Nach Zucht erwarb die naiv-Mates (gerade Zahlen) leicht T. Trypanosoma nach einer eindeutigen sexuellen Begegnung mit einem Chagasic Kumpel. Ähnliches wiederholte Experimente unter identischen Bedingungen bestätigt, dass jede naive weiblichen oder männlichen Maus, die sexuell mit einem T. Trypanosoma verpaart-infizierten männlichen oder weiblichen flagellate Infektion erworben. Diese nDNA-positiv-Gründer (F0) erzeugte Nachkommen, die sie bis zum Alter von sechs Wochen angesprochen. Dann, der Test und die Kontrolle nicht infizierten Mäusen bled über Herz durchbohren wurden etwa 0,5 mL Blut zu sammeln. Die nDNA-PCR-Assays zeigten, dass die Gründer (F0) sexuell erworbenen Infektionen an den F1-Nachkommen übertragen wurden, dargestellt durch die 188 bp nDNA-Bands (Abbildung 11). Die F1-Nachkommen waren nDNA-positiv in 41 70 (58,6 %) Proben untersucht. Dieser Mäuse mit nDNA Bands suggestive vertikal erworbenen Infektionen, so wenig wie T. Trypanosoma Antikörper hatte 9 von 41 (22 %).

Die F1-Nachkommen-Mäuse wurden unter Narkose geopfert und Körpergewebe pathologischen und immun Peroxidase-Färbung Analysen unterzogen wurden. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abbildung 12dargestellt. Die Ergebnisse für die T. Trypanosoma Amastigoten wurden in den interstitiellen Zellen des Nebenhodens und in Goniablasts dokumentiert; Differenzierung in Trypomastigotes Amastigoten waren in das Lumen der seminiferous Röhrchen in der Abwesenheit von Entzündungsreaktionen.

Figure 1
Abbildung 1 . Trypanosomen Trypanosoma Infektion in den seminiferous Röhrchen eines jungen, die an akuten Chagas-Krankheit gestorben . Abb. von Arzt Teixeira Datei, 197018. Die T. Trypanosoma Formen sind in Goniablasts und Klumpen von Amastigoten und kostenlose Trypomastigotes (Pfeile) sind in das Lumen von seminiferous Röhrchen ohne entzündliche Infiltrate1. Hämatoxylin-Eosin Flecken. Bar, 20 µm. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von dem Verleger und Autoren1,19.

Figure 2
Abbildung 2 . Die Grundfläche des Trypanosomen Trypanosoma von akuten Chagas-Krankheit. T. Trypanosoma nDNA-PCR Verstärkung Produkte gebildet 188-nt-Bänder mit einer bestimmten radioaktiven 188-nt-Sonde. TC, T. Trypanosoma; NC, negativ-Kontrolle. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Southern Blot-Analyse der Trypanosomen Trypanosoma Infektionen bei Probanden der Studie am Menschen Familien. Familie A - alle 15 Probanden zeigte die spezifischen nDNA-PCR 188-nt-Bands. Familie B gegründet insgesamt 35 43 Themen (81,4 %) die spezifischen nDNA-Bands. Familie C gegründet unter 29 Mitglieder, 22 (75,8 %) die nDNA-Bands. Familie D hatte 11 von 21 Themen (52,4 %) die nDNA-Bands. T. Trypanosoma-spezifische nDNA Bands wurden durch Klonierung und Sequenzierung bestätigt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Die aktive Trypanosomen Trypanosoma Infektionen in der Samenflüssigkeit von Familie freiwillige Studie ejakulieren. Die Infektionen in Chagas Patienten ejakuliert identifiziert durch die nDNA-PCR-188-bp-Bänder. TC, T. Trypanosoma Positivkontrolle. NC, L. Braziliensis Negativkontrolle. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Der Phänotyp Trypanosomen Trypanosoma mit der Chagas-Krankheitpatienten Serum Antikörper. T. Trypanosoma identifiziert mit dem Chagas-Serum-IgG-Antikörper, der der Parasit Trypomastigote erkennt mit einem FITC-markierten monoklonalen Ab Anti-Human IgG behandelt. Die Anti-Trypanosoma T. Ab erkennt Leishmania Braziliensis Promastigotes nicht. Die Kartenausschnitte zeigen die Negativkontrollen. Bars, 20 µm. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 6
Abbildung 6 . Grafische Darstellung des ELISAs und nDNA-PCR-Assays in der Familie Studienpopulation. Gruppe I (n = 10) und der Gruppe II (n = 20) waren die negativ-Kontrolle und der Positivkontrolle Sera, von T. Trypanosoma Infektionen mit parasitologischen Demonstration. Gruppe III (n = 31) Proben aus familiären Themen mit spezifischen Antikörpern und 188 bp nDNA Bands, T. Trypanosomaenthalten. Gruppe IV (n = 52) umfasste Stichprobe von Patienten mit T. Trypanosoma Infektionen durch die nDNA-PCR-188-nt-Amplifikate in Ermangelung der spezifischen Antikörper. Gruppe V (n = 26) wurden negative Proben bestehend aus infektionsfreien Menschen in der Familie Studie. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 . Die Heredograms und Kartierung von der Trypanosomen Trypanosoma- Familie Bevölkerung infiziert. Die Abbildung zeigt die Unterschiede zwischen den die Verhältnisse der Anti-T. Trypanosoma Antikörper und derjenigen der nDNA-PCR-Assays. Offenes Quadrat und Kreis, negative männlich und weiblich. Rote Quadrate und Kreise, positive Anti -T. Trypanosoma Antikörper und nDNA-PCR. Schwarze Quadrate und Kreise, positive nDNA-PCR allein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 8
Abbildung 8 . Die Immuntoleranz bei Hühnern aus geschlüpft Trypanosomen Trypanosoma- Eier beimpft. (A) Preimmune Antikörper-Profil in den Hühnern mock Kontrolle (n = 10). (B) die spezifischen Antikörper-Reaktion in der naiv-Steuerung Hühner vor der Herausforderung, die T. Trypanosoma Antigen (n = 20). (C) das Fehlen einer spezifischen Immunantwort bei Hühnern aus T. Trypanosomageschlüpft-Eier nach Herausforderung mit dem T. Trypanosoma Antigen geimpft (n = 20). Die optische Dichteunterschied zwischen A und C (024 ± 0,17) in Richtung B (0,85 ± 0,6) ist statistisch signifikant (p < 0,05). Diese Zahl wurde von Referenz26 geändert und ist Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor.

Figure 9
Abbildung 9 . Die infektiöse Trypanosomen Trypanosoma in menschlichen ejakuliert übersetzt in eine aktive murinen Infektion. Aliquote Chagas Patienten Ejakulate waren in der Bauchhöhle oder in die Scheide der Mäuse eingeflößt. Die Mäuse wurden drei Wochen nach Instillation geopfert. Oberen Lane, T. Trypanosoma Amastigoten Nester im Herzen (links) und in der Skelettmuskulatur (rechts). Untere Gasse, T. Trypanosoma Amastigote Nester in den Samenleiter (links) und in der Gebärmutter Röhre (rechts). Der Einsatz zeigt einen trennenden Amastigote (Kreis). Beachten Sie das Fehlen von entzündlichen Infiltraten in den Gewebeschnitten. Hämatoxylin-Eosin Flecken. Bars: oben und unten links, 20 µm; unten rechts, 10 µm. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10 . Die sexuelle Übertragung von Trypanosomen Trypanosoma Infektionen in der Maus Modell System durch Geschlechtsverkehr. Die Übertragung der T. Trypanosoma Infektionen von Chagasic zu naiv Verknüpfungen gezeigt von den spezifischen nDNA 188 bp Bands in der südlichen Hybridisierungen offenbart. Oberen Lane) Prebreeding Profile der PCR-Amplifikationsprodukte von T. Trypanosoma -infizierten Mäusen und der naive Mäuse. Die ungeraden Zahlen zeigen die T. Trypanosoma-infizierten männlichen A bis E und weibliche ich F Maus Proben. Die geraden Zahlen sind naiv weiblich (2-10) und männlich (12-20) Mäuse. Untere Gasse, nach Zuchtschau, die Profile, die sogar Mäuse 2 bis 20 erworben T. Trypanosoma Infektionen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von der Verleger und der Autor1,30. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 11
Abbildung 11 . Die Trypanosomen Trypanosoma Infektion ist vertikal aus der elterlichen F0-Chagasic für die F1-Nachkommen-Mäuse übertragen. Der Chagasic Elternteil übertragen T. Trypanosoma Infektionen durch einen einzigen Zucht-Begegnung. T. Trypanosoma-infizierten Frauen waren auf naive Männer A-E gepaart, und die naiv-Weibchen waren verbunden mit der T. Trypanosoma -infizierte Männer F-J. Nach Zucht, alle Gründer (F0) zeigte positive Protozoon nDNA-PCR-188-bp-Band. Southern blotting offenbart die spezifischen nDNA-Band nach Hybridisierung mit der radioaktiven 188-nt-Sonde in den meisten F1-Würfen. NC, L. Braziliensis negativ-Kontrolle; TC, T. Trypanosoma Positivkontrolle. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Verlag und Autor1,31. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 12
Abbildung 12 . Die Histopathologie dokumentiert Trypanosomen Trypanosoma sexuell übertragbare von F0, F1-nachkommen und Immune Toleranz in Ermangelung einer entzündlichen Reaktion. Die Abschnitte zeigen Wachstum der T. Trypanosoma Formen in die Nebenhoden, Goniablasts und die seminiferous Röhrchen der F1-Mäuse. Die Mäuse wurden unter Narkose geopfert, und die immun Peroxidase-gefärbten Abschnitte wurden unter dem Mikroskop untersucht. Die Mikrofotos zeigen bräunliche immun Peroxidase-gefärbten T. Trypanosoma Amastigoten in die interstitielle Nebenhoden ()A) und Klumpen von Amastigoten Differenzierung in Trypomastigotes Schuppen in das Lumen der die seminiferous Röhrchen (B, C, e und F). Die Amastigote Nest in einem Goniablast (D) gesehen. Die Positivkontrolle Maus seminiferous Röhrchen normale Histologie (E). Beachten Sie das Fehlen von entzündlichen Infiltraten in den Hoden der F1-Mäuse zeigen jede Menge die Chagas-Parasiten. Giemsa Fleck. Bars: A, B, C und E, 20 µm; D und F, 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1. Die Diskrepanzen zwischen der Verhältnisse des positiven IIF und ELISA Prüfungen und derjenigen nDNA-PCR-Assays in den Proben gesammelt aus den Humanstudie Familien A-zu-D *

Gruppen ** ELISA: Serum Anti-Trypanosoma T. Ab (%) T. Trypanosoma nDNA-PCR (%)
-Control Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - Control Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-frei Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Ergebnisse von drei unabhängige ELISA und nDNA-PCR-Assays in Proben in drei verschiedenen Anlässen im Jahre 1, 2 und 3 laufen. [1]. die Verstärkung der 188-nt T. Trypanosoma DNA wiederholen durch Klonierung und Sequenzierung bestätigt.
** Die Unterschiede zwischen den negativen (Gruppen I und V) und die positive Themen (Gruppen III und IV) sind statistisch signifikante (p < 0,05).
ᵟ die Unterschiede zwischen den Gruppen III und IV erklärt sich durch die Immuntoleranz in Ermangelung der T. Trypanosoma Antikörper im 62,6 % (52/83) der PCR-positiven Patienten erreicht.

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Discussion

Hierin, diskutieren wir eine Familien-basierte Forschungsprotokoll, das beantwortet die Frage, ob menschliche Chagas-Krankheit aus sexuell übertragbare Wiederkäuer T. Trypanosoma stammt Infektionen. Frühe Studien konnte nicht die sexuelle Übertragung von T. Trypanosoma Infektionen, wahrscheinlich nachweisen, weil die verfügbaren Daten und Informationen über die Chagas-Krankheit separat von den einzelnen3,4gewonnen wurden, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Die Erkenntnis von T. Trypanosoma in seminiferous Röhrchen eines jungen (Abbildung 1) war der Funke, der klinischen und epidemiologischen Untersuchung angespornt. Nach mehreren Jahrzehnten denkbar wenn Familie studieren Ansätze und Technologien, die in diesem Forschungs-Protokoll beschrieben zur Verfügung standen, T. Trypanosoma Lebenszyklusphasen erschien in der menschlichen Ejakulats1,19.

Die direkte parasitologische Demonstration der Protozoen in 21 Fällen in akuten Chagas Krankheit war entscheidend für die nDNA-PCR Verstärkung Produkte validieren die Banden in Proben aus allen Fächern, die akut infizierte T. Trypanosomagebildet. Dieser Point-of-Care-Labor-Marker bewertet die Ergebnisse der immunologischen und Nukleinsäure-Assays. Die langfristigen Chagas Krankheit Familie Grundlagenstudie, verbindet daher die Ergebnisse beim Menschen mit denen, die in Gruppen von Versuchstieren. Die Forschung nach dem Protokoll zum ersten Mal, dass T. Trypanosoma Infektionen werden sexuell übertragen, in der Menschen1.

Die breitere Unterschied zwischen Kennzahlen aus der Parasit-spezifischen Antikörper Assays und jenen aus der Nukleinsäure-Tests zeigt, dass die Mehrheit der nDNA Fußabdrücke aus sexuell übertragbare Fälle in Ermangelung von spezifischen anti- Trypanosoma T. Antikörper. So war die sexuelle Übertragung von T. Trypanosoma in die Familienmitglieder ausstellen positive nDNA in Ermangelung spezifischer IgG-Antikörper durch Immuntoleranz.

Immuntoleranz zeigte sich in ein Huhn Modellsystem refraktär gegenüber T. Trypanosoma Infektionen nach der ersten Woche des Embryos Wachstum1,25,26,32,33, 34. Danach das unreife Immunsystem Unfähigkeit, den Parasiten zu erkennen, wie eine ausländische Komponente des Körpers das Huhn späten Reife Immunsystem Toleranz gegenüber T Trypanosoma. Angesichts dieser Ergebnisse ist Toleranz ein Naturphänomen1 infolge des Immunsystems Selbsterkenntnis und Wartung eigener Körper Komponenten unter physiologischen Bedingungen25,26, 32 , 33 , 34. die Verschiebung vom Zustand der Immuntoleranz zu Autoimmunerkrankungen Chagas Herzkrankheit kann daher Effektor Zelle Änderungen infolge T. Trypanosoma Kinetoplast (kDNA) Mutationen in den Wirt Genom1 zugeordnet werden ,2,14,23,25,26.

Die entscheidenden Schritte in der Forschungs-Protokoll beschreiben die wichtigsten Technik-Modifikation und Fehlerbehebung um sexuell übertragbare Chagas Parasiten1,14,23,25offenzulegen, 26: ich) Auswahl Studie Familien mit Fällen von akuten Chagas Krankheit35,36; Ii) isolieren von Wildtyp T. Trypanosoma aus dem Blut der akuten Fälle; Iii) herbeiführende DNA-Proben aus den Familien Teilnehmer Blut Geißeltierchen, Berenice T. Trypanosoma Archetyp, positiv zur Bank DNA-Proben und der negativen Kontrolle L. Braziliensis; iv) Leistung ordentlich technische Verfahren nachweisen, dass die Teilnehmer Geißeltierchen nDNA Fußabdruck identisch mit dem des Archetyps Berenice T. Trypanosoma und von diesen positiven Bank DNA-Proben ist; V) laufen unabhängig dreifacher nDNA Footprinting, T. Trypanosoma Infektionen in die Familienmitglieder auf drei Mal ein Jahr auseinander zu demonstrieren; vi) um sicherzustellen, dass die nDNA-PCR-Technik durchgeführt Behandlungsort Ergebnisse bestätigt ergibt durch Klonierung und Sequenzierung aller Amplifikate geglüht, die spezifischen Primer setzt, so konsequent zeigt T. Trypanosoma 188-nt Sequenz 1,25,28,29,30; Vii) mit qualitativ hochwertigen Marke Reagenzien um zu reproduzieren die Antikörpertiter noch in Serumproben gesammelt zu drei verschiedenen Zeitpunkten; Viii) offenbart die Familie Studienprotokoll bestehende live Infektion in den Keimzellen der Linie auf die Demonstration von T. Trypanosoma nDNA in Ermangelung der spezifischen Serum-Antikörper in Sperma ejakuliert von Chagas Parasiten infizierten gesammelt Personen1; Ix) der Perspektive ist, dass die Forschungsprotokoll entwickelt, die sexuell übertragbaren entwirren T. Trypanosoma Infektionen sollte offen legen, die autochthone Chagas-Krankheit auf fünf Kontinenten; X) der nDNA und die kDNA Footprints sichern die Diagnose der chronischen asymptomatisch Chagas-Krankheit im Menschen1,2; Xi) in Ermangelung der nDNA, die Mutationvon T. Trypanosoma kDNA Sequenz1,2,23,25,26 allein ist ein Labor-Marker für die Differentialdiagnose von idiopathische dilatative Kardiomyopathien23,25,37,38,39zu erreichen.

Darüber hinaus waren die virulenten T. Trypanosoma urkundlich Chagas Patienten ejakuliert in der Lage weit verbreitete Infektionen nach Instillation in die Maus Vagina und in die Bauchhöhle zu initiieren. Die Pathologie-Studie zeigte T. Trypanosoma Amastigote Nester in das Herz und Skelettmuskulatur sowie in den Samenleiter und uterine Rohr. Interessanterweise die Parasiten Nester nicht entzündliche Reaktionen provozieren, die reproduktiven Vitalfunktionen behindern würde. Das Fehlen von Entzündungsreaktionen rendert das immun Privileg Vitalkörper funktionale Strukturen40,41,42,43,44,45 und damit erklärt das ungehemmte Wachstum von T. Trypanosoma in der reproduktiven Organe.

Darüber hinaus erklärte der experimentellen Studien bei Chagasic Mäusen, die mit naiven Kumpels gezüchtet weiter die sexuelle Übertragung von T. Trypanosoma -Infektionen beim Menschen. Die infizierten Weibchen und Männchen übertragen T. Trypanosoma Infektionen, die nicht infizierten naiv Verknüpfungen während des Geschlechtsverkehrs und die Mehrheit ihre Würfe erworben T. Trypanosoma vertikal vom übergeordneten auf Nachkommen übertragen. In diesen Experimenten bezeichnet die erste Phase das Wachstum von T. Trypanosoma im Rohr und in der Gebärmutter sowie in seminiferous Röhrchen und Samenleiter, wo das immun-Privileg stattfand. Dann erfolgte sexueller Übertragung durch den parasitären Stadien in der Samenflüssigkeit oder in der uterinen Sekreten in die Scheide. Immun-Privileg40,41,42,43,44,45 ist ein Phänomen, das einige Organe (reproduktive System, Augen und Gehirn), Downregulate ermöglicht Entzündungsreaktionen und vermeiden Schäden an wichtigen, empfindliche und spezifische Funktionen40. Hormone-41 und mehrere Immunfaktoren Downregulate Makrophagen41,42,43, natürliche Killerzellen41, T-Lymphozyten und T-regulatorischen (Treg) Zellen, also Orchestrierung der Hemmung der eine Reihe von proinflammatorischen Zytokinen und immun-Privileg Trigger40,41,42,43,44,45.

Die sexuelle Übertragung von T. Trypanosoma Infektionen von Männchen und Weibchen zu naiv Partner zeigt, dass die Kontrolle der Chagas-Krankheit internationalen Solidarität erfordert. Die hier diskutierten Ergebnisse legen nahe, dass kreativer Forschung nötig ist. Die folgenden unmittelbaren Ziele sind erreichbar: ich) Hochdurchsatz-Plattformen für spezifische und hochsensiblen Nukleinsäure-Tests, um eine genaue Diagnose, zur Vorbeugung von Infektionen, die durch Geschlechtsverkehr übertragen mit dem Ziel zu erreichen entwickeln Blut-Transfusionen und Organtransplantationen sowie klinische und epidemiologische Untersuchungen zur Ermittlung der Diagnose und der Verbreitung der Chagas-Krankheit zu erleichtern; ( Ii) eine multizentrische Medikament Entwicklungsprogramm, neue Medikamente für die Tilgung von T. Trypanosoma Infektionen zu erhalten zu fördern; und Iii) zu implementieren, eine geeignete Ausbildung, Information und Kommunikation Programm, das die Beteiligung von Schulen, Kirchen, soziale Organisationen und Institutionen des Gesundheitswesens, die Verbreitung der Chagas-Krankheit zu verhindern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir erkennen den Laboreinrichtungen und die kritischen Anmerkungen von Izabela Dourado, Carla Araujo und clevere Gomes und die technische Unterstützung von Bruno Dalago und Rafael Andrade. Wir sind verpflichtet, die Grundlage für die Zuführung der Wissenschaft (FAPDF), The National Research Council, Ministerium für Wissenschaft und Technologie (CNPq/MCT) und die Agentur für Ausbildung Human Resources, Ministerium für Bildung (CAPES / ME), Brasilien, für die Unterstützung dieser Untersuchungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 143 Familie Studie, Trypanosomen Trypanosoma Sperma ejakuliert uterinen Sekretion Maus-Modellsystem vertikale Übertragung immun-Privileg Huhn Modellsystem Immuntoleranz Chagas-Krankheit.
Sexuelle Übertragung von amerikanischen Trypanosomen von Männchen und Weibchen zu Naive Mates
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Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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