Summary
L’objectif de cette technique consiste à préparer une culture fortement enrichie des motoneurones primaires (MNs) de moelle épinière murine. Afin d’évaluer les conséquences des mutations responsables de maladies MN, nous décrivons ici l’isolement de ces isolés MNs et leur transfection par magnétofection.
Abstract
Neurodégénérescence des motoneurones spinaux (MNs) est impliquée dans un large éventail de troubles neurologiques comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth et amyotrophie spinale, qui sont tous associés à une atrophie musculaire. Les cultures primaires de MNs de la colonne vertébrale ont été largement utilisés pour démontrer l’implication des gènes spécifiques à ces maladies et de caractériser les conséquences cellulaires de leurs mutations. Cette culture de modèles une MN premier protocole dérivé de l’ouvrage fondateur de Henderson et ses collègues il y a plus de vingt ans. Tout d’abord, nous détaillons une méthode de dissection des cornes antérieures de la moelle épinière d’un embryon de souris et isoler la MNs de cellules à l’aide d’un gradient de densité voisines. Puis, nous présentons une nouvelle façon de transfectants efficacement MNs avec des plasmides d’expression à l’aide de magnétofection. Enfin, Nous illustrons comment réparer et réagissent primaire que mns. à l’aide des mutations de neurofilaments qui causent la maladie de Charcot-Marie-Tooth type 2, le présent protocole montre une approche qualitative pour exprimer les protéines d’intérêt et d’étudier leur implication dans Croissance de MN, entretien et la survie.
Introduction
Maladies neuromusculaires englobent une variété de pathologies cliniquement et génétiquement distinctes qui sont caractérisées par l’altération du muscle ou le système nerveux. En raison des progrès dans les technologies de séquençage, des centaines de gènes responsables de ces maladies rares ont été identifiées au cours de la dernière décennie (liste disponible à le Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variété des mutations identifiées indique que différentes mutations dans un gène unique peuvent provoquer différents phénotypes et maladies1,2,3 et que les mutations dans les gènes différents peuvent produire des phénotypes semblables 4 , 5. dans ce contexte, il y a des efforts pour développer des modèles cellulaires qui peuvent devenir de puissants outils pour analyser les conséquences de la mutation et de mécanismes pathologiques.
La colonne vertébrale MNs ont grands somas situés dans les cornes ventrales de la moelle épinière, les axones longs forme afin de cibler les fibres musculaires squelettiques et permettre des mouvements volontaires par le biais de la libération d’acétylcholine au niveau des jonctions neuromusculaires. Étant donné que les MNs sont affectés par des maladies neuromusculaires comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et l’atrophie musculaire spinale, Dr Henderson et ses collègues ont mis au point le premier protocole6 qui a permis à la culture de in vitro MNs de la colonne vertébrale et la découverte de neurotrophic factor GDNF7 (facteur neurotrophique dérivé de cellules gliales). Perfectionnements techniques depuis lors ont permis pour la purification plus précise de MNs de la colonne vertébrale et leurs sous-types utilisant FACS8, mais l’enrichissement par gradient de densité reste puissant et largement utilisé dans les laboratoires travaillent actuellement avec primaires MNs de la colonne vertébrale 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. par la suite, il est également possible d’obtenir un grade supérieur de purification MN par immunopanning en profitant du marqueur de surface p75(NTR)15,16,17.
La moelle épinière contient différents sous-types de MNs cervicales, thoraciques et lombaires, ainsi que des colonnes moteurs médians et latéraux qui varient selon leur situation dans la corne antérieure sur un axe dorso-ventral et parmi les cibles qu’ils innervent8, 18. les cultures primaires MN peuvent récupérer toutes ces sous-types de MN dans des proportions physiologiques. La principale limite de cette technique est le faible nombre de MNs obtenus à la fin de la procédure ; en fait, on peut s’attendre à obtenir environ 105 MNs de six embryons, qui convient pour la microscopie, mais limite pour des expériences de biochimie. D’effectuer des expériences avec plus standardisés sous-types et MNs abondantes (> 106 cellules), embryonnaire cellules souches dérivées MNs il faudrait18.
Transfection de sauvage-type/mutant transgènes ou gènes endogènes défiant dans MNs primaires est un outil rapid et utile pour décrypter les voies physiopathologiques, surtout quand les modèles de souris ne sont pas disponibles. Magnétofection est une technique pour la transfection neurones primaires, semblables à lipofection sans la neurotoxicité connexe. En outre, transfection peut être réalisée sur les neurones matures après plusieurs jours in vitro, à la différence des techniques basées sur l’électroporation9. Cependant, un inconvénient de cette technique est que les perles lient les acides nucléiques dans la culture, provoquant des bruits par marquage au DAPI. Infection virale est probablement la technique la plus efficace pour transfectant MNs ; Toutefois, magnétofection ne nécessite pas de certaines procédures de sécurité nécessaires à la production virale et cellulaire infection.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été acceptées par le Comité d’éthique de l’institution.
1. préparation de la solution
- Préparer 10 mL de 4 % BSA dialysée dans un milieu L-15.
- Dissoudre la poudre de l’albumine sérique bovine à 4 % (p/v) dans 10 mL de milieu de L-15.
- Ajouter la solution d’une cassette de dialyse de 20 mL avec un cut-off 20 kDa. Dialyser contre 500 mL de milieu de L-15 pendant 3 jours sous agitation à 4 ° C. Changer le support de L-15 tous les jours.
- Filtrer la solution à travers un 0,22 µm membrane et partie aliquote en tubes de 15 mL. Stocker les tubes à-20 ° C.
Remarque : Ce protocole utilise les références suivantes : non modifié brut moyen de L-15 = L-15 moyen, milieu acide de L-15 = pH L-15 et milieu basique de L-15 = L-15 de Bicarbonate.
- Préparation de 200 mL de pH L-15.
- Ajuster le pH du milieu L-15 : tout d’abord, remplir un flacon laveur avec quelques morceaux de glace sèche. Injecter du gaz (CO2) dans le milieu de L-15 jusqu'à ce que la couleur devient orange (~ pressions pH 6,4 et environ 40). Le pH peut être également ajusté avec un pH-mètre standard.
- Filtrer le milieu à travers un 0,22 µm membrane et conserver à 4 ° C pendant un mois.
- Préparer 100 mL de Bicarbonate de L-15.
- Ajouter 2,5 mL de bicarbonate de sodium de 7 % à 97,5 mL de milieu de L-15 et de conserver à 4 ° C.
- Préparer les suppléments IPCS (insuline Putrescin Conalbumine Sélénite).
- Dissoudre 2,5 mg d’insuline dans 0,5 mL de 0,1 M HCl. ajouter 4,5 mL d’eau bidistillée.
- Dissoudre 8 mg de putrescine dans 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Dissoudre 100 mg de conalbumine dans 10 mL de PBS.
- Dissoudre 1 mg de sélénite de sodium dans 19,3 mL d’eau, ajuster le pH à 7,4 et diluer la solution 10 fois.
- Mélanger 1 mL de solution d’insuline, 1 mL de solution de la putrescine, 1 mL de la conalbumine et 0,1 mL de solution de sélénite de sodium pour obtenir 3,1 mL de solution de complément de pisc. Conserver la solution à-20 ° C.
- Préparer une solution de progestérone de 0,02 mM.
- Dissoudre 1 mg de progestérone dans 1,6 mL d’éthanol à 80 %.
- Diluer la solution 100 fois à 100 % d’éthanol et de conserver à-20 ° C.
- Préparer 100 mL de milieu de L-15 complet.
- Ajouter 1,8 mL de solution de D-glucose (200 mg/mL) à 92 mL de pH L-15 d’obtenir une concentration finale de 3,5 mg/mL de glucose.
- Mélanger 1 mL de 100 x la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL), 2 mL de sérum de cheval inactivés par la chaleur, 3,1 mL du mélange de pisc et 0,1 mL de solution de progestérone (2 x 10-5 M).
- Filtrer le milieu sur une membrane de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
- Préparer 5 mL de solution gradient de densité (concentration finale de 5,5 %) par l’expérience.
- Ajouter 476 µL de milieu dégradé 60 % densité commerciale à 4524 µL de L-15 (si possible, sans phénol rouge pour augmenter le contraste visuel à l’interphase ; taux de dilution de 1:10. 5).
- Conserver la solution à 4 ° C pendant 2 semaines ou le congeler à-20 ° C.
- Préparer 10 mL de milieu de culture.
- Ajouter 200 µL de milieu de supplément à 9,6 mL de milieu de culture cellulaire neurone.
- Ajouter 200 µL de sérum de cheval inactivés par la chaleur (qui tend à différencier les œuvres contre la prolifération et les précurseurs des cellules gliales) à 25 µL de glutamine et 10 µL de 2-mercaptoéthanol.
- Filtrer les médias à travers un filtre de 0,22 µm.
- Ajouter les facteurs neurotrophiques suivants : facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) à une concentration finale de 10 ng/mL et le facteur neurotrophique dérivé cerveau (BDNF) et facteur neurotrophique dérivé de cellules gliales (GDNF) à la concentration finale de 1 ng/mL.
- Stocker les médias à 4 ° C.
- Préparer 50 mL de médias de dissection.
- Ajouter 2,25 mL de glucose (200 mg/mL) à 47,05 mL de HBSS. Ajouter 700 µL de 1 M HEPES avec pH 7,4. Stocker les médias à 4 ° C.
- Préparer une solution PFA de 4 %.
- Dissoudre 20 g de l’IFP dans 500 mL de PBS.
- Sous une hotte chimique, chauffer la solution à 60 ° C et ajouter quelques gouttes de 1 NaOH M jusqu'à ce que la solution devienne claire.
- Filtrer la solution sur un papier filtre et ajuster le pH à 7,2. Conserver à-20 ° C.
Remarque : Vous pouvez également autres solutions commerciales de PFA peuvent être utilisées et diluées à 4 % dans du PBS.
- Nettoyer les outils de dissection, y compris les pinces et ciseaux plats silicone avec l’éthanol à 70 % avant utilisation et avec du savon et l’eau claire après utilisation.
2. poly-ornithine/laminine (Po/L) plat enduit
Remarque : Les Volumes sont adaptés à manteau une plaque 24 puits.
- Si nécessaire, mettez un lamelle couvre-objet stérile 12 mm dans le puits.
- Recouvrir les puits avec 500 µL de solution de 10 µg/mL Poly-L-Ornithine, dissous dans l’eau.
- Laissez les puits à régler à la température ambiante pendant 1 h.
- Enlever la solution de la Poly-L-Ornithine et sécher à l’air pendant 30 min.
- Enrober les puits pendant une nuit à 37 ° C, avec 500 µL de 3 µg/mL laminine dans bicarbonate de L-15.
Remarque : Les puits peuvent être stockés à 37 ° C pendant 7 jours dans l’incubateur. Pour longue d’incubation, ajout de PBS stérile entre les puits peut aider à éviter l’évaporation moyenne.
3. dissection
- Sacrifier une souris enceinte lorsque les embryons sont au stade embryonnaire E12.5. Nettoyer le ventre avec l’éthanol à 70 %.
- Enlever l’utérus en coupant les deux oviductes et le vagin et le mettre dans un plat de pétri bac à froid (sans Ca2 + Mg2 +).
- Recueillir tous les embryons et de les transférer aux frais, froid PBS (sans Ca2 + Mg2 +) dans une boîte de pétri.
- Mettre un embryon dans un plat recouvert de silicone et plein de médias de dissection (avec HBSS, 4,5 g/L de glucose et de 7 mM HEPES pH 7,4).
NOTE : Dissection de l’embryon est réalisée sous microscope à l’aide de ciseaux et pinces fines propre. Alternativement, une boîte de pétri régulière sans silicone peut être utilisé pour la dissection. - Enlever la tête, queue et viscères, à l’aide de pinces comme des ciseaux.
- Maintenir l’embryon avec le ventre contre le silicone avec une pince.
- Avec une deuxième paire de pinces, insérez l’un des conseils dans le canal central de la moelle épinière rostrale.
- Fermer la pince pour déchirer le tissu dorsal de quelques millimètres.
- Répétez cette opération vers le côté caudal jusqu'à ce que l’ensemble de la moelle épinière est ouverte (Figure 1 b).
- Détacher la partie rostrale de la moelle épinière (tronc cérébral) du corps.
- Tourner l’embryon afin de maintenir la colonne vertébrale ouverte contre le silicone.
- Pincez la partie rostrale de la moelle épinière et tirez l’embryon de la tête pour en extraire la moelle épinière.
NOTE : Méninges et les ganglions rachidiens (DRGs) doivent rester attachés à l’embryon. Sinon, tirez doucement loin tout restant méninges DRGs encore attachés à la moelle épinière. À cette étape, DRGs pourraient également être collectées pour la culture de neurones sensibles (voir Discussion). - Aplatir la moelle épinière sur le silicone et enlever la moitié dorsale de la moelle en coupant la ligne médiane de chaque côté à l’aide d’un scalpel. Couper la partie centrale en 10 morceaux à l’aide d’un scalpel et transférer les morceaux dans un nouveau tube.
4. Suspension de cellules de la moelle épinière de
- Répétez cette procédure de dissection pour 6 à 8 moelles épinières.
- Laissez la moelle épinière pièces recueillent au fond du tube et remplacement le HBSS avec 1 mL de milieu Ham-F10.
- Ajouter 10 µL de la trypsine (2,5 % w/v ; concentration finale 0,025 %). Incuber le tube pendant 10 min à 37 ° C.
- Pour arrêter la digestion enzymatique, transférer les fragments dans un nouveau tube de 15 mL contenant 800 µL de milieu L-15 complet, 100 µL de 4 % (p/v) BSA et 100 µL de DNase (1 mg/mL dans le milieu de L-15).
- Triturer deux fois en aspirant 1 mL à l’aide d’une pipette P1000. Laissez les fragments se contenter de 2 min. à frais virés le surnageant dans un tube frais 15 mL.
- Pour les fragments, ajouter 900 µL de milieu L-15 complet, 100 µL de 4 % (p/v) BSA et 100 µL de DNase (1 mg/mL dans le milieu de L-15).
- Triturer 6 fois en aspirant 1 mL à l’aide d’une pipette P1000. Laissez les fragments se contenter de 2 min. ajouter le surnageant dans le tube de 15 mL obtenu à l’étape 4.5.
- Pour les fragments, ajouter 900 µL de milieu L-15 complet, 100 µL de 4 % (p/v) BSA et 100 µL de DNase (1 mg/mL dans le milieu de L-15).
- Broyer 10 fois en aspirant 1 mL à l’aide d’une pipette P1000. Laissez les fragments se contenter de 2 min. ajouter le surnageant dans le tube de 15 mL obtenu à l’étape 4.5. Aller de l’avant avec le surnageant.
- À l’aide d’une pipette P1000, Placez délicatement un coussin de 4 % (p/v) de BSA 2 mL au fond du tube surnageant. Centrifuger à 470 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 2 mL de milieu de L-15 complet.
5. MN enrichissement de densité de Gradient
- Diviser la suspension cellulaire en deux tubes de 15 mL (1 mL chacune). Ensuite, ajouter 2 mL de milieu de L-15 complet. Si à partir de 6 embryons, utilisez l’équivalent de 3 embryons par tube dans 3 mL de milieu.
- Ajouter 2 mL de solution de gradient de densité en ajoutant lentement la solution au fond de chaque tube pour obtenir une interface nette.
- Centrifuger à 830 x g pendant 15 min à température ambiante. Après cette étape, les petites cellules devraient être au fond du tube, que grandes cellules tels que MNs convient à l’interface de solution/médium gradient de densité.
- Recueillir les cellules à l’interface par l’aspiration de 1 ou 2 mL et transférez-les sur un tube frais 15 mL. Réglez le volume à 10 mL avec le milieu à pH L-15.
- Ajouter 2 mL de la bulle du BSA 4 % le fond du tube et centrifuger à 470 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de L-15 complet.
- Répétez l’étape 5.5.
- Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de milieu de culture complet. Compter le nombre de cellules et de la viabilité dans un microscope à contraste de phase avec un hémocytomètre.
NOTE : Pour 6 moelles épinières, le nombre de cellule devrait être environ 1 x 105 MNs.
6. MN Culture
- Diluer la MNs à la densité appropriée, habituellement de 5 000 à 10 000 cellules dans 500 µL de milieu de culture par puits dans une plaque 24 puits.
Remarque : La densité de semis sont autour de 30 000 et 1 500 cellules pour 6 et 96-plats, respectivement. - Enlever la solution de la laminine avec un P1000.
- Transférer immédiatement la MNs diluée dans le milieu de culture dans les plaques de revêtement afin d’éviter le séchage.
- Incuber la culture pendant 2 jours à 37 ° C.
7. Magnétofection de MNs
Remarque : Dans les étapes suivantes, les quantités utilisées sont destinées pour la transfection d’un puits d’une plaque 24 puits. S’il vous plaît se référer au protocole du fabricant pour un autre format.
- Pour la préparation de l’ADN, resuspendre 1 µg d’ADN dans 50 µL de milieu de culture neuronale et vortexer pendant 5 s.
- Pour la préparation du tube de perle, resuspendre 1,5 µL de perles dans 50 µL de milieu de culture neuronale.
- Ajouter le 50 µL de solution de perle à la solution d’ADN de 50 µL et incuber pendant 20 min à température ambiante (volume total = 100 µL).
- Durant cette incubation, retirer le puits ne sera transfecter 100 µL de milieu de culture.
Remarque : Mettre la plaque magnétique dans l’incubateur pour le réchauffer à 37 ° C. - Transférer 100 µL du mélange ADN/perle dans le puits et incuber la plaque 20 – 30 min sur la plaque magnétique à 37 ° C.
- Attendre au moins 24h avant la détection de l’expression de cDNA.
8. fixation et coloration
- Laver la culture 2 fois avec du PBS.
- Incuber la culture pendant 20 min à température ambiante dans 4 % PFA/PBS.
- Laver la culture 2 fois avec du PBS.
- Incuber la culture en 500 µL de tampon de blocage (PBS, 4 % de BSA, sérum normal de 2 %, 0,3 % Triton X-100, glycine de 0,1 M) pendant 1 h à température ambiante.
Remarque : Un sérum Normal doit être dérivé de la même espèce que l’anticorps secondaire (p. ex., sérum de chèvre Normal). - Incubez la culture pendant la nuit à 4 ° C avec l’anticorps primaire dilué dans 250 µL de tampon de blocage.
NOTE : par exemple, TUJ1 est utilisé à 1/1000, SMI32 est utilisé à 1/1000, et Lc3b est utilisé à 1/200. - Laver la culture 3 fois avec du PBS.
- Incubez la culture avec l’anticorps secondaires conjugué à un fluorophore dilués dans 250 µL de tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver la culture 3 fois avec du PBS.
- Monter sur des lames de verre à l’aide du milieu de montage.
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Representative Results
Après 24 heures dans la culture, motoneurones (MNs) devraient déjà montrer la croissance axonale significative (au moins 6 fois plus longue que la taille de soma). Dans les jours suivants, axones devraient continuer à croître et afficher la ramification (Figure 2). Il y aura différentes morphologies en raison des spécificités de sous-type. Par exemple, colonne médiane MNs qui innervent les muscles axiaux ont des axones plus courtes et plus ramifiés que MNs colonne moteur latéral qui innervent les muscles de membre18.
Ces isolement et culture des techniques décrites ci-dessus ont récemment été utilisés pour caractériser une nouvelle mutation dans le gène de neurofilaments NEFH qui provoque une forme axonale autosomique dominante de CMT13. Dans ce cas, deux jours après l’ensemencement, MNs purifiées ont été transfectées avec les plasmides codant une forme mutante de NEFH fondue à eGFP ou fondue à eGFP forme sauvage. Deux jours plus tard, mutant NEFH-eGFP forme des agrégats le long du réseau du cytosquelette. Quatre jours après magnétofection, ces agrégats a évolué dans un aggresome éminent périnucléaire contenant le marqueur autophagique LC3b (Figure 3). Cette approche nous a permis de démontrer que la forme mutante de NEFH induit la formation d’agrégats qui sont associés avec les voies autophagiques MNs primaires.
Figure 1 : vue d’ensemble des étapes principales de la procédure. (A) E12.5 des embryons de souris sont disséqués pour extraire la corne ventrale de la moelle épinière. Ensuite, les neurones provenant des cellules de la corne ventrale sont dissociées et MNs sont purifiés par gradient de densité avant l’ensemencement. Enfin, les MNs sont transfectées par magnétofection et analysés après quelques jours. (B) la première étape dans la dissection de la moelle épinière est l’ouverture de la plaque de toit de la moelle épinière le long de l’axe rostro-caudal avec une pince. Ensuite, la moelle épinière est détachée du corps en tirant sur le tronc cérébral. À ce stade, méninges et les ganglions rachidiens (DRG) demeurent sur le corps de l’embryon. La partie dorsale de la moelle épinière est coupée longitudinalement avec un scalpel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : la culture représentant MN. (A) la morphologie MNs après 4 jours de la culture a révélé par coloration de chaîne lourde endogène neurofilaments non-phosphorylés (SMI32). Echelle = 100 µm. (B) la morphologie MNs après 4 jours in vitro et transfectées pour eGFP transgène par magnétofection au jour 2. MNs étaient eosine avec le marqueur SMI32 ou le marqueur neuronal pan Tuj1. Les flèches indiquent les somas des neurones. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images confocales de magnetofected MNs exprimant eGFP-NEFH sauvage ou mutant construit (en vert) et colorés pour le marqueur autophagique LC3b (en rouge). Les flèches montrent mutant eGFP-NEFH des agrégats de protéines qui sont également LC3b positif. Echelle = 10 µm. les Images sont modifiées de Jacquier et coll. 2017, Acta Neuropathologica Communication13.
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Discussion
Un des points critiques de ce protocole est que les embryons de souris sont disséqués à une fenêtre de temps précis au cours du développement (E12.5) afin d’optimiser la quantité de MNs obtenus à la fin. En outre, pour un rendement optimal, la dissection doit être effectuée le matin ou tôt dans l’après-midi. Avant E12.5 (par exemple, à E11.5), la dissection est difficile, surtout en ce qui concerne l’élimination des méninges. Après E12.5, le nombre de MNs obtenus diminue significativement. Pour contrôler le stade embryonnaire du développement, les mâles et les femelles adultes sont d’abord placés ensemble à la fin de la journée. Le lendemain matin, les adultes sont séparés, et les femelles sont vérifiées pour la présence d’un bouchon vaginal. Si une fiche est présente, les embryons sont réputées à ce stade être E0.5 jour du développement. Pour ces expériences, nous utilisons généralement une lignée de souris qui est vigoureux et productif. Cellules souches provenant d’une colonie de race dans le Missouri ont été utilisés dans le présent protocole, et la souche a été nommée CF1 (Carworth Farms souche 1). Cette souche a été introduite en France de Charles River Laboratories en 1967, et il a acquis le nom de de1 (Oncins France 1).
Un deuxième point critique est les étapes de centrifugation qui influent grandement sur la pureté de la culture. MNs représentent un faible pourcentage des cellules médullaires (environ 1 %), et le but est d’obtenir une culture contenant MNs de 40 à 50 % chez les autres neurones spinaux et des progéniteurs de cellules gliales moins de 5 %. Pour contrôler l’efficacité des centrifugations, acquis avant et après chaque étape peut être plaqué dans un milieu MNs pendant 24 heures, des échantillons de suspension de cellules suivie de fixation et de coloration pour l’expression des marqueurs de motoneurones Hb9 (81.5C10, DSHB) ou Islet-1/îlot-2 (ISL1 / 40.2D6 2, /39.4D5, DSHB), dont les combinaisons définissent différents MNs sous-population19. Sur MNs plus matures, autres marqueurs comme la Choline acétyltransférase (CHAT, Ab144P) ou H de Neurofilaments non-phosphorylés (SMI - 32P) permet d’estimer la qualité de la culture. Une bonne alternative pour rapidement suivi de l’efficacité de la purification consiste à utiliser des souris transgéniques exprimant le protéine fluorescente verte (GFP) spécifiquement en MNs. Par exemple, Wichterle et collègues ont déjà développé des souris transgéniques exprimant la GFP sous le contrôle de la souris Hb9 (également appelé Hlxb9 ou Mnx1) promoteur18. Hb9::GFP souris transgéniques affichent expression distincte de GFP dans les dendrites et axones somas de la colonne vertébrale MNs d’embryonnaire jour 9,5 à jour après la naissance, 10.
MNs exigent la croissance sur un substrat permissive obtenue par la Poly-L-Ornithine et le revêtement de la laminine. Selon les conditions expérimentales, une variété de plastique, polymère et récipients à base de verre peut être utilisée (par exemple, -6, 24, plaques à 96 puits, lamelles couvre-objet en verre ou diapositives de chambre). Parmi ces options, les dispositifs microfluidiques peuvent être d’intérêt pour répondre à des questions spécifiques concernant la formation des synapses ou d’orientation et de transport axonal20. MNs sont connus pour être sensibles aux changements de leur microenvironnement impliquant des modèles, les facteurs de concentration, les changements mécaniques dans le substrat (p. ex., raideur), contrainte pure et spatio-temporelle cues dégradés (par exemple, topographiques caractéristiques, structuration des surfaces avec des matières différentes affinités cellulaires). Plateformes microfluidiques sont des systèmes qui intègrent des conditions multifactorielles, permettant la détermination des micro-environnements cellulaires optimales.
Depuis la découverte du survie effets7 de GDNF, augmente le nombre de facteurs neurotrophiques impliqués dans la croissance initiale de MN et de survie, d’orientation et de développement des axones et induisant de la plasticité synaptique. Fait intéressant, chaque facteur agit sur une sous-population particulière de MNs8. Par exemple, le CNTF a été décrite pour protéger la colonne moteur médiane (MMC) qui innerve les muscles axiaux, tandis que HGF agit sur la colonne latérale moteur (LMC) qui innerve les muscles des membres. En revanche, GDNF et BDNF les deux montrent l’activité d’apoptotiques plus forte sur des populations entières de MNs. Enfin, la combinaison de GDNF et BDNF CNTF est suffisante pour protéger les plus de 70 % d’une population de MN et est couramment utilisée dans les laboratoires.
Dans des conditions de culture standard, MNs peuvent être conservées in vitro jusqu'à 14 jours en remplaçant la moitié des milieux de la culture avec les supports neufs, une fois tous les 3 jours, à partir de la cinquième journée de la culture. Au cours de la maturation in vitro , MNs peuvent être transfectées par magnétofection à tout moment à l’aide de ce protocole. L’efficacité et la toxicité de cette technique peuvent être modulées par la nature des plasmides et inserts. Dans notre cas, quand magnétofection a été réalisée sur la culture de MN après 2 jours in vitro à l’aide d’un plasmide 9KO avec un promoteur CAGGS (pCAGEN21) contrôlant les neurofilaments cDNA, nous avons observé en moyenne ± 31.48 % 9,94 (écart type) de transfectées MNs la transfection après 48 heures. Néanmoins, pour les autres constructions, un ratio différent de l’ADN/perles doit être testé comme décrit dans le protocole du fabricant. Un autre paramètre qui peut-être influencer l’efficacité de la transfection du niveau est la maturation des MNs au fil du temps. En effet, durant les 3 premiers jours de la culture, la croissance des axones et élargissement de somas produira, qui augmente la surface où les billes vont pénétrer. Ce paramètre peut accroître l’efficacité de transfection MN au fil du temps au cours de la maturation.
Enfin, par rapport aux cultures de MN, il serait intéressant de cultiver les neurones sensoriels22,23,24. En particulier, la maladie de Charcot-Marie-Tooth est une neuropathie motrice sensorielle, caractérisée par une atrophie musculaire distale liées à la dégénérescence des fois MNs de la colonne vertébrale et des neurones sensoriels de DRGs. fait intéressant, DRG est situés des deux côtés de la moelle épinière et peut être recueillis au cours de la même procédure de dissection permet d’obtenir des MNs. À cet égard, il est possible de comparer les mécanismes physiopathologiques à le œuvre dans ces deux types de cellules concernées, les motoneurones et les neurones sensibles DRG.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le « Association pour le développement de la neurogénétique » du Dr Jacquier bourse et AFM-Telethon pour son aide au moyen de MyoNeurAlp plan stratégique. Nous tenons aussi à remercier Dr Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr Brigitte Pettmann, Dr Cedric Raoul et Dr. Georg Haase, qui a participé à l’élaboration et l’amélioration de la technique et de diffuser leurs connaissances.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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