Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Seksuell overføring av amerikanske Trypanosomes fra menn og kvinner til Naive Mates

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

Den Trypanosoma cruzi agenten for Chagas sykdom gir langvarig asymptomatisk infeksjoner som brått utvikler i klinisk anerkjent patologi. Følgende forskning protokollen beskriver en kort sikt familiebasert epidemiologisk studie for å avdekke T. cruzi infeksjon overføres seksuelt fra foreldre til avkom.

Abstract

Amerikansk trypanosomiasis som overføres til mennesker ved triatomine feil gjennom inntak av forurenset mat, blodoverføringer eller tilfeldighet i sykehus og forskningslaboratorier. I tillegg Trypanosoma cruzi infeksjon overføres congenitally fra chagasic mor til hennes avkom, men den mannlige partner bidrag til i livmoren forurensning er ukjent. Resultatene av reir og klumper av amastigotes og trypomastigotes i theca celler i eggstokkene, goniablasts og lumen av seminiferous tubules foreslår at T. cruzi infeksjoner overføres seksuelt. Forskning protokollen Her presenterer resultatene av en familie studien befolkningen viser parasitten kjernefysiske DNA diploide blod mononukleære celler og haploid kjønnscellene med menneskelige emner. Dermed bekreftet tre uavhengige biologiske prøver samlet ett år fra hverandre at T. cruzi infeksjoner seksuelt overføres til avkom. Interessant, spesifikke T. cruzi antistoff var fraværende i fleste familiens avkom som kjede immun toleranse parasitten antigen. Immun toleranse ble demonstrert i kylling ildfaste til T. cruzi etter den første uken av embryonale vekst, og ungene klekkes fra eggene flagellate-inokulert klarte ikke å produsere spesifikke antistoffer. Videre ejaculates instillasjon av menneskelig sæd intraperitoneally eller inn i skjeden naiv mus gitt T. cruzi amastigotes i bitestikkel, seminiferous tubule, vas deferens og livmor rør med et fravær av inflammatoriske reaksjoner i immun privilegerte organene for reproduksjon. Oppdrett av T. cruzi-infiserte mannlige og kvinnelige mus med naiv kameratene resulterte i oppkjøpet av infeksjoner, som ble senere overført til avkommet. Derfor som et robust utdanning, informasjon og kommunikasjon program som innebærer befolkningen og sosiale organisasjoner nødvendig for å hindre Chagas sykdom.

Introduction

Protozoan parasitten Trypanosoma cruzi tilhører familien Trypanosomatidae gjennomgår trypomastigote og amastigote livssyklus stadier i pattedyr verter og finnes som epimastigotes i insekt-vektoren (Reduviid: Triatominae) gut og axenic kultur. I de siste tiårene, har flere studier vist tilstedeværelsen av Chagas sykdom i land på fire kontinenter vurdert triatomine feil ledig1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; spredning av amerikansk trypanosomes først ble tilskrevet latinamerikanske innvandrere til den nordlige halvkulen, men muligheten for at noen er autochtonous tilfeller av Chagas sykdom kan ikke nektes3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. bare gjenkjennelig endogene kilden T. cruzi overføring har blitt tilskrevet chagasic mors overføring av parasitten til avkom i ca 10% av svangerskap15; den mannlige partner bidrag til i livmoren infeksjoner gjennom ejakulerer sæd forblitt ukjent.

Over ett århundre siden, etterforskere16,17 observert intracellulær T. cruzi amastigotes i theca celler i eggstokkene og spiren linje cellene i testiklene av akutte tilfellene av Chagas sykdom. Reir og klumper av T. cruzi trypomastigotes og amastigotes i theca celler i eggstokkene, goniablasts og lumen av seminiferous tubules (figur 1) alvorlig akutt Chagas sykdom tilfeller utvikle immun privilegier i organer reproduksjon i fravær av inflammatoriske infiltrerer18,19. I de siste tiårene, har noen eksperimentelle studier vist reir av de runde amastigote T. cruzi i seminiferous tubule, bitestikkel og vas deferens så vel som i livmoren, rør og eggstokk theca celler av akutt infiserte mus 1,20,21,22. Videre i familien studier som dokumenterer overføring av protozoan Mitokondrielt DNA fra foreldrenes Chagas pasienter til sine etterkommere, T. cruzi kjernefysiske DNA (nDNA) ble bekreftet i menneskelig haploid bakterie linje celler23, og parasitten livssyklus etapper ble observert i ejakulerer chagasic mus24. Disse funnene er med rapporter om immun toleranse av avkommet T. cruzi -infiserte verter i fravær av spesifikt antistoff1,25,26. I tillegg epidemiologisk rapportene som foreslo spredning av endemisk Chagas sykdom til andre kontinenter3,4,5,6,7,8 ,,9,,10,,11,,12,,13 støttes av eksperimentelle studier viser at Chagas sykdom kan overføres seksuelt1 . Nåværende etterforskningen presenterer en epidemiologiske familie studie protokoll og viser at T. cruzi infeksjon overføres ved samleie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humant og dyr forskning komiteer av fakultet på Universitetet i Brasilia godkjent alle prosedyrer med mennesker og forsøksdyr, henholdsvis i forskning protokoller 2500.167567 og 10411/2011. Etikk i den offentlige Foundation sykehus Gaspar Vianna (protokollen nº 054/2009 og CONEP 11163/2009) godkjent skjemaene gratis samtykke for feltet studien, med utvidelse til departementet av helse National Commission på menneskelig forskning (CONEP 2585/04). Protokollen ble justert for å vurdere T. cruzi DNA diploide blod mononukleære celler og haploid gameter av sæd ejakulerer. I forsøksdyr mottatt Human omsorg; mus, utsatt for hjertet punktering før offer, var under anesthesia.

1. rekruttering av menneskelig deltakere

  1. Kontroller at forskningen lag deltar i et helse System Chagas sykdom Program å levere helsetjenester Chagas pasienter.
  2. Rekruttere menneskelige deltakere fra familier i programmet, vises minst ett tilfelle med feber, ubehag, hodepine, takykardi og ødem, de viktigste kliniske symptomene på akutte Chagas sykdom14.
  3. Levere helsetjenester til folket i studien familier for en periode på fem år.
  4. Få 15 mL venøst blod fra deltagerne på undersøkelsen ved tre anledninger ett år fra hverandre, dele prøven i tre 5 mL dele og lagre dem i kjøleskapet i 4 ° C.
  5. Samle 2 mL av sæd ejakulerer fra voksne frivillige familiemedlemmer og fortsett som beskrevet i trinn 3.3.

2. fremveksten av parasitter

  1. Bruker aliquot fra trinn 1.4, bland blodet med 5 enheter av anticlotting natrium heparin; gjøre en skråning kultur ved inoculation blod fra familien deltakere med diagnose av akutt Chagas sykdom.
    1. Vaksinere 5 mL unclotted menneskelig blod til en 50 mL skrukork tube blod-agar skrå pluss 5 mL av leveren infusjon-tryptose medium (LIT), og ruge prøven i en shaker ved 27 ° C for 3 måneder.
    2. Plasser 100 µL av supernatant medium på glass lysbilder, dekk med slips og søk etter blod T. cruzi epimastigotes under mikroskopet, fire uker.
    3. Høste epimastigote isolert i nedbryting av axenic LIT medium ved 27 ° C; vask cellene i PBS pH 7.4, sentrifuge 1000 x g for 10 min; fortynn epimastigotes i pellet i 5 mL av Dulbeccos endret viktig medium (DMEM).
    4. Vaksinere confluent L6 muskel celle kultur flasker med 1 x 106 ECI1-til-ECI21 T. cruzi epimastigote isolerer.
    5. Vokse T. cruzi ECI1 til ECI21 og Berenike arketypen trypomastigotes i L6 muskel cellekulturer i 75 mL kultur flasker.
    6. Mate celler med 15 mL DMEM ved pH 7.4 supplert med 5% fosterets bovin serum, 100 IU/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 250 nM L-glutamin og 5% CO2 på 37 ° C1.
    7. Bruk positiv kontrollen T. cruzi Berenike trypomastigotes til fenotypen ECI1-til-ECI21 isolert fra vev kultur, som beskrevet i trinn 5.2.
    8. Vokse kontrollen negative Leishmania braziliensis27 i DMEM med 20% fosterets bovin serum bare, og bruke parasitten promastigotes som en negativ kontroll.
    9. Bruke 1 x 106 T. cruzi ECI1 til ECI21 trypomastigotes i nedbryting fra cellen kulturen for å infisere mus.
    10. Søk etter T. cruzi trypomastigotes i halen blodet etter den første uken av infeksjonen.
    11. Søk reder av amastigotes i hematoxylin-eosin farget deler av hjerte, skjelettlidelser muskel og reproduktive organer i infiserte mus, en måned senere.

3. DNA utvinning og PCR analyser

  1. Plasser 5 mL blod (trinn 1.4) aliquot i et sterilt EDTA-rør, og utføre tetthet gradert sentrifugering for 45 min 3000 x g. Bruke en pipette å høste de mononukleære cellene fra hvitaktig fasen over de røde cellene, vaske hvit cellene to ganger i 5 mL av PBS, pH 7.4, med sentrifugering i 10 min 1500 x g i en annen 15 mL tube, og bruke cellene for DNA utvinning.
  2. Ekstra DNA fra ECI-1 å ECI-21 T. cruzi, fra positiv kontrollen Berenike T. cruzi, fra kontrollen negative L. braziliensis (trinn 2.1.8), og fra test blod mononukleære celler av 109 menneskeslekten studere fag1 , 27 , 28.
  3. Fortynne 2 mL av sæd prøvene fikk i trinn 1,5 i DMEM (1:4, v/v); Inkuber for 45 min på 5% CO2 og 37 ° C, gjenopprette spermatozoa fra nedbryting etter sentrifugering i 5 min på 13000 x gog ekstra haploid DNA23.
  4. Sted 1 mL av cellene i utvinning buffer (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, 1% SDS, 0,04% proteinasen-K og 1% dithiothreitol), og bland løsningene ved inversjon og riste.
    1. Sentrifuge løsninger for 10 min på 13.000 x g og 25 ° C, og overføre tyktflytende nedbryting til en spin-kolonne.
    2. Sentrifuge kolonnen spinn for 1 min 10 000 x g og kast eluate; legge 500 µL bindende buffer til kolonnen spinn (Tabell for materiale), sentrifuge det for 1 min 12 000 x gog forkaste eluate.
    3. Legge til 600 µL vaske bufferen i kolonnen spinn sentrifuge det for 1 min 12 000 x gog forkaste eluate.
    4. Gjenta dette trinnet to ganger, og overføre kolonnen spin til en bakteriefri 1.5 mL mikro sentrifuge rør.
    5. Legge 100 µL av TE buffer, ruge røret ved romtemperatur i 2 minutter, og deretter virvel røret for 1 min 12 000 x g. Bufferen i microcentrifuge tube inneholder DNA.
    6. Måle DNA konsentrasjoner av kjører dele på en 0,8% agarose gel og lese absorbansen på 260 nm med et spektrofotometer. Lagre DNA-prøver på 20 ° C før bruk i PCR-analyse.
  5. Bruk T. cruzi Tcz1/2 primere herdet til bestemte 188-nt bestemt telomere sekvensen sonde29 og kjøre PCR med DNA fra familien studien fag blod og sperm, fra kontrollen Berenike T. cruzi positive og den L. braziliensis negativ kontroll.
    1. Forbered PCR-blanding med 10 ng mal DNA, 0.4 µM i hvert primere, 2 U Taq DNA polymerase, 0,2 µM dNTPs og 15 µM MgCl2 i en 25 µL siste volum.
    2. Starte programmet DNA amplifikasjon 94 ° c for 30 s denature malen, og kjølig prøvene til 55 ° C for 30 s. Deretter ruge prøvene på 94 ° C i 90 s å forlenge glødet primerne. Returnere temperaturen 94 ° c for 30 å starte neste syklusen og ruge prøvene en ytterligere 3 minutter på 72 ° C. På slutten av 32nd syklusen, kule prøvene i 10 min ved romtemperatur, og lagre dem i kjøleskapet i 4 ° C29.
    3. Forsterke en T. cruzi DNA telomere repetisjonssekvensen herdet til Tcz1/2 primere på både ekstremiteter.
    4. Analysere forsterkning produktene på en 1,3% agarose gel og observere de 188-nt DNA bandene på en UV-illuminator.

4. sørlige hybridisering

Merk: Sørlige hybridisering ble brukt til å forkaste det meste av den falske positive PCR-amplicons i agarose gel.

  1. Utsett PCR forsterkning produktene fra infisert kontroller fra Chagas tilfelle positiv kontroller fra 109 test prøver av diploide DNA og haploid DNA av 21 familie deltagerne til sørlige hybridizations.
  2. Ansette T. cruzi 188-nt DNA-spesifikke telomere sekvens sonden herdet til Tcz1/2 primerne vist; merke sonde med [α -32P] 2-deoxyadenosine trifosfat (dATP) bruker en tilfeldig primer merking kit og analysere forsterkning produktene på en 1,3% agarose gel på 60 V overnatting på 4 ° C.
  3. Overføre gel til en positivt ladet nylon membran med metoden kapillær over natten.
  4. Hybridize DNA bandene overført til nylon membranen med radiolabeled 188-nt sonde, som binder EcoR1 oppsummeringer av genomisk DNA i 25 µL enzym-spesifikke bufferstørrelsen for variabel perioder.
  5. Vask membranen to ganger i 15 min på 65 ° C med 2 x SSC og 0,1% SDS.
  6. Utsett X-ray filmer nylon membranen og autoradiograph band på membranen i en uke.
  7. Vokse kloner valgt fra PCR og sørlige hybridisering med T. cruzi PCR forsterkning produkter, som er hybridiserte med bestemte radiolabeled DNA sonde.
  8. Kommersielt sekvens kloner med Tcz1/2 primerne satt glødet til T. cruzi -spesifikke telomere fotavtrykk2,23.

5. immunologiske analyser

Merk: Den sensitivitet og spesifisitet av den indirekte immunofluorescence (IIF) og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) ble vurdert i serum fra seks Chagas pasienter med påviselig parasitemia og seks Chagas-fri, deidentified serum banken prøver. Av analyser gjennomført med dobbel serum fortynninger i PBS, pH 7.4, avslørte at IIF på 1: 100 fortynninger og de ELISA optisk tetthet (ODs) på 0.150 og over skilt positive fra de negative resultatene.

  1. Bruk 5 mL unclotted blod aliquot (trinn 1.4) holdt ved romtemperatur 1t, og sentrifuge det 1500 x g i 30 minutter til Skill serum i nedbryting.
  2. Utføre IIF og ELISA i tre eksemplarer 1: 100 serum fortynninger å oppdage de T. cruzi og L. braziliensis antigener som beskrevet tidligere28.
  3. IIF
    1. Gjennomføre IIF analysen i tre eksemplarer serum fortynninger av 109 studien fag prøver innhentet ved tre anledninger ett år fra hverandre.
    2. Plasser 5 µL suspensjoner av formalin 1% - behandlet T. cruzi epimastigotes eller L. braziliensis promastigotes på glass lysbilder. La parasitter tørr overnatting i hette i romtemperatur og lagre glass lysbilder på 20 ° C før bruk.
    3. Sted 20 µL av pasientens serum fortynninger på glass lysbilder belagt med 5 µL av formalin-drept (10 parasitter/µL) T. cruzi epimastigotes eller L. braziliensis promastigotes.
    4. Inkuber av objektglass dekket med en slip 1t i et fuktig kammer på 37 ° C og vask thrice med PBS.
    5. Inkuber av Air-tørket objektglass med en 1:1,000 fortynning av et fluorescein-merket kanin antistoff (Table of Materials) til menneskelig IgG 1t på 37 ° C; vask og tørk lysbildet.
    6. Montere lysbildet med en cover slip og undersøke den under et UV lys mikroskop.
      Merk: En positiv eksamen er en apple-grønne T. cruzi epimastigote silhuett, vist i videoen.
  4. ELISA
    1. Kjøre en ELISA å oppdage T. cruzi og L. braziliensis løselig antigener (1 µg/100 µL inne 0.1 M karbonat buffer, pH 9.6) på belagt microplate brønner.
    2. Inkuber 1: 100 serum fortynninger i tre eksemplarer belagt brønner for 2 timer ved romtemperatur.
    3. Vask platene thrice med PBST (PBS med 0,5% Tween-20), pH 7.4, løsning før tørking.
    4. Inkuber platene med 50 µL av en 1:1,000 fortynning av kanin anti-IgG-antistoffer for 90 min på 37 ° C.
    5. Vask platene tre ganger med PBST løsning og la dem tørke i romtemperatur.
    6. Inkuber platene med 100 µL av 1:1,000 fortynninger av alkalisk fosfatase-konjugerte geit anti-kanin IgG (Tabell for materiale) i 90 minutter på 37 ° C.
    7. Vask platene thrice med PBST, Legg substrat p-nitro fenyl fosfat, og vente på farge utvikling.
    8. Lese ODs på 630 nm i en multimode plate leser.
    9. Kjøre de tre eksemplarer fortynninger av testen serum fra studien befolkningen og plotte ODs for å identifisere spesifikt T. cruzi antistoff titers.

6. vurderinger av immun toleranse

Merk: En kylling modellsystem ble brukt til å teste T. cruzi infeksjoner etter den første uken av embryo utvikling.

  1. Vaksinere kylling fruktbare egg med 100/10 µL T. cruzi trypomastigotes høstet fra vev kultur medium; vaksinere narr kontroll egg med 10 T. cruzi trypomastigotes per µL kultur medium. Tette hullet med tape.
  2. Inkuber 20 T. cruzi -infiserte egg og av uekte kontroll fruktbare egg ved 37 ° C og 65% fuktighet i 21 dager.
  3. Hold ungene luke i inkubator for 24 timer, og deretter på 32 ° C i hetter med temperaturkontroll for tre uker.
  4. Vokse ungene klekkes fra T. cruzi -inokulert egg og narr kontroll egg til det voksne stadiet i en positiv luften trykk rom på 24 ° C, i individuelle bur i separate midtganger.
  5. Utfordre alle voksen unger tre ganger på seks måneders alder med 107 formalin-drepte trypomastigotes injisert subcutaneously, ukentlig, i henhold til ordningen i videoen.
  6. Trekke blod fra en vinge åre kyllinger klekket fra T. cruzi -inokulert egg og narr kontrollene fire uker etter siste immunisering hente serum.
  7. Bruke kylling serum til å finne spesifikt T. cruzi antistoff IIF og ELISA som beskrevet i trinn 5 i protokollen.

7. infeksjon av mus med T. cruzi fra Chagas pasienter sæd ejakulerer

  1. Bruk sæd ejakulerer fra en voksen PCR + Chagas sykdom pasient (trinn 1,5) og enkeltperson voksen PCR - Chagas-fri.
  2. Bruk to grupper av 12 ettall-måneden-gamle BALB/c naiv mus i hetter under positive lufttrykket på 24 ° C og matet mat ad libitum.
  3. Innpode menneskelige Chagas-positive sæd dele (100 µL) i peritoneum og like mye i vagina gruppe-en mus.
  4. Innpode kontroll Chagas-fri sæd dele (100 µL) peritoneum og like mye i vagina gruppe-B mus.
  5. Ofre eksperimentelle musene under narkose fem uker etter sæd instillations og motiv delene vev for flekker med hematoxylin-eosin.
  6. Bruk mikroskopi søke etter T. cruzi trypomastigotes og amastigotes i hjertet, skjelettlidelser muskel og reproduktive organer i grupper på mus.

8. overføring av den T. cruzi infeksjon av samleie

  1. Bruke 10 mannlige og kvinnelige seks-uke-gamle BALB/c mus i forsøkene.
  2. Vaksinere fem mann og fem kvinnelige mus intraperitoneally med 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes fra vev kultur.
  3. Rase mus til tre måneders alder: gruppe jeg vil bli dannet av fem T. cruzi-infiserte kvinner mus og fem kontroll noninfected mannlige kamerater; gruppe II vil være dannet av fem T. cruzi -infisert mannlige og fem kontroll noninfected kvinnelige kameratene. Gruppe III vil være dannet av fem mann og fem kvinnelige kontroll naiv infisert kameratene.
  4. Huset hver avl par i en bur plassert inne i en safe-boks med 5 mm rutenett og låsbare dør å hindre rømning.
  5. Mate musene chow og vann ad lib. Øke totalt 70 avvenning progenies i grupper II og i minst seks uker.
  6. Trekke blod av hjertet punktering fra foreldre (FO) og avkom (F1) mus under narkose, ofre mus og sende deler av hjerte, skjelettlidelser muskel og reproduktive organer for patologisk analyse.

9. vurdering av immun privilegium

  1. Få vev fra T. cruzi-infisert og naiv administrere mus (trinn 8.6), og skjær de parafin-innebygd eksemplene i 4 µm tykke snitt.
  2. Fjern parafinen og tørke delene på glass lysbilder med flere endringer av xylen og gradert vasker med 100% til 70% etanol for 1 min.
  3. Inkuber delene vev med 0,05% saponin gang, etterfulgt av tre destillert vann vasker ved romtemperatur.
  4. Blokkere delene vev med 5% nonfat pulverisert melk i 45 min. vask lysbildene i 0.1 M PBST og Inkuber delene med Chagas musen anti-T. cruzi serum eller kontroll infisert musen serum på en 1:20 fortynning 2 h.
  5. Vask lysbildene tre ganger i 5 min PBST og tørr ved romtemperatur før inkubasjon med en 1:1,000 fortynning av alkalisk fosfatase-konjugerte kanin anti-musen IgG.
  6. Skyll lysbildene i PBST og legge til 100 µL av 3,3' diaminobenzidine for en 5 min incubation, etterfulgt av tre vasker med PBST og counterstaining med Harris hematoxylin for 30 s.
  7. Vask lysbildene i destillert vann til 5 min, tørke dem i 70%, 80%, 90% og 100% etanol for 1 min, og monterer dem i bufret glyserin.
  8. Undersøk lysbildene med lyse-feltet lys mikroskop, og ta bilde bilder med et mikrokamera med programvaren og analyserer program.
  9. Dokumentere immun privilegiet av parasitten i fravær av inflammatoriske reaksjoner i den reproduktive organer.

10. statistiske analyser

  1. Bruke biomedisinsk Rediger sekvens analyse, utføre justeringer med BLAST og finne den E-value statistiske betydningen (p < 0,05).
  2. Utføre en enveis analyse av varians (ANOVA) og den Tukey testen til å sammenligne OD betyr pluss eller minus standardavvik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne forskningen, utført i henhold til protokollen, rettet å oppdage akutte tilfellene av Chagas sykdom ved klinisk og parasitological eksamener. Venøse blodprøver ble utsatt for direkte mikroskopisk undersøkelse og i vitro kultur for parasitten vekst. Tjueen akutte tilfellene av Chagas sykdom viste T. cruzi i blodet. Forskning protokollen sikret isolering av T. cruzi ECI1-ECI21 fra akutt Chagas sykdom og DNA prøver utstilt positiv DNA fotspor i resten av studien befolkningen: nDNA PCR analyser gitt typisk telomere repetisjonssekvensen med 188-nt band tilstede samt T. cruzi Berenike arketypen1. Chagas tilfeller og deres familiemedlemmer som frivillig å delta i studien var gruppert i fire familier1.

I denne familien studien var T. cruzi nDNA PCR forsterket med primer sett1,23 herdet til bestemte telomere sekvensen fra hvert av de 21 akutte Chagas sykdom-tilfellene. Disse T. cruzi nDNA amplicons hybridiserte med bestemt radiolabeled sekvens sonden (figur 2); kloning og sekvensering avslørte at amplicons består T. cruzi 188-nt telomere gjenta motivet. Spesifisiteten av fremgangsmåtene hybridisering ble vist i kontrollen negative med L. braziliensis promastigotes. Patologi analysen validert at hemoflagellates i akutt Chagas sykdom pasienter var virkelig virulente T. cruzi. Vi konkludere med at T. cruzi nDNA (188-bp) bandet funnet i 21 akutt Chagas tilfeller (figur 2) er en direkte demonstrasjon av vedvarende infeksjoner.

Seksuell overføring av Trypanosoma cruzi hos mennesker

For å evaluere prosenter av T. cruzi infeksjoner, brukt vi nucleic acid test for høy følsomhet påvisning av parasitten fotavtrykk i familien studien befolkningen1. I disse PCR analyser, forsterkning produktene som hybridiserte med bestemte radiolabeled 188-nt sonden dannet nDNA band i 76,1% (83/109) for testprøvene; resultatene av sørlige blanding av nDNA PCR forsterkning produktene med bestemte 188-nt radiolabeled sonden er vist i Figur 3. Videre viste hybridizations parasitten DNA i bakterie celle linje av frivillige familiemedlemmer (Figur 4).

IIF var ansatt å fenotypen av ECI1 til ECI21 T. cruzi trypomastigotes med den humant serum IgG fra et Chagas sykdom serum bank utvalg med parasitological demonstrasjon av protozoan i blodet, og en fluorescein konjugert anti-menneskelige IgG ble brukt . T. cruzi Berenike var en positiv kontroll Chagas antistoffer, og kontrollen negative var promastigote av sin familie relative L. braziliensis. Figur 5 viser at positive apple-grønne silhuetten av Berenike arketypen korrelerer med vill-type T. cruzi konvolutt vist i videoen.

ELISA og IIF avslørte spesifikt T. cruzi antistoffer1,28 28.4% (31/109) for testprøvene. Resultatene av ELISA og IIF, samt de fra nDNA PCR amplicon og sørlige hybridizations, tegnes i figur 6. Avvik mellom resultatene av nDNA PCR-fotavtrykk og de fra spesifikke antistoffer analyser er avbildet i heredograms (figur 7), familie A, fire fag hadde positiv nDNA og anti -T. cruzi antistoffer og 11 hadde bare det positiv nDNA; fem menn hadde T. cruzi i sæd ejakulere. I familien B med 44 personer, 11 hadde spesifikt T. cruzi antistoffer og 23 hadde både spesifikke antistoffer og parasitten nDNA; syv personer hadde T. cruzi i sæd ejakulere. Familien C med 29 medlemmer hadde antistoffer og T. cruzi nDNA i fem personer, og 17 hadde parasitten nDNA alene; fire menn hadde nDNA PCR positive sæd ejakulere. I D-familien, blant 21 fag, 11 hadde bestemt anti -T. cruzi antistoffer og nDNA fotavtrykk, og ni hadde positiv nDNA PCR alene. Figur 3og figur 6 figur 7 skildrer de brede uoverensstemmelser resultatene, konsekvent i de biologiske prøvene fra familien fag i tre uavhengige eksperimenter kjøre ett år fra hverandre.

Tabell 1 viser kvantitative forskjellene mellom IIF og ELISA nDNA PCR-analyser i prøvene fra menneske studie familiene A til D. Avvik mellom prosenter av antistoff analyser (28.4%) og de av positiv nukleinsyre analyser (76,1%) er statistisk signifikant (p < 0.005). I disse familier utgjorde forskjellene blant grupper av T. cruzi -smittet mennesker (III og IV) 62,6% (52/83) av befolkningen, viser en positiv nucleic acid test alene. Bred avvik blant prosenter av positiv nDNA fotavtrykk og de av den spesifikke T. cruzi antistoff ble forklart av eksperimenter utført i kylling modell systemet.

Immun toleranse

Evalueringen av immunreaksjoner gjennomført i grupper av kyllinger hevet til det voksne stadiet i individuelle bur i separate aisles inneholder naiv kontroll kyllinger (A); mock kontroll kyllinger klekket fra egg inokulert med kultur medium (B); og kyllinger klekket T. cruzi trypomastigotes-inokulert egg (C)26. Voksen kyllinger i grupper B og C ble utfordret tre ganger med formalin-drepte T. cruzi trypomastigote antigen, ukentlige, som vist i videoen. ELISA og IIF analyser ble kjørt med serum samlet fra gruppe A, B og C kyllinger en måned etter utfordring. Figur 8 viser fraværet av spesifikke antistoffer i gruppe A og C kyllinger som kontrast kraftig med spesifikt antistoff produksjonen i gruppe B vaksineres T. cruzi antigen. Resultatene viste tydelig immun toleranse i gruppe C klekket fra T. cruzi-inokulert egg.

Seksuell overføring av Prøve panosoma cruzi i en mus modell

Videre infectivity av T. cruzi fra Chagas pasientens ejakulere, som testet positivt i PCR og manglet spesifikke antistoffer, ble påvist gjennom instillations av 100 µL av sæd inn i bukhulen mannlige mus og gjennom en lik mengde sæd innpodet i skjeden. Fem uker senere, T. cruzi amastigote reir ble oppdaget i hjerte og skjelettmuskulatur, og klumper av skille parasitter var tilstede i lumen vas deferens og livmor rør. Interessant, omgir de destruktive inflammatoriske reaksjonene ikke reir og klumper av T. cruzi amastigotes (figur 9).

Vurdering av seksuell overføring av T. cruzi -infeksjoner ble ytterligere gjennomført i to grupper av mus inokulert intraperitoneally med 1 x 105 T. cruzi Berenike trypomastigotes skjemaene1,30, 31. I forsøksgruppen jeg, 10 T. cruzi -infisert menn parret med 10 naiv kontroll kvinnelige mus. I forsøksgruppen II, 10 T. cruzi -infiserte kvinner parret med 10 naiv kontroll menn. Figur 10 viser at T. cruzi-infisert mannlige mus (til-AE) og den T. cruzi -infisert kvinnelige mus (F-g) gitt 188-bp nDNA band (oddetall). Etter formering, naiv kameratene (partall) lett kjøpt T. cruzi etter et unikt seksuelt møte med en chagasic kompis. Lignende gjenta eksperimenter utført under like bekreftet at hver naiv kvinne eller mann mus som seksuelt parret med en T. cruzi-infiserte mann eller kvinne ervervet flagellate infeksjonen. Disse nDNA-positive grunnleggerne (F0) generert avkom som de reist til en alder av seks uker. Deretter testen og kontrollen infisert mus var bled via hjertet punktering samle ca 0,5 mL blod. NDNA PCR-analyser viste at gründere (F0) seksuelt ervervet infeksjoner overføres til F1 avkommet, som vist av 188-bp nDNA band (Figur 11). F1 avkommet var nDNA-positive i 41 70 (58,6%) prøvene undersøkt. Disse mus med nDNA band suggestiv av loddrett ervervet infeksjoner, så få 9 av 41 (22%) hadde T. cruzi antistoffer.

F1 avkom musene ble ofret under anestesi, og kroppens vev ble utsatt for patologisk og immun peroxidase flekker analyser. Resultatene av disse eksperimentene er vist i Figur 12. Resultatene for T. cruzi -amastigotes er dokumentert i den interstitielle cellene av bitestikkel og goniablasts; amastigotes skille i trypomastigotes var tilstede i lumen av seminiferous tubules i fravær av inflammatoriske reaksjoner.

Figure 1
Figur 1 . Trypanosoma cruzi infeksjon i seminiferous tubule om en gutt som døde av akutt Chagas sykdom . Microphotograph fra lege Teixeira fil, 197018. Skjemaene T. cruzi er i goniablasts, og klumper av amastigotes og gratis trypomastigotes (piler) finnes i lumen av seminiferous tubule i fravær av inflammatoriske infiltrerer1. Hematoxylin-eosin flekker. Bar, 20 µm. Reprinted med tillatelse fra utgiveren og forfattere1,19.

Figure 2
Figur 2 . Fotavtrykk av Trypanosoma cruzi fra akutt Chagas sykdom. T. cruzi nDNA PCR forsterkning produktene dannet 188-nt band med en bestemt radiolabeled 188-nt sonde. TC, T. cruzi; NC, negativ kontroll. Gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Southern blotting analyse av Trypanosoma cruzi infeksjoner i fag menneske studie familier. Familie A - alle 15 fag viste den bestemte nDNA PCR 188-nt band. I familien B dannet totalt 35 av 43 fag (81.4%) de bestemte nDNA bandene. I familien C dannet blant 29 medlemmer, 22 (75.8%) nDNA band. I D-familien hadde 11 av 21 fag (52.4%) nDNA band. T. cruzi-spesifikke nDNA band ble bekreftet ved kloning og sekvenser. Gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Aktivt Trypanosoma cruzi infeksjoner i sæd ejakulere fra studien familie frivillige. Infeksjoner i Chagas pasienter ejakulerer identifisert av nDNA PCR 188-bp bandene. TC, T. cruzi positive kontroll. NC, L. braziliensis negativ kontroll. Gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Fenotypen av Trypanosoma cruzi med Chagas sykdom pasientenes serum antistoff. T. cruzi identifisert med Chagas serum IgG antistoffer som gjenkjenner parasitten trypomastigote behandlet med en FITC-merket monoklonale Ab anti-human IgG. Anti-T. cruzi Ab gjenkjenner ikke Leishmania braziliensis promastigotes. Senkninger Vis negative kontrollene. Barer, 20 µm. Reprinted med tillatelse fra utgiveren og forfatter1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 6
Figur 6 . Grafisk fremstilling av ELISAs og nDNA PCR analyser i familien studien befolkningen. Gruppe I (n = 10) og gruppere II (n = 20) var kontrollen negative og positive kontrollsera, henholdsvis fra T. cruzi infeksjoner med parasitological demonstrasjon. Gruppere III (n = 31) inkludert prøver fra familien fag med 188-bp nDNA band og spesifikke antistoffer T. cruzi. Gruppere IV (n = 52) består utvalg av fag med T. cruzi infeksjoner oppdaget av nDNA PCR 188-nt amplicons i fravær av et spesifikt antistoff. Gruppe V (n = 26) var negativ test prøver som består av de smitte-fri familie studien. Gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Heredograms og kartlegging av den Trypanosoma cruzi- infisert familie befolkningen. Figuren viser avvik mellom prosenter av anti -T. cruzi antistoffer og de av nDNA PCR-analyser. Åpen firkant og sirkel, negative mannlige og kvinnelige. Røde firkanter og sirkler, positive anti -T. cruzi antistoffer og nDNA PCR. Svarte firkanter og sirkler, positiv nDNA PCR alene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 8
Figur 8 . Immun toleranse i kyllinger klekket fra Trypanosoma cruzi- inokulert egg. A) preimmune antistoff profil i uekte kontroll kyllinger (n = 10). B) spesifikt antistoff svaret i kontrollen naiv kyllinger utfordret T. cruzi antigen (n = 20). C) fravær av en spesifikk immunrespons i kyllinger klekket fra T. cruzi-inokulert egg etter utfordring med T. cruzi antigen (n = 20). Optisk densitet forskjellen mellom A og C (024 ± 0,17) mot B (0,85 ± 0,6) er statistisk signifikant (p < 0,05). Dette tallet er endret referanse26 og er gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter.

Figure 9
Figur 9 . Den infeksiøs Trypanosoma cruzi i menneskelig ejakulerer oversettes til en aktiv murine infeksjon. Dele Chagas pasienten ejakulerer ble innpodet i bukhulen eller vagina av mus. Mus ble ofret tre uker etter instillasjon. Topp lane, T. cruzi amastigotes hekker i hjertet (venstre) og skjelettmuskelen (høyre). Bunnen lane, T. cruzi amastigote hekker i vas deferens (venstre) og livmor røret (høyre). Sett inn viser en dele amastigote (sirkel). Legg merke til fravær av inflammatoriske infiltrerer i delene vev. Hematoxylin-eosin flekker. Barer: øverste og nederste venstre, 20 µm; nederst til høyre, 10 µm. Reprinted med tillatelse fra utgiveren og forfatter1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 . Seksuell overføring av Trypanosoma cruzi infeksjoner i mus modell systemet ved samleie. Overføring av T. cruzi infeksjoner fra chagasic til naiv kameratene demonstrert av bestemte nDNA 188-bp bandene i de sørlige hybridizations. Topp lane) Prebreeding profiler av PCR forsterkning produktene av T. cruzi -infiserte mus og naiv musene. Oddetall angi T. cruzi-infisert mannlige AE til- og kvinnelig F-til-jeg mus prøver. Selv tallene er naiv kvinne (2-til-10) og menn (12-til-20) mus. Bunnen lane, etter avl, profiler viser at selv mus 2-til-20 ervervet T. cruzi infeksjoner. Gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter1,30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11 . Den Trypanosoma cruzi infeksjon overføres loddrett fra F0 chagasic foreldre til F1 avkom mus. Chagasic foreldre overføres T. cruzi infeksjoner av en enkelt avl møte. T. cruzi-infiserte kvinner var koblet til naiv menn AE og naiv kvinner ble paret med T. cruzi -infisert menn F-J. Etter formering, alle grunnleggerne (F0) viste positiv protozoan nDNA PCR 188-bp bandet. Southern blotting avslørte bestemte nDNA bandet etter hybridisering med radiolabeled 188-nt sonde i et flertall av F1-kull. NC, L. braziliensis negativ kontroll; TC, T. cruzi positive kontroll. Gjengitt med tillatelse fra utgiveren og forfatter1,31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12 . Histopatologi dokumentert Trypanosoma cruzi seksuelt overførbare fra F0 til F1 avkom og immun toleranse i fravær av en inflammatorisk reaksjon. Veksten av skjemaene T. cruzi snittene bitestikkel, goniablasts og de seminiferous tubules av F1 mus. Mus ble ofret under narkose og immun peroxidase-farget delene ble undersøkt under et mikroskop. Photomicrographs Vis brunaktig immun peroxidase-farget T. cruzi amastigotes i den interstitielle av bitestikkel (A) og klumper av amastigotes skille i trypomastigotes kaste inn lumen av den seminiferous tubule (B, C, og F). Amastigote reiret sett i en goniablast (D). Positiv kontroll musen er seminiferous tubule normal histology (E). Legg merke til at inflammatorisk infiltrerer i testiklene av F1 mus viser masse Chagas parasitter. Giemsas flekk. Barer: A, B, C og E, 20 µm; D og F, 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1. Avvik mellom prosenter av positiv IIF og ELISA eksamener, og de av nDNA PCR analyser i utvalgene samlet fra menneske studie familiene A-til-D *

Grupper ** ELISA: serum anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA PCR (%)
-Kontroll Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - kontroll Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76,1
(n = 52)
V - Chagas-fri Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* Resultater av tre uavhengige ELISA og nDNA PCR analyser i prøver samlet i tre forskjellige anledninger år 1, 2 og 3. [1]. forsterkningen på nt-188 T. cruzi DNA gjenta bekreftet ved kloning og sekvenser.
** Forskjeller negative (grupper I og V) og positiv fagene (grupper III og IV) er statistisk signifikant (p < 0,05).
ᵟ avvik mellom grupper III og IV forklart av immun toleranse i fravær av T. cruzi antistoffer oppnådd i 62,6% (52/83) av PCR positiv fag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her diskuterer vi en familie-basert Forskningsprotokoll som besvart spørsmålet om menneskelig Chagas sykdom stammer fra seksuelt overførbare artsspesifikke T. cruzi infeksjoner. Studier kunne ikke gi bevis for seksuell overføring av T. cruzi infeksjoner, sannsynligvis fordi på tilgjengelige data og informasjon om Chagas sykdom ble innhentet separat fra personlige3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Funn av T. cruzi i den seminiferous tubule til en gutt (figur 1) var gnisten som ansporet klinisk og epidemiologiske undersøkelse. Etter flere tiår, tenkes når familien studere tilnærminger og teknologiene som er beskrevet i denne forskning protokollen var tilgjengelig, T. cruzi livssyklus scener dukket opp i menneskelig ejakulere1,19.

Direkte parasitological demonstrasjon av protozoan i 21 akutt Chagas sykdom tilfeller var avgjørende å validere nDNA PCR forsterkning produkter, som dannet bestemt band i prøver fra alle fag akutt infisert med T. cruzi. Denne point-of-care laboratorium markøren evaluert resultatene av immunologiske og nukleinsyre analyser. Grunnleggende langsiktig Chagas sykdom familie studien, derfor kombinerer resultatene hos mennesker med de innhentet i grupper av forsøksdyr. Forskningen utført i henhold til protokollen avslørt for første gang at T. cruzi infeksjoner overføres seksuelt i mennesker1.

Bred forskjellen forholdstallene fra parasitten-spesifikke antistoffer-analyser og de fra nukleinsyre testene viser at flertallet av de nDNA fotavtrykk resulterte fra seksuelt overførbare tilfeller i fravær av bestemte anti T. cruzi antistoffer. Dermed var seksuell overføring av T. cruzi i familiemedlemmer viser positive nDNA i fravær av det spesifikke IgG-antistoffet immun toleranse.

Immun toleranse ble demonstrert i en kylling modellsystem ildfaste til T. cruzi infeksjoner etter den første uken av fosteret vekst1,25,26,32,33, 34. Deretter umodne immunsystemets manglende evne til å gjenkjenne parasitten som en utenlandsk komponent av kroppen vist på kyllingen sent modne immunsystemet toleranse overfor T cruzi. I lys av disse resultatene er toleranse et naturfenomen1 skyldes immunsystemets selvtillit anerkjennelse og vedlikehold av sin egen kropp komponenter under fysiologiske forhold25,26, 32 , 33 , 34. skiftet fra staten immun toleranse til autoimmune Chagas hjerte sykdom kan derfor knyttes effektor celle endringer som følge av T. cruzi kinetoplast (kDNA) mutasjoner i vertens genomet1 ,2,14,23,25,26.

Under kritisk i forskning-protokollen beskrivelse viktigste teknikk endring og feilsøking for å avsløre seksuelt overførbare Chagas parasitter1,14,23,25, 26: jeg) velge studie familier med tilfeller av akutt Chagas sykdom35,36; ii) isolere av vill-type T. cruzi fra blodet av akutte tilfellene. iii) å få DNA-prøver fra til familienes deltakerne blod ulike flagellater, fra Berenike T. cruzi arketypen, fra positiv deidentified bank DNA-prøver og negative kontrollere L. braziliensis; iv) utfører ryddig teknisk prosedyrer å vise at deltakernes ulike flagellater nDNA fotavtrykk er identisk Berenike T. cruzi arketypen og de positive bank DNA-prøvene; v) kjører uavhengig tre eksemplarer nDNA footprinting å demonstrere T. cruzi infeksjoner i familiemedlemmer tre ganger ett år fra hverandre; vi) sikrer at nDNA PCR teknikken utført på omsorg gir resultater bekreftet ved kloning og sekvensering alle amplicons herdet til bestemte primer sett, dermed konsekvent dukke T. cruzi 188-nt rekkefølgen 1,25,28,29,30; vii) bruke høykvalitets varemerke reagenser til å gjengi antistoff titers i serumprøver samlet på tre forskjellige tidspunkt; viii) familie studie protokollen avslørt eksisterende live infeksjon i bakterie linje cellene ved demonstrasjon av T. cruzi nDNA i fravær av spesiell serum antistoffer i sæd ejakulerer fra Chagas parasitten-infiserte enkeltpersoner1; ix) perspektiv er at forskning protokollen utviklet for å løse den seksuelt overførbare T. cruzi infeksjoner skal avsløre den autochtonous Chagas sykdommen på fem kontinenter; x) i nDNA og kDNA avtrykk sikker diagnosen kronisk asymptomatisk Chagas sykdom hos mennesker1,2; xi) i fravær av nDNA, mutasjonav T. cruzi kDNA sekvens1,2,23,25,26 alene er en laboratorium markør for oppnå differensialdiagnose idiopatisk strekte cardiomyopathies23,25,37,38,39.

I tillegg var det virulente T. cruzi i Chagas pasienten ejakulerer i stand til starte utbredt infeksjoner på instillasjon i musen vagina og i sin bukhulen. Patologi studien viste T. cruzi amastigote hekker i hjerte og skjelettmuskulatur samt vas deferens og livmor rør. Interessant, parasitten reir ikke provosere inflammatoriske reaksjoner som vil hemme vitale reproduktive funksjoner. Fravær av inflammatoriske reaksjoner gjengir rettigheten immun i viktige funksjonelle kropp strukturer40,41,42,43,44,45 og derfor forklarer uncurbed veksten av T. cruzi i den reproduktive organer.

Videre forklart den eksperimentelle studier i chagasic mus som avlet med naiv kameratene nærmere seksuell overføring av T. cruzi infeksjoner hos mennesker. Infiserte kvinner og menn sendt T. cruzi infeksjoner til uninfected naiv kameratene under samleie, og fleste av deres søppel ervervet T. cruzi vertikalt overført fra foreldre til avkom. I disse eksperimentene, startfasen referert til veksten av T. cruzi i røret og i livmoren, samt i seminiferous tubule og vas deferens, der rettigheten immun fant sted. Så, seksuell overføring skjedd gjennom parasittiske stadier i sæd eller livmor sekreter inn i skjeden. Immun privilegium40,41,42,43,44,45 er et fenomen som lar noen organer (reproduktive system, øynene og hjernen) til downregulate inflammatoriske reaksjoner og unngå å skade viktige, følsom og bestemte funksjoner40. Hormoner41 og flere immun faktorene downregulate makrofager41,42,43, naturlige drepe celler41, T-lymfocytter og T-regulatoriske (Treg) celler, dermed orkestrering av Hemming av proinflammatory cytokiner og immun-privilegium utløsere40,41,42,43,44,45.

Seksuell overføring av T. cruzi infeksjoner fra menn og kvinner til naiv partnere angir at kontroll av Chagas sykdom krever internasjonal solidaritet. Resultatene diskuteres her tyder på at mer kreativ forskning er nødvendig. Følgende umiddelbare mål er oppnåelig: jeg) å utvikle høy gjennomstrømming plattformer for spesifikke og svært følsom nukleinsyre testing for å nå en nøyaktig diagnose, satsing for å forebygge infeksjoner overføres ved samleie, blodoverføringer og organtransplantasjon som klinisk og epidemiologiske henvendelser for å fastslå diagnostisering og utbredelsen av Chagas sykdom; ii) å fremme en multicenter narkotika utviklingsprogrammet å få nye legemidler for avskaffelse av T. cruzi infeksjoner; og iii) å implementere en passende utdanning, informasjon og kommunikasjon program som omfatter deltakelse av skoler, kirker, sosiale organisasjoner og helseinstitusjoner å hindre spredning av Chagas sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi erkjenner at laboratoriefasiliteter og kritiske kommentarer Izabela Dourado, Carla Araujo, og smart Gomes og teknisk assistanse av Bruno Dalago og Rafael Andrade. Vi står i gjeld til grunnlaget for fremme av vitenskap (FAPDF), The National Research Council, departementet for vitenskap og teknologi (CNPq/MCT), og The Agency for trening menneskelige ressurser, utdannings (KAPPER / meg), Brasil, for å støtte disse undersøkelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 143 ejakulerer familie studie, Trypanosoma cruzi sæd livmor sekresjon mus modellsystem vertikal overføring immun privilegium kylling modellsystem immun toleranse Chagas sykdom.
Seksuell overføring av amerikanske Trypanosomes fra menn og kvinner til Naive Mates
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter