Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

Trypanosoma cruzi Ajan Chagas hastalığının klinik olarak tanınan patoloji aniden geliştirmek uzun ömürlü asemptomatik enfeksiyondan üretir. Aşağıdaki araştırma Protokolü cinsel üst nesneden döl için aktarılan T. cruzi enfeksiyon çözülmeye bir kısa vadede ailesi tabanlı epidemiyolojik çalışma açıklar.

Abstract

Amerikan tripanozomiyasına insanlara triatomine hata ile kirlenmiş yiyecek, sindirim kan nakli veya hastane ve araştırma laboratuvarları kaza yayın yapıyor. Buna ek olarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyon doğuştan bir chagasic anneden onun çoluk aktarılır, ancak rahimde kirlenme erkek ortak katkısı bilinmiyor. Yuva ve kümeleri amastigotes ve trypomastigotes yumurtalık granulosa hücreleri, goniablasts ve seminifer tübüllerin lümen bulguları T. cruzi enfeksiyonları cinsel yolla bulaşan öneririz. Burada araştırma Protokolü diploit kan mononükleer hücreler ve insan denekler haploit gamet parazit nükleer DNA gösteren bir aile çalışma nüfus sonuçlarını sunar. Böylece, üç bağımsız biyolojik örnek bir yıl ayrı toplanan T. cruzi enfeksiyonları cinsel döl için iletilen doğruladı. İlginçtir, özel T. cruzi antikor yok bağışıklık toleransı parazit antijen ile delik aile Döl çoğu. İmmün tolerans embriyonik gelişim ilk hafta sonra tavuk T. cruzi için ateşe dayanıklı gösterilmiştir ve kamçılamak-aşı yumurta yumurtadan civciv spesifik antikor üretmek koyamadık. Ayrıca, insan meni korumak intraperitoneally veya saf fareler T. cruzi amastigotes epididim, Seminifer tübül, vas deferens ve inflamatuar bir yokluğu ile rahim tüp vermiştir vajina içine cinsel ilißki üreme reaksiyonlar bağışıklık ayrıcalıklı organlarında. T. cruziyetiştiriciliği-saf arkadaşları ile enfekte erkek ve dişi fareler daha sonra döl için iletilen enfeksiyonlar edinimi sonuçlandı. Bu nedenle, nüfus ve sosyal kuruluşların ilgili sağlam bir eğitim, bilgi ve iletişim programı Chagas hastalığı önlemek için gerekli olarak kabul edilir.

Introduction

Trypanosomatidae memeli ev sahibi trypomastigote ve amastigote yaşam döngüsü aşamasında uğrar ve böcek-vector'ün epimastigotes olarak var ailesine ait protozoon parazit Trypanosoma cruzi (Reduviid: Triatominae) gut ve buna axenic kültür. Son yıllarda ülkede Chagas hastalığı varlığı triatomine hata ücretsiz1,2,3,4,5, kabul dört kıtada çeşitli çalışmalar göstermiştir 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; Amerikan Tripanozomlar dağılım Latin Amerikan kökenli göçmenlerin Kuzey Yarımküre için başlangıçta atfedilen ama olasılığını otokton Chagas hastalığı vakalarının bazıları artık3,4 engellendi , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. T. cruzi iletim yalnızca tanınabilir endojen kaynak gebelik15; yaklaşık yüzde 10'u yavru parazit chagasic annenin transferi atfedilir sperm cinsel ilißki ile rahimde enfeksiyon erkek ortak katkısı tanınmayan kalmıştır.

Bir yüzyıl önce müfettişler16,17 gözlenen hücre içi T. cruzi amastigotes yumurtalık granulosa hücrelerinde ve mikrop satır akut Chagas hastalığı vakaları testis hücreleri. Yuva ve T. cruzi trypomastigotes ve amastigotes granulosa yumurtalık hücrelerinin, goniablasts ve seminifer tübüllerin (Şekil 1) ölümcül akut Chagas hastalığı vakalarının lümen kümeleri organların bağışıklık ayrıcalık geliştirmek üreme olmadığında inflamatuar infiltratlar18,19. Son yıllarda birkaç deneysel çalışmalar yuva T. cruzi yuvarlak amastigote formları Seminifer tübül, epididim ve vas deferens de rahim, tüpler ve yumurtalık gibi akut virüslü fareleri granulosa hücreleri göstermiştir 1,20,21,22. Onların soyundan gelenler, T. cruzi nükleer DNA (nDNA) için ebeveyn Chagas hastalardan mitokondrial DNA insan haploit germ hattı hücreleri23', doğrulanmış protozoon transferini belgelemek için Ayrıca, aile çalışmaları sırasında ve parazit yaşam döngüsü aşamaları cinsel ilißki chagasic fareler24içinde tespit edildi. Bu bulgular tarafından enfekte T. cruzi -spesifik antikor1,25,26yokluğu konaklarda Döl elde bağışıklık toleransı üzerindeki raporları ile anlaşma vardır. Ayrıca, diğer kıta3,4,5,6,7,8 için endemik Chagas hastalığı yayılmasını önerilen epidemiyolojik raporları ,9,10,11,12,13 şimdi Chagas hastalığı cinsel iletimi için gösterilen deneysel çalışmalar tarafından1 desteklenen . Mevcut soruşturma epidemiyolojik aile çalışma Protokolü sunar ve T. cruzi enfeksiyon cinsel ilişki tarafından yayar gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan ve hayvan araştırma Komiteleri Brasilia Üniversitesi Tıp Fakültesi, insan denekler ve Laboratuvar hayvanlarının, tüm yordamları sırasıyla, araştırma protokol 2500.167567 ve 10411/2011 onayladı. Kamu Vakfı Hastanesi Gaspar Vianna (iletişim kuralı n º 054/2009 ve CONEP 11163/2009) Etik Komitesi ile uzatma için Bakanlığı Sağlık Ulusal Komisyonu insan araştırma (CONEP 2585/04) saha çalışması için ücretsiz izin formları onayladı. Protokol T. cruzi DNA diploit kan mononükleer hücreler ve sperm cinsel ilißki, haploit gamet değerlendirmek için ayarlandı. Laboratuvar hayvanlarının insana ilişkin bakım alınan; kalbi delik kurban önce tabi fareler, anestezi altında idi.

1. insan katılımcılar alımı

  1. Araştırma ekibi bir sağlık sistemi Chagas hastalığı programı Chagas hastalar için sağlık hizmeti sunmak, yer aldığı emin olun.
  2. Programda kayıtlı ailelerin en az bir durum ile ateş, kırgınlık, baş ağrısı, taşikardi ve ödem, akut Chagas hastalığı14başlıca klinik belirtileri gösteren insan katılımcılar askere.
  3. Beş yıllık bir süre için çalışma ailelerde halkına sağlık hizmeti sunmak.
  4. Venöz kan 15 mL çalışma katılımcıların üç kez bir yıl ayrı elde etmek, örnek üç 5 mL aliquots bölmek ve onları 4 ° C'de buzdolabında saklamak
  5. 2 mL sperm cinsel ilißki yetişkin gönüllü aile üyelerinden toplamak ve 3.3 adımda anlatıldığı gibi devam edin.

2. büyüme parazit

  1. Adım 1.4 aliquot kullanarak, kan anticlotting sodyum heparin 5 adet ile karıştırın; yamaç kültür akut Chagas hastalığı tanısı ile aile katılımcılardan kan aşılama tarafından yapmak.
    1. Bir 50 mL vidalı kapak tüp kan-agar çekik artı karaciğer infüzyon-tryptose Orta (LIT) 5 mL 5 mL unclotted insan kan aşılamak ve örnek bir shaker 27 ° C'de 3 ay için kuluçkaya.
    2. 100 µL süpernatant orta cam slaytlar üzerine yerleştirin, paket fişi ve kan T. cruzi epimastigotes mikroskop altında ara ile her dört haftada bir kapak.
    3. Epimastigote yalıtır süpernatant 27 ° C'de axenic edebiyat ortamının içinde hasat; PBS pH 7.4, 10 dk 1000 x g , santrifüj hücrelerde yıkayın; Pelet temel Orta (DMEM) Dulbecco'nın-modified 5 ml epimastigotes oranında seyreltin.
    4. Konfluent L6 kas hücre kültür şişeler aşılamak 1 x 10 ile6 ECI1 ECI21 T. cruzi epimastigote izole ediyor.
    5. T. cruzi ECI1 ECI21 ve Berenice güzel örneği trypomastigotes L6 kas hücre kültürlerinde 75 mL kültür şişeler içinde büyür.
    6. DMEM 15 mL pH %7,4 5 fetal Sığır serum, 100 IU/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 250 nM L-glutamin ve % 5 CO2 37 ° C1ile desteklenmiş hücrelerle besleme.
    7. Pozitif kontrol T. cruzi Berenice trypomastigotes fenotip için doku kültüründen ECI1 ECI21 yalıtır 5.2. adımda açıklandığı gibi kullanın.
    8. Negatif kontrol LEISHMANIA braziliensis%27 20 fetal Sığır serum ile yalnızca desteklenen DMEM içinde büyümek ve parazit promastigotes bir negatif kontrol kullanın.
    9. 1 x 106 T. cruzi ECI1 ECI21 trypomastigotes süpernatant ile hücre kültür fareler bulaştırmak için kullanın.
    10. T. cruzi trypomastigotes kuyruk kanda enfeksiyon ilk hafta sonra arayın.
    11. Amastigotes yuvalarının hematoksilen-eozin bölümleri kalp, iskelet kası ve virüslü farelerin üreme organları bir ay sonra lekeli arayın.

3. DNA ekstraksiyon ve PCR analizleri

  1. Kan (adım 1.4) 5 mL steril EDTA tüpte aliquot yerleştirin ve yoğunluk gradient Santrifüjü 45 dk 3000 x gde gerçekleştirmek. Mononükleer hücreler kırmızı hücreleri üzerinde beyazımsı aşamasından hasat, beyaz hücreleri 5 mL de PBS, pH 7.4, 1.500 x g bir farklı 15 mL Tüp, 10 dk aralıklarla tarafından iki kez yıkayın ve hücreleri DNA ekstraksiyon için kullanmak için bir pipet kullanın.
  2. DNA ECI-21 T. cruzi, Berenice T. cruzi, negatif kontrol L. braziliensis (adım 2.1.8), gelen olumlu denetiminden için ECI-1 den hulâsa ve 109 insanlık ailesinin testi kan mononükleer hücreler konular1 çalışma , 27 , 28.
  3. DMEM (1:4, v/v); 1,5 adımda alınan sperm örneklerinin seyreltik 2 mL %5 CO2 45 dk ve 37 ° C için kuluçkaya, Sperm hücreleri süpernatant Santrifüjü 13.000 x gde 5 dk sonra yeniden elde etmek ve haploit DNA23özü.
  4. 1 mL hücreleri ayıklama arabellekte yerleştirin (10 µM NaCl, 20 µM EDTA, % 1 SDS, %0,04 İndinavir-K ve %1 dithiothreitol) ve çözümleri inversiyon ve sallayarak karıştırın.
    1. Çözümler için 13.000 x g ve 25 ° C de 10 dk santrifüj kapasitesi ve viskoz süpernatant bir spin sütuna aktarmak.
    2. Spin sütun için 10.000 x g , 1 dk santrifüj kapasitesi ve eluate atın; 500 µL bağlama arabellek spin sütun (Tablo reçetesi) eklemek için 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi ve eluate atın.
    3. 600 µL çamaşır arabellek spin sütununu ekleyin, 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi ve eluate atın.
    4. İki kez bu işlemi tekrarlayın ve spin sütun steril 1,5 mL mikro santrifüj tüpü aktarın.
    5. 100 µL TE arabelleği, Tüp, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya ve tüp için 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi ekleyin. Microcentrifuge tüp arabellekte DNA içerir.
    6. Ölçüm DNA konsantrasyonları aliquots % 0,8 özel jel üzerinde çalıştırarak ve 260 absorbans okuyarak nm bir Spektrofotometre ile. PCR analiz kullanımda kadar DNA örnekleri-20 ° C'de depolayın.
  5. Kullanım T. cruzi Tcz1/2 astar belirli 188-nt belirli telomer dizisine komplementer29 yoklama ve PCR ile DNA aile çalışma konularda kan ve sperm, Berenice T. cruzi olumlu denetiminden ve çalışacak L. braziliensis negatif kontrol.
    1. PCR karışımı 10 ng şablon DNA, astar, 2 U Taq DNA polimeraz, 0.2 µM dNTPs ve 15 µM MgCl2 25 µL son birimindeki her çiftinin 0.4 µM ile hazırlayın.
    2. DNA amplifikasyon programı için 30 94 ° C'de başlatmak şablonunun tabiatını ve örnekleri için 30 55 ° c serin s s. O zaman, örnekleri için 90 94 ° C'de kuluçkaya tavlanmış astar genişletmek için s. 30 94 ° C sıcaklık dönmek sonraki döngüsü başlatmak ve örnekleri kuluçkaya s bir ek 3 dk. 72 ° C'de 32nd döngüsü sonunda, örnekleri, oda sıcaklığında 10 dakika serin ve onları 4 ° C29buzdolabında saklayın.
    3. Bir T. cruzi DNA telomer tekrar dizisi Tcz1/2 astar, her iki kol ve bacaklar ona komplementer yükseltmek.
    4. % 1.3 özel jel amplifikasyon ürünlerde analiz ve UV ışığı 188-nt DNA bands gözlemlemek.

4. Güney hibridizasyon

Not: Güney hibridizasyon özel jel yanlış pozitif PCR amplicons çoğunu atmak için kullanıldı.

  1. PCR güçlendirme ürünleri denetimlerinden Chagas servis talebi olumlu, 109 test örnekleri diploit DNA'ın ve Güney hybridizations için 21 çalışma aile katılımcıların haploit DNA bulaşmamış denetimlerinden tabi.
  2. Gösterilen Tcz1/2 astar komplementer T. cruzi 188-nt DNA özgü telomer sıra sonda istihdam; [α -32P] 2'-deoxyadenosine trifosfat (dATP) kullanarak rasgele bir astar kiti etiketleme ile probe etiketleyin ve 60 V gecede 4 ° C'de % 1.3 özel jel amplifikasyon ürünlerde analiz
  3. Jel kapiller yöntemle gecede bir pozitif yüklü naylon membran aktarın.
  4. Genomik DNA EkoR1 digests enzim özgü arabellek 25 µL içinde değişken süre bağlar radiolabeled 188-nt sonda ile naylon membran için aktarılan DNA bantları melezlemek.
  5. 2 x SSC ve % 0.1 SDS ile 65 ° C'de membran 15dk için iki kere yıkayın.
  6. Röntgen filmleri naylon membran ve autoradiograph için bir hafta membran bands maruz bırakmayın.
  7. PCR ve Güney hibridizasyon belirli radiolabeled DNA prob ile melezleşmiştir T. cruzi PCR güçlendirme ürünleri ile seçildiği klonlar büyümek.
  8. Ticari olarak T. cruzi -belirli telomer ayak izi2,23için tavlanmış ayarla Tcz1/2 primerler kullanılarak klonlar sıra.

5. immünolojik deneyleri

Not: Duyarlılık ve özgüllük dolaylı ayirt (IIf) ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) değerlendirildi serum kanıtlanabilir parasitemia altı Chagas hastalarda ve altı Chagas ücretsiz serum deidentified Banka örnekleri. Deneyleri 1: 100 dilutions, IIf ve ELISA optik yoğunlukları (ODs) 0.150 ve üzeri olumlu olumsuz sonuçlarından ayrılmış ortaya Çift Kişilik serum dilutions PBS, pH 7.4, içinde yürütülen.

  1. 1500 x g için serum süpernatant içinde ayırmak 30 dk de santrifüj kapasitesi 5 mL 1 h için oda sıcaklığında muhafaza unclotted kan aliquot (adım 1.4) kullanın
  2. IIf ve ELISA içinde onaylatılacak 1: 100 serum dilutions28. daha önce açıklandığı gibi T. cruzi ve L. braziliensis antijenleri algılamak için gerçekleştirmek
  3. IIF
    1. İneklemek serum dilutions üç kez bir yıl arayla elde 109 çalışma flaşının örneklerinin IIF tahlil yapmak.
    2. %1 - 5 µL süspansiyonlar formalin, yer tedavi T. cruzi epimastigotes veya L. braziliensis promastigotes cam slayta; Oda sıcaklığında bir başlık parazitler kuru geceleme izin ve cam slaytları-20 ° c kadar kullanmak depolama.
    3. Hastaların serum dilutions cam slayt üstünde yer 20 µL promastigotes 5 µL formalin öldürdü (10 parazitler/µL) T. cruzi epimastigotes veya L. braziliensis ile kaplı.
    4. 37 ° C ve yıkama üç kez PBS ile nemli bir odasında 1 h için bir kayma ile kaplı cam slayt kuluçkaya.
    5. Fluoresein etiketli tavşan antikor (Tablo malzeme), bir 1:1,000 seyreltme ile air-dried cam slayt 37 ° C'de 1 h için insan IgG için kuluçkaya; Yıkayıp kurulayın slayt.
    6. Bir kapak notu içeren slaydı bağlayabilir ve UV ışık mikroskop altında incelemek.
      Not: Bir elma yeşil olumlu bir sınavdır T. cruzi epimastigote siluet, videoda gösterilen.
  4. ELISA
    1. T. cruzi ve L. braziliensis çözünür antijenlere (1 µg/100 µL 0.1 M karbonat tampon pH 9,6) kaplamalı Mikroplaka wells algılamak için bir ELISA çalıştırın.
    2. 1: 100 serum dilutions onaylatılacak kaplamalı Wells, oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    3. Üç kez PBST ile tabak yıkama (% 0.5 içeren PBS ara-20), pH 7.4, kurutma önce çözüm.
    4. Tavşan anti-insan IgG antikor 90 dk 37 ° C'de bir 1:1,000 seyreltme 50 µL pilakalar kuluçkaya
    5. Üç kere PBST çözüm ile tabak yıkama ve oda sıcaklığında kuru izin.
    6. 1:1,000 dilutions alkalin fosfataz Birleşik keçi Anti-tavşan IgG (Tablo reçetesi) 90 dk 37 ° C'de 100 µL pilakalar kuluçkaya
    7. Üç kez PBST ile tabak yıkama, substrat p-nitro fenil fosfat ekleyin ve renk geliştirme için bekleyin.
    8. 630, ODs okumak nm içinde düzenlediği plaka okuyucu.
    9. Test serum onaylatılacak dilutions çalışma nüfus çalıştırmak ve belirli tanımlamak için ODs Arsa T. cruzi antikor titreleri.

6. immün tolerans ilişkin değerlendirmeler

Not: Bir tavuk modeli sistemi T. cruzi enfeksiyonlar embriyo gelişiminin ilk hafta sonra test etmek için kullanılmıştır.

  1. Tavuk verimli yumurta 100/10 µL T. cruzi trypomastigotes doku kültürü ortamından hasat ile aşılamak; sahte denetim yumurta µL kültür orta başına 10 T. cruzi trypomastigotes ile aşılamak. Kaseti o deliği kapatın.
  2. 20 enfekte T. cruzi -yumurta ve 37 ° C ve % 65 nem sahte Denetim verimli yumurta eşit sayıda için 21 gün kuluçkaya.
  3. Piliçler için üç hafta kuluçka 24 h için ve bundan sonra davlumbaz sıcaklık kontrolü ile 32 ° C'de kapağı tutun.
  4. Aşısını T. cruzi -yumurta ve bireysel kafeslerde ayrı koridorlarda yerleştirilen 24 ° C'de olumlu hava basınç odasında yetişkin sahneye sahte denetim yumurta yumurtadan civciv büyümek.
  5. Yetişkin piliç üç kez altı ay-in yaş 107 formalin öldürdü trypomastigotes subkutan, haftalık, video düzenine göre enjekte ile meydan.
  6. Kan aşılamak T. cruzi -yumurta ve sahte denetimleri dört hafta sonra serum elde etmek için son aşılama yumurtadan tavuk kanat ven çizmek.
  7. Tavuk serum özel algılamak için kullanın IIf ve protokolün 5 adımda anlatıldığı gibi ELISA tarafından T. cruzi antikor.

7. mantar enfeksiyonu farelerin T. cruzi Chagas hastaların meni itibaren cinsel ilißki

  1. Sperm cinsel ilißki bir yetişkin PCR + Chagas hastalığı hasta (adım 1.5) ve bir yetişkin PCR - Chagas-özgür birey kullanın.
  2. Davlumbaz olumlu hava basıncı 24 ° c altında tutulması ve gıda ad libitumbeslenen 12 aylık bir BALB/c saf fareler iki grupları kullanın.
  3. İnsan Chagas pozitif sperm aliquots (100 µL) içine belgili tanımlık Karın zarını ve eşit miktarda A grubu fareler vajina içine aşılamak.
  4. Denetim Chagas ücretsiz meni aliquots (100 µL) Karın zarını ve B grubu fare eşit miktarda vajina içine aşılamak.
  5. Deneysel fareler anestezi altında beş hafta sonra meni instillations kurban ve hematoksilen-eozin ile boyama için doku bölümlerde konu.
  6. Mikroskopi T. cruzi trypomastigotes ve kalp, iskelet kası ve gruplar halinde fareler üreme organları amastigotes aramak için kullanın.

8. iletim T. cruzi enfeksiyon ilişki tarafından

  1. 10 erkek ve kadın altı haftalık BALB/c Fare deneylerinde kullanın.
  2. Beş erkek ve 1 x 105 T. cruzi trypomastigotes doku kültüründen intraperitoneally ile beş kadın fareler aşılamak.
  3. Yaş 3 ay öncesine kadar fareler doğurmak: Ben beş T. cruzitarafından oluşan grup-virüslü dişi fareler ve beş kontrol noninfected erkek arkadaşları; Grup II enfekte beş T. cruzi -tarafından erkek oluşturulacak ve beş noninfected kadın arkadaşları kontrol edin. Grup III beş erkek ve beş kadın denetim bulaşmamış saf arkadaşları tarafından kurulmuş.
  4. Evin her kaçış önlemek için çift 5 mm ızgara ve kilitli kapı ile kasa içine yerleştirilen bir kafeste yetiştiriciliği.
  5. Fareler chow ve su ad libitum besleme. Toplam 70 ettiklerinizden grupları II ve en az altı hafta boyunca sütten yükseltmek.
  6. Ebeveyn (FO) ve döl (F1) fareler anestezi altında kalp delik tarafından kan, fareler kurban ve bölümleri kalp, iskelet kası ve patolojik analiz için üreme organları gönderin.

9. bağışıklık ayrıcalık değerlendirilmesi

  1. Doku T. cruzielde-enfekte ve saf kontrol fareler (adım 8.6) ve parafin gömülü örnekleri 4 µm kalınlığında bölümlere kesti.
  2. Parafin kaldırmak ve Ksilen birkaç değişiklik ile cam slaytlar ve 1 dk. için %100 70 etanol ile kademeli yıkar üzerine bölümleri kurutmak.
  3. Doku bölümleri % 0.05 saponin ile bir kez, oda sıcaklığında üç distile su yıkama ardından kuluçkaya.
  4. %5 45 dk. Yıkama için yağsız Süttozu doku bölümlerle 0.1 M PBST slaytları engellemek ve bölümler Chagas fare anti-T. cruzi serum veya bulaşmamış kontrol fare serum burada 2:20 ile kuluçkaya seyreltme için 2 h.
  5. Üç kez 5 min için slaytlar PBST ve kuru, oda sıcaklığında kuluçka 1:1,000 seyreltme alkalin fosfataz Birleşik tavşan Anti-fare IgG ile önce yıkayın.
  6. PBST içinde slaytları durulama ve 3,3' diaminobenzidine PBST ile üç yıkama ve Harris hematoksilen 30 ile counterstaining ardından bir 5 dk kuluçka için 100 µL eklemek s.
  7. Slayt 5 min için distile suda yıkayın, onları % 70, %80, % 90 ve % 100 etanol için 1 dk kurutmak ve tamponlu gliserin mount.
  8. Alan parlak ışık mikroskopla slaytları inceleyin ve fotoğraf çekim yazılım ve bir analyzer programı ile bir microcamera ile.
  9. Parazit yokluğunda üreme organlarında inflamatuar reaksiyonları, bağışıklık ayrıcalığını belge.

10. istatistiksel analizler

  1. Dizi analizi için düzenleme kullanma Biyomedikal hizalamaları patlama ile gerçekleştirmek ve E-değer istatistiksel anlamlılık (p < 0,05) belirlemek.
  2. Bir tek yönlü varyans analizi (ANOVA) gerçekleştirmek ve OD karşılaştırmak için Tukey testi artı ya da eksi standart sapma anlamına gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Akut Chagas hastalığı vakalarının klinik ve parasitological sınavları tarafından tespit etmek için yapılan protokole göre bu araştırma amaçlı. Venöz kan örneği doğrudan mikroskobik inceleme ve parazit büyüme için tüp bebek kültürüne tabi tutuldu. Chagas hastalığı yirmi akut durumlarda kan T. cruzi gösterdi. T. cruzi ECI1 yalıtım araştırma Protokolü güvenli-ECI21 akut Chagas hastalığı ve DNA örnekleri olumlu DNA ayak çalışma nüfusun geri kalan sergiledi: nDNA-PCR deneyleri tipik telomer yineleme sıra vermiştir 188-nt grup yanı sıra T. cruzi Berenice güzel örneği1mevcut. Chagas servis taleplerini ve çalışmaya katılmak için gönüllü aile üyelerinin dört aile1gruplandırılmış.

Aile bu çalışmada, T. cruzi nDNA astar ile güçlendirilmiş PCR1,23 21 akut Chagas hastalığı vakalarının herbirinden belirli telomer dizisine komplementer ayarlar yapıldı. Bu T. cruzi nDNA amplicons melezleşmiştir belirli radiolabeled sıra sonda ile (Şekil 2); Klonlama ve sıralamanın amplicons T. cruzi 188-nt telomer tekrar motifi oluşan ortaya koydu. Bu hibridizasyon yordamları özgüllük L. braziliensis promastigotes ile gerçekleştirilen negatif kontrol gösterildi. Hemoflagellates akut Chagas hastalığı hastaların gerçekten öldürücü patoloji analiz doğrulanmış T. cruzi. Biz T. cruzi nDNA (188-bp) Grup 21'akut Chagas durumlarda (Şekil 2) kalıcı enfeksiyonların doğrudan bir gösteri olduğunu bulduğu sonucuna.

Trypanosoma cruzi insanlarda cinsel iletim

T. cruzi enfeksiyon oranları değerlendirmek için biz aile çalışma nüfus1parazit ayak yüksek hassasiyet algılanması için nükleik asit test uygulanır. Bu PCR deneyleri şekil ile belirli radiolabeled 188-nt probe melezleşmiştir amplifikasyon ürünleri nDNA bantları %76.1 (83/109) test örnekleri; nDNA-PCR güçlendirme ürünleri belirli 188-nt radiolabeled sonda ile Güney hibridizasyon sonuçlarını Şekil 3' te gösterilmektedir. Ayrıca, hybridizations gönüllü aile üyeleri (Şekil 4) germ hücre hattında parazit DNA gösterdi.

IIF fenotip ECI1 için ECI21 T. cruzi trypomastigotes insan serum IgG ile protozoon kan parasitological gösteri ile bir Chagas hastalığı serum banka örnekten için istihdam edildi ve bir floresein anti-insan IgG kullanılan Birleşik . T. cruzi Berenice Chagas antikor için olumlu bir denetim ve negatif kontrol onun aile promastigote göreli L. braziliensis. Şekil 5 gösterir Berenice güzel örneği olumlu elma-yeşil silüeti vahşi türüyle ilişkili olan videoda gösterilen T. cruzi zarf.

ELISA ve IIf belirli ortaya T. cruzi antikorlar1,28 %28,4 test örnekleri (31/109). ELISA ve IIf, aynı zamanda o--dan nDNA-PCR amplicon ve Güney hybridizations, sonuçları Şekil 6' çizilir. NDNA-PCR ayak izleri ve spesifik antikor deneyleri heredograms (Şekil 7), Aile A, dört konu tasvir gelen sonuçları arasında tutarsızlıklar vardı olumlu nDNA ve anti -T. cruzi antikor ve 11 vardı sadece pozitif nDNA; beş erkek T. cruzi meni boşalmak vardı. Ailemde B 44 kişi ile 11 özel vardı T. cruzi antikor ve 23 vardı spesifik antikor ve parazit nDNA; yedi bireyler T. cruzi meni boşalmak vardı. Aile C 29 üye ile antikor ve T. cruzi nDNA beş bireylerde ve 17 parazit nDNA yalnız vardı; Dört erkek nDNA-PCR pozitif sperm boşalmak vardı. 21 konular arasında aile D 11 belirli anti -T. cruzi antikor ve nDNA ayak izi vardı ve dokuz olumlu nDNA-PCR yalnız kaldı. Şekil 3, Şekil 6 ve Şekil 7 geniş farklılıklar sonuçları arasında sürekli, aile konularda çalıştırmak bir yıl arayla üç bağımsız deneylerde elde edilen biyolojik örneklerde tasvir.

Tablo 1 IIF, ELISA ve nDNA-PCR deneyleri arasındaki kantitatif farklılıklar örneklerinde A ö insan çalışma ailelerden gösterir Antikor deneyleri (%28,4) oranları ve bu olumlu nükleik asit deneyleri (%76.1) arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.005) vardır. Bu ailelerin enfekte T. cruzi -insan (III ve IV) grupları arasındaki farkları %62.6 (52/83) pozitif nükleik asit testi yalnız gösterilen nüfusun sorumluydu. Geniş farklılıklar antikor açıkladı olumlu nDNA ayak izleri oranları ve bu belirli T. cruzi arasında tavuk modeli sisteminde yapılan deneylerde tarafından.

Bağışıklık toleransı

Saf denetim tavuk (A); içeren ayrı koridorları bireysel kafeslerde yetişkin sahne alanı'na büyüdü tavuk grupları halinde yürütülen bağışıklık yanıtı değerlendirilmesi kültür orta (B); ile aşılanmış yumurtadan sahte denetim tavuk yumurtadan ve tavuk yumurtadan T. cruzi trypomastigotes aşısını yumurta (C)26. Yetişkin tavuk B ve C meydan üç kez formalin öldürdü ile gruplar halinde T. cruzi trypomastigote antijen, haftalık, Videoda gösterildiği gibi. ELISA ve IIf deneyleri serum toplanan Grup A, B ve C tavuk bir ay sonra meydan işletilmiştir. Şekil 8 hangi keskin T. cruzi antijen ile aşı B grubunda spesifik antikor üretimi ile tezat Grup A ve C tavuk, spesifik antikor yokluğu gösterir. Sonuçlar açıkça gösterdi bağışıklık toleransı C grubunda yumurtadan T. cruzi-aşı yumurta.

Cinsel iletim Deneyin panosoma cruzi bir fare modeli sisteminde

Ayrıca, T. cruzi infektivite PCR pozitif test ve spesifik antikor yoksun, Chagas hastanın boşalmak üzerinden 100 µL meni instillations erkek farelerin ve aracılığıyla periton boşluğu içine üzerinden gösterilmiştir bir vajina içine telkin sperm eşit miktarda. Beş hafta sonra T. cruzi amastigote yuva kalp ve iskelet kasları tespit edildi ve parazitler ayırt kümeleri vas deferens ve rahim tüp lumen vardı. İlginçtir, yıkıcı inflamatuar reaksiyonları değil surround yuva ve kümeleri T. cruzi amastigotes (Şekil 9).

T. cruzi enfeksiyonları cinsel iletim değerlendirilmesi daha da intraperitoneally 1 x 105 ile T. cruzi Berenice trypomastigotes formlar1,30aşısını fareler iki gruplar halinde yapılmıştır, 31. Ben 10 T. cruzi -10 saf denetim dişi fareler ile evlendirilen erkek enfekte deney grubu içinde. II deney grubu içinde 10 T. cruzi -10 saf denetim erkek ile evlendirilen kadın bulaşmış. Şekil 10 gösteriyor ki T. cruzi-erkek fareler (A-E) enfekte ve T. cruzi -enfekte dişi fareler (F-g) 188-bp nDNA bantları (tek sayı) vermiştir. Sonra yetiştirme, saf arkadaşları (çift sayılar) kolayca bir chagasic arkadaşı ile benzersiz bir cinsel karşılaşma takip T. cruzi satın aldı. Aynı şartlar altında gerçekleştirilen benzer tekrar deneyler doğruladı Bu cinsel bir T. cruziile evlendirilen her saf kadın ya da erkek fare-virüslü erkek ya da dişi flagellate enfeksiyon satın aldı. Bu nDNA pozitif kurucuları (F0) altı hafta yaşına kadar yetiştirdiler Döl oluşturulan. O, test ve kontrol fare kalp ponksiyon bled üzerinden yaklaşık 0.5 mL kan toplamak gerekiyordu bulaşmamış. NDNA-PCR deneyleri 188-bp nDNA bantları (Şekil 11) tarafından gösterildiği gibi cinsel elde Kurucular (F0) enfeksiyonları F1 döl için iletilen gösterdi. F1 Döl nDNA pozitif 41 70 (%58.6) örneklerinin incelenmesi. 9 / 41 (% 22) T. cruzi antikorlar olduğu gibi dikey olarak edinsel enfeksiyonlar, az olarak düşündüren nDNA gruplarla bu fareler.

F1 Döl fareler anestezi altında kurban edildi ve vücut dokuları patolojik ve bağışıklık peroksidaz boyama analizleri tabi tutuldu. Bu deneylerin sonuçlarını Şekil 12' de gösterilen. T. cruzi amastigotes için sonuçları ara epididimlerden hücrelerinin ve goniablasts belgelenmiştir; trypomastigotes ayırt amastigotes yokluğunda inflamatuar reaksiyonları, seminifer tübüllerin lümen yoktu.

Figure 1
Resim 1 . Trypanosoma cruzi hastalık akut Chagas hastalığı ölen bir çocuğun Seminifer tübül içinde . Microphotograph Doktor Teixeira'nın dosyası, 197018. Goniablasts T. cruzi biçimleridir ve amastigotes ve ücretsiz trypomastigotes (oklar) kümeleri yokluğunda inflamatuar infiltratlar1. , Seminifer tübül lümen mevcut Hematoksilen-eozin lekeleri. Bar, 20 µm. Reprinted izniyle yayıncı ve yazar1,19.

Figure 2
Resim 2 . Ayak izi Trypanosoma cruzi akut Chagas hastalığı. 188-nt grup belirli bir radiolabeled 188-nt sonda ile şekil T. cruzi nDNA-PCR güçlendirme ürünleri. TC, T. cruzi; NC, negatif kontrol. Yayıncı ve yazar1izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . Analizini kurutma Güney Trypanosoma cruzi insan çalışma ailelerin bireylerde enfeksiyonları. Aile A - tüm 15 konular 188-nt grup belirli nDNA-PCR gösterdi. Aile B, toplam 35 43 konuların (%81.4) belirli nDNA grup kurdu. Aile C 29 üye arasında 22 (%75.8) nDNA grup kurdu. Aile D 11 21 konular (%52,4) nDNA bantları vardı. T. cruzi-klonlama ve sıralamanın tarafından belirli nDNA bantları doğruladı. Yayıncı ve yazar1izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Etkin Trypanosoma cruzi enfeksiyonları meni boşalmak çalışma aile gönüllüler. NDNA-PCR 188-bp grup tarafından tanımlanan Chagas hastaların cinsel ilißki içinde belgili tanımlık hastalık. TC, T. cruzi olumlu denetim. NC, L. braziliensis negatif kontrol. Yayıncı ve yazar1izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Fenotip Trypanosoma cruzi Chagas hastalığı hastaların serum antikor ile. T. cruzi parazit trypomastigote tanır Chagas serum IgG antikor ile tanımlanan bir FITC etiketli monoklonal Ab karşıtı insan ile IgG tedavi. Anti-T. cruzi Ab LEISHMANIA braziliensis promastigotes kabul etmiyor. İnsets negatif denetimlerini göster. Barlar, 20 µm. Reprinted yayıncı ve yazar1izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 6
Şekil 6 . ELISAs ve nDNA-PCR deneyleri aile içinde grafik gösterimi nüfus çalışma. I grubu (n = 10) ve II grubu (n = 20) negatif kontrol olumlu denetim sera,--dan T. cruzi hastalık ile parasitological gösteri idi. Grup III (n = 31) T. cruziiçin 188-bp nDNA şeritler ve özel antikorlar ile aile konulardan örnekler dahil. Grup IV (n = 52) nDNA-PCR 188-nt amplicons spesifik antikor yokluğunda tarafından algılanan T. cruzi enfeksiyonları ile örnek konulardan oluşur. Grup V (n = 26) vardı aile çalışma enfeksiyon-Alerjik insanlarda oluşan negatif test örnekleri. Yayıncı ve yazar1izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 . Heredograms ve eşleştirme Trypanosoma cruzi- Aile nüfus enfekte. ŞekilT. cruzi antikor ve bu nDNA-PCR deneyleri anti - oranları arasında farklılıklar gösterir. Açık kare ve daire, negatif kadın ve erkek. Kırmızı kareler ve daireler, pozitif anti -T. cruzi antikor ve nDNA-PCR. Siyah kareler ve daireler, PCR yalnız olumlu nDNA. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 8
Şekil 8 . Gelen yumurtadan tavuklarda bağışıklık toleransı Trypanosoma cruzi- aşı yumurta. A) preimmune antikor profil sahte denetim tavuklarda (n = 10). T. cruzi antijen ile meydan B) spesifik antikor yanıt saf denetim olarak tavuk (n = 20). C) belirli bir bağışıklık yanıtı tavuklarda yokluğu yumurtadan T. cruzi-meydan okuma T. cruzi antijen ile sonra aşı yumurta (n = 20). Optik yoğunluk farkı A ve C (024 ± 0.17) B doğru (0,85 ± 0,6) istatistiksel olarak anlamlı (p < 0,05). Bu rakam başvuru26 değiştirildi ve yayıncı ve yazar izni ile yayımlanmaktadır.

Figure 9
Şekil 9 . Enfektif Trypanosoma cruzi insan cinsel ilißki içinde aktif bir fare bulaşmayı çevirir. Aliquots Chagas hasta cinsel ilißki, periton boşluğuna veya vajina farelerin telkin. Fare korumak sonra üç hafta kurban edildi. En iyi yolu, T. cruzi amastigotes yuva (solda) kalp ve iskelet kası (sağda). Alt lane, T. cruzi amastigote yuva vas deferens (solda) ve rahim tüp (sağda). INSERT bölen amastigote (Daire) gösterir. Doku bölümlerde inflamatuar infiltratlar yokluğu dikkat edin. Hematoksilen-eozin lekeleri. Barlar: üst ve alt sol, 20 µm; sağ alt, 10 µm. Reprinted yayıncı ve yazar1izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10 . Cinsel iletim Trypanosoma cruzi enfeksiyonları fare modeli sistem tarafından ilişki. Chagasic T. cruzi bulaşan saf arkadaşları Güney hybridizations ortaya belirli nDNA 188-bp bantları gösterdiği için iletim. Enfekte T. cruzi -fareler ve saf farelerin PCR güçlendirme ürünlerinin en iyi lane) Prebreeding profilleri. T. cruzitek sayıları gösterir-A E erkek ve kadın F-için-ben fare örnekleri bulaşmış. Çift sayılar saf erkek (2-10) ve erkek (12-20) fareler vardır. Alt lane, yetiştirme, alınan fareler 2-20 T. cruzi enfeksiyonlar bile profilleri göstermek sonra. Yayıncı ve yazar1,30izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 11
Şekil 11 . Trypanosoma cruzi enfeksiyon dikey olarak F1 Döl fareler için F0 chagasic ebeveyn transfer. Chagasic üst bir tek üreme karşılaşma tarafından T. cruzi enfeksiyonlar iletilen. T. cruzi-virüslü kadın saf erkek AE şeklindeki ve saf kadın F-J. enfekte T. cruzi -erkek şeklindeki Sonra yetiştirme, pozitif protozoon nDNA-PCR 188-bp grubun tüm kurucuları (F0) gösterdi. Southern blot belirli nDNA grup hibridizasyon sonra F1 çöp çoğunluğu radiolabeled 188-nt soruşturma ile ortaya koydu. NC, L. braziliensis negatif kontrol; TC, T. cruzi olumlu denetim. Yayıncı ve yazar1,31izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 12
Şekil 12 . Belgelenen histopatoloji Trypanosoma cruzi cinsel yolla bulaşan F0 gelen F1 Döl ve bağışıklık toleransı inflamatuar reaksiyon yokluğunda için. Bölümleri epididim, goniablasts ve F1 farelerin seminifer tübüllerin T. cruzi formları büyüme gösterir. Fareler anestezi altında kurban edildi ve bağışıklık peroksidaz lekeli bölümleri mikroskop altında incelenmiş. Photomicrographs kahverengi bağışıklık peroksidaz lekeli T. cruzi göstermek içinde ara epididimlerden ()A, amastigotes) ve amastigotes trypomastigotes, seminifer lümen dökmek içine ayırt kümeleri tübül (B, C ve F). Bir goniablast (D) görülen amastigote yuvası. Pozitif kontrol fare Seminifer tübül normal Histoloji (E). Chagas parazitleri bir sürü gösterilen F1 farelerin testislerde inflamatuar infiltratlar yokluğu dikkat edin. Giemsa'nın leke. Barlar: A, B, C ve E, 20 µm; D ve F, 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. Pozitif IIf ve ELISA sınavları oranları ve bu örneklerde nDNA-PCR deneyleri arasında tutarsızlıklar toplanan insan çalışma aileler A-için-D *

Gruplar ** ELISA: serum anti-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA-PCR (%)
Denetim Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - denetim Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III - Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28,4 31/109 28,4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
V - Chagas Alerjik Ab - PCR- 26/109 23,9 26/109 23,9
(n = 26)
* 1, 2 ve 3 yıl üç farklı durumlarda aracılığıyla toplanan örneklerinde üç bağımsız ELISA ve nDNA-PCR deneyleri sonuçlarını çalıştırın. [1]. 188-nt T. cruzi DNA amplifikasyon tekrar teyit klonlama ve sıralamanın tarafından.
** (Grup ı ve V) negatif ve pozitif konular (Grup III ve IV) arasında farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı (p < 0,05) vardır.
ᵟ Grup III ve immün tolerans T. cruzi antikor yokluğunda açıklanabilir IV arasındaki tutarsızlıkları %62.6 (52/83) PCR olumlu konuların elde etti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, ister insan Chagas hastalığı cinsel yolla bulaşan ilkinde T. cruzi kaynaklanıyor soruya cevap bir aile esaslı araştırma Protokolü tartışmak enfeksiyonlar. Kullanılabilir veri ve Chagas hastalığı hakkında bilgi ayrı ayrı tek tek3,4elde edildi çünkü erken çalışmalar T. cruzi enfeksiyonların cinsel iletim kanıtı muhtemelen sağlayabilir değil, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. T. cruzi bulma Seminifer tübül bir çocuğun (Şekil 1) klinik ve epidemiyolojik araştırma mahmuzlu kıvılcım oldu. Birkaç on yıl sonra makul aile eğitim gördüğünüzde yaklaşımlar ve bu araştırma protokol için açıklanan teknolojiler mevcuttu, T. cruzi yaşam döngüsü aşamaları insan boşalmak1,19' ortaya çıktı.

Protozoon 21 akut Chagas hastalığı durumlarda doğrudan parasitological gösteri belirli Grup örnekleri akut T. cruziile enfekte konulardan oluşan nDNA-PCR güçlendirme ürünleri doğrulamak için çok önemli oldu. Bu bakım noktası laboratuvar işaretleyici immünolojik ve nükleik asit deneyleri sonuçları değerlendirildi. Temel uzun vadede Chagas hastalığı aile çalışma, bu nedenle, bu Laboratuvar hayvanlarının gruplar halinde elde edilen bulgular insanlarda birleştirir. O T. cruzi ilk kez ortaya protokolüne göre araştırma yaptı enfeksiyonları cinsel insanlar1' iletilen.

NDNA ayak izleri çoğunluğu belirli T. cruzi anti in yokluğunda cinsel yolla bulaşan çalışmalarından sonuçlandı parazit özgü antikor deneyleri oranları ve bu nükleik asit testler arasındaki geniş fark gösterir antikorlar. Böylece, T. cruzi cinsel iletim yokluğunda, spesifik IgG antikor pozitif nDNA sergilenmesi aile üyeleri olarak bağışıklık toleransı nedeniyle oldu.

İmmün tolerans gösterildiği bir tavuk modeli sistemi T. cruzi enfeksiyonlara karşı ateşe dayanıklı embriyo büyüme1,25,26,32,33ilk hafta sonra, 34. Bundan sonra olgunlaşmamış bağışıklık sistemin yetersizlik vücudun yabancı bir bileşeni tavuğun geç olgun bağışıklık sistemi tolerans doğru belirtildiği gibi parazit tanımak için T cruzi. Bu sonuçlar ışığında hoşgörü bağışıklık sistemin kendini tanıma ve bakım altında fizyolojik şartlarda25,26, , kendi vücut bileşenlerinden kaynaklanan bir doğal olay1 olduğunu. 32 , 33 , 34. bağışıklık toleransı otoimmün Chagas kalp hastalığı ile durumunu dan bu nedenle efektör hücre değişiklikler T. cruzi kinetoplast (kDNA) mutasyonlar ana bilgisayarın genom1 kaynaklanan ile ilişkili olabilir ,2,14,23,25,26.

Araştırma protokolündeki kritik adımlar ana teknik değişiklik ve cinsel yolla bulaşan Chagas parazitler1,14,23,25ifşa için sorun giderme açıklar, 26: ben) çalışma aileler akut Chagas hastalığı35,36; vaka ile seçme vahşi-türü T. cruzi akut durumlarda kandan, II) izole; L. braziliensis III) alma DNA örnekleri ailelerinin katılımcıları kan flagellates, Berenice T. cruzi güzel örneği, pozitif deidentified banka DNA örnekleri ve negatif kontrol; katılımcıların flagellates nDNA ayak izi Berenice T. cruzi güzel örneği ve olumlu banka DNA örnekleri için özdeş olduğunu ispat için IV) performans gösteren düzenli teknik prosedürler; üç kez bir yıl arayla T. cruzi enfeksiyonlarının tedavisinde aile üyeleri göstermek için çalışan bağımsız onaylatılacak nDNA footprinting v); VI) bakım noktasında yürütülen nDNA-PCR tekniği soran kişi tarafından klonlama ve belirli astar komplementer amplicons sıralama sonuçları verir garanti ayarlar, böylece sürekli olarak gösterilen T. cruzi 188-nt sıra 1,25,28,29,30; VII) antikor titreleri hala içinde serum numuneleri üç farklı zaman noktalarda; toplanan yeniden üretmek için yüksek kaliteli marka reaktifler kullanarak VIII) aile çalışma protokolü Chagas parazit bulaşmış toplanan sperm cinsel ilißki belirli serum antikor mevcut canlı enfeksiyonu T. cruzi nDNA yokluğunda gösteri üzerine germ hattı hücrelerdeki saptandı. bireyler1; IX) perspektif olduğunu araştırma Protokolü cinsel yolla bulaşan çözülmeye tasarlanmış T. cruzi enfeksiyonlar ifşa otokton Chagas hastalığı beş kıtada; x) güvenli nDNA ve kDNA ayak izleri insanlar1,2kronik asemptomatik Chagas hastalığı tanısı; XI) nDNA yokluğunda, mutasyonT. cruzi kDNA sıra1,2,23,25,26 yalnız bir laboratuvar için belirtecidir İdiyopatik dilate kardiyomiyopatiler23,25,37,38,39ayırıcı tanı ulaşmak.

Ayrıca, Chagas hasta cinsel ilißki içinde belgelenen öldürücü T. cruzi korumak fare vajina ve peritoneal kavite içine üzerine yaygın enfeksiyon başlatılıyor yeteneğine sahip. Patoloji çalışma T. cruzi amastigote yuva kalp ve iskelet kasları de vaz deferens ve rahim tüp gibi gösterdi. İlginçtir, parazit yuva hayati üreme fonksiyonları engel inflamatuar reaksiyonları kışkırtmak değil. İnflamatuar reaksiyonları yokluğu hayati fonksiyonel vücut yapıları40,41,42,43,44,45 bağışıklık ayrıcalık oluşturur ve bu nedenle T. cruzi uncurbed büyüme üreme organlarında açıklar.

Ayrıca, saf arkadaşları ile yetiştirilen chagasic Farelerde deneysel çalışmalar daha fazla cinsel iletim insanlarda T. cruzi enfeksiyonların açıkladı. Virüslü dişi ve erkek hastalık bulaşmamış tek saf arkadaşları T. cruzi enfeksiyonlara ilişki sırasında aktarılan ve dikey üst nesneden döl için transfer T. cruzi onların çöp çoğunluğu elde. Bu deneylerde, T. cruzi büyüme tüp rahim, olduğu gibi ve Seminifer tübül ve vas deferensbağışıklık ayrıcalık gerçekleştiği, ilk aşama anılacaktır. O zaman, cinsel iletim meni veya vajina içine rahim salgıları paraziter aşamalarla oluştu. Bağışıklık ayrıcalık40,41,42,43,44,45 tümleyici bazı organlara (üreme sistemi, göz ve beyin) sağlayan bir olgudur inflamatuar reaksiyonları ve zarar görmemesi için önemli, hassas ve belirli işlevleri40. Hormonlar41 ve birkaç bağışıklık faktörler tümleyici makrofajlar41,42,43, doğal katil hücreler41, T-lenfositler ve T-Düzenleyici (Treg) hücreleri, böylece düzenlediğini birkaç proinflamatuar sitokinler ve bağışıklık-ayrıcalık Tetikleyicileri40,41,42,43,44,45inhibisyonu.

Kadın ve erkek saf ortaklara T. cruzi enfeksiyonları cinsel iletim Chagas hastalığı kontrolünü Uluslararası dayanışma gerektirdiğini gösterir. Burada tartışılan sonuçları daha yaratıcı araştırma gereklidir öneririz. Şu hemen hedefleri ulaşılabilir: ben) özel ve cinsel ilişki ile bulaşan enfeksiyonların önlenmesi için hedef doğru bir tanı ulaşmak için son derece hassas nükleik asit test için yüksek üretilen iş platformlar geliştirmek için kan nakli ve organ nakli gibi tanı ve Chagas hastalığı yaygınlığı belirlemeyi klinik ve epidemiyolojik sorular kolaylaştırılması; T. cruzi enfeksiyonları ortadan kaldırılması için yeni ilaç almak için kadınlarında ilaç geliştirme programı tanıtmak için II); ve III) kiliseler uygulamak için uygun eğitim, okul, katılımı içeren bilgi ve iletişim program, sosyal kuruluşları ve Chagas hastalığı yayılmasını önlemek için sağlık kuruluşları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Biz laboratuvar olanakları ve kritik yorum Izabela Dourado, Carla Araujo, ve zeki Gomes ve Bruno Dalago ve Rafael Andrade teknik yardım kabul edersiniz. Bilim ilerleme (FAPDF), Ulusal Araştırma Konseyi, Bakanlığı Bilim ve teknoloji (CNPq/MCT) için temel ve ajansı için eğitim insan kaynakları, Milli Eğitim Bakanlığı için borçlu olduğumuzu (burunları / beni), bunlar desteklemek için Brezilya, araştırmalar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 143 Aile çalışma, Trypanosoma cruzi sperm cinsel ilißki rahim salgısının fare modeli sistemi dikey iletim bağışıklık ayrıcalık tavuk modeli sistemi bağışıklık toleransı Chagas hastalığı.
Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter