Summary
이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.
Abstract
척추 motoneurons (MNs)의 Neurodegeneration 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 척추 근육 위축, 근육 위축과 모두 관련 된 신경 성 질환의 큰 스펙트럼에 연루 이다. 척추 MNs의 기본 문화 같은 질병에 특정 한 유전자의 관련을 설명 하 고 그들의 변이의 세포 결과 특성화에 널리 사용 되어 왔습니다. 이 프로토콜 모델 기본 미네소타 문화 파생 헨 더 슨과 동료의 정액 일에서 20 년 이상 전에. 첫째, 우리는 마우스 배아에서 척수의 앞쪽 뿔을 해 부하 고 밀도 그라디언트를 사용 하 여 셀을 이웃에서 MNs를 분리 하는 방법 선발. 다음, 우리는 효율적으로 magnetofection를 사용 하 여 식 플라스 미드와 MNs를 transfecting의 새로운 방법을 제시. 마지막으로, 우리는 수정 하는 방법과 immunostain MNs. Charcot Marie이 질병 유형 2 원인 neurofilament 변이 사용 하 여,이 프로토콜 하 관심사의 단백질을 표현 하 고 있는 그들의 관련을 공부 질적 방법을 보여 주 설명 미네소타, 유지 보수, 성장과 생존입니다.
Introduction
신경 근육 학 질병 근육 및 신경 시스템의 변경에 의해 특징은 임상 및 유전으로 명료한 pathologies의 다양 한을 포함 됩니다. 시퀀싱 기술 발전, 때문에 유전자가 희귀 질환에 대 한 책임의 수백 지난 10 년 동안 확인 되었습니다 (Neuromuscular 질병 센터에서 사용할 수 있는 목록 http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). 확인 된 돌연변이의 다양 한 다른 고기 및 질병1,,23 다른 돌연변이 단일 유전자에서 발생할 수 있습니다 나타내고 다른 유전자에 돌연변이 비슷한 고기를 생산할 수 있는 4 , 5. 이러한 맥락에서 돌연변이 결과 및 병 적인 메커니즘을 분석 하기 위한 강력한 도구가 될 수 있는 휴대 전화 모델을 개발 하는 노력 있다.
척추 MNs는 척수의 복 부 뿔 형태 긴 축 삭 골격 근육 섬유를 타겟으로하 고 신경 근육 접합부에서 아 세 틸 콜린의 출시를 통해 자발적인 움직임에 대 한 허용에 있는 큰 somas는. MNs는 루 경화 증, Charcot Marie이 질병 (CMT), 신경 근육 학 질병에 의해 영향을 때문에 척추 근육 위축, 닥터 헨 더 슨과 동료 의 재배에 대 한 허용 된 첫 번째 프로토콜6 개발 생체 외에서 척추 MNs 및 科의 발견 요소 GDNF7 (glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인). 그 이후 기술 상세 척추 MNs 및 FACS8를 사용 하 여 그들의 하위의 더 정확한 정화에 대 한 허용 하지만 밀도 그라데이션에 의해 농축 남아 기본 척추 MNs 작업은 현재 실험실에서 강력 하 고 널리 사용 되 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 그 후, 그것은 또한 표면 마커 p75(NTR)15,,1617의 활용 하 여 immunopanning 통해 높은 미네소타 정화 등급을 얻을 수.
척수 포함 dorso 복 부 축에 전방 경적에서 그들의 위치 사이에서 다른 중간과 측면 모터 열으로 자 궁 경부, 흉부, 요 추 MNs의 다른 하위 및 표적 중 그들은 자극8, 18. 주 미네소타 문화 생리 적인 비율에 이러한 미네소타의 모든를 복구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 한계는 프로시저;의 끝에 얻은 MNs의 낮은 수 사실, 그것은 현미경 검사 법 그러나 생화학 실험에 대 한 제한에 대 한 적당 한 6 개의 배아에서 약 105 MNs를 얻을 것으로 예상 수 있습니다. 더 표준화 된 하위와 풍부한 MNs 실험을 수행 하기 위해 (> 106 셀), 배아 줄기 세포 유래 MNs18고려 되어야 한다.
기본 MNs로 야생-타입/돌연변이 transgenes 또는 최저의 내 생 유전자의 transfection는 특히 마우스 모델 사용할 수 없을 때 physiopathological 경로 해독에 대 한 신속 하 고 유용한 도구입니다. Magnetofection은 transfecting 기본 신경, 관련된 neurotoxicity 없이 lipofection와 비슷한 하나의 기술입니다. 또한, 몇 일 후 체 외에서electroporation9에 따라 기술 달리 성숙한 뉴런에 transfection은 수행할 수 있습니다. 그러나, 한이 기술의 단점은 구슬 DAPI 라벨에 잡음을 일으키는 문화에서 핵 산 바인딩입니다. 바이러스 감염 가능성이 transfecting MNs;에 대 한 가장 효율적인 기술 이다 그러나, magnetofection는 바이러스 생산 및 세포 감염에 필요한 특정 안전 절차를 필요 하지 않습니다.
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Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 기관의 윤리 위원회에 의해 허용 했다.
1. 솔루션 준비
- 4% BSA L-15 매체에 dialyzed의 10 mL를 준비 합니다.
- L-15 매체의 10 mL에 4% (w/v)에 소 혈 청 알 부 민 분말을 용 해.
- 20 mL 투 카세트 20 kDa 커트 오프로에 솔루션을 추가 합니다. 4 ° c.에 동요에서 3 일 동안 L-15 매체의 500 mL에 대 한 dialyze L-15 매체 매일 변경 합니다.
- 0.22 μ m 막 및 15 mL 튜브에 약 수를 통해 해결책을 필터링 합니다. -20 ° c.에 튜브를 저장
참고:이 프로토콜 사용 하 여 다음 참조: 수정 되지 않은 원시 L-15 매체 L-15 매체, 산 성 L-15 매체 = = pH L-15, 및 기본적인 L-15 매체 중 탄산염 L-15 =.
- PH L-15 200ml를 준비 합니다.
- L-15 매체의 pH 조정: 첫째, 드라이 아이스의 일부 조각을 세척 병 채우기. 색상 오렌지 변할 때까지 L-15 매체에 가스 (CO2)를 주입 (~ pH 6.4 고 ~ 40 압력). PH는 또한 표준 pH 측정기와 함께 조정할 수 있습니다.
- 한 달 동안 0.22 μ m 막 및 4 ° C에서 저장소를 통해 매체를 필터링 합니다.
- 100 mL 중 탄산염 L-15의 준비.
- L-15 매체의 97.5 mL를 7% 나트륨 중 탄산염의 2.5 mL을 추가 하 고 4 ° c.에 저장
- IPCS (인슐린 Putrescin Conalbumin Selenite) 보충제를 준비 합니다.
- 0.1 M HCl. 추가 이중 증 류 물 4.5 mL의 0.5 mL에 인슐린의 2.5 mg을 디졸브.
- 8mg putrescine 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 mL에 용 해.
- 10 ml PBS의 conalbumin의 100 밀리 그램을 디졸브.
- 분해 물 19.3 ml에서 나트륨 selenite의 1 밀리 그램, pH 7.4를 조정 하 고 솔루션을 10 배 희석.
- 인슐린 솔루션의 1 mL, putrescine 솔루션의 1 mL, conalbumin의 1 mL 및 IPCS 보충 솔루션의 3.1 mL를 나트륨 selenite 솔루션의 0.1 mL을 결합 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장
- 0.02 m m 프로 솔루션을 준비 합니다.
- 80% 에탄올의 1.6 ml에서 황 체 호르몬의 1 마그네슘을 디졸브.
- 솔루션 100에 100% 에탄올을 희석 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다
- 완전 한 L-15 매체의 100 mL를 준비 합니다.
- PH 3.5 mg/mL의 최종 농도 포도 당을 얻기 위해 L-15 92 mL를 D-포도 당 솔루션 (200 mg/mL)의 1.8 mL를 추가 합니다.
- 100의 1 mL을 결합 하 여 페니실린 스 x (10000 U/mL), 열 비활성화 말 혈 청의 2 mL, IPCS 믹스의 3.1 mL 및 progesterone 솔루션 (2 x 10-5 M)의 0.1 mL.
- 0.22 μ m의 막에 매체를 필터링 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다
- 실험 당 밀도 그라데이션 솔루션 (최종 농도의 5.5%)의 5 mL을 준비 합니다.
- 4524 µ L L-15의 상업 60% 밀도 그라데이션 매체의 476 µ L 추가 (interphase;에서 시각적 대비를 증가 붉은 페 놀 없이 가능 하다 면, 1:10. 5의 희석 비율).
- 2 주 동안 4 ° C에서 솔루션을 저장 또는-20 ° c.에 그것을 동결합니다
- 문화 미디어의 10 mL를 준비 합니다.
- 신경 세포 배양 매체의 9.6 mL를 보충 매체의 200 µ L를 추가 합니다.
- 글루타민의 25 µ L을 10 µ L 2-mercaptoethanol의 열 활동 되지 않 ㄴ 말 혈 청 (는 glial 세포 선구자 및 확산에 대 한 작품을 차별화 하는 경향이)의 200 µ L를 추가 합니다.
- 0.22 μ m 필터를 통해 미디어를 필터링 합니다.
- 다음 neurotrophic 요인 추가: 10 ng/mL의 최종 농도에 속눈썹 neurotrophic 요인 (CNTF) 및 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 및 glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 1 ng/mL의 최종 농도에.
- 4 ° c.에 미디어를 저장
- 해 부 미디어의 50 mL를 준비 합니다.
- HBSS의 47.05 mL를 포도 (200 mg/mL)의 2.25 mL를 추가 합니다. Ph 7.4의 1 M HEPES 700 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 미디어를 저장
- 4 %PFA 솔루션을 준비 합니다.
- 500 ml PBS의 PFA의 20 g을 분해.
- 화학 후드에서 60 ° C에 솔루션을 열 하 고 솔루션 취소 될 때까지 1 M NaOH의 몇 방울을 추가 합니다.
- 필터 종이 통해 해결책을 필터링 하 고 pH 7.2 조정 합니다. -20 ° c.에 그것을 저장합니다
참고: 또는, 다른 상용 PFA 솔루션 사용 고 PBS에서 4%로 희석.
- 집게가 위, 및 실리콘 요리 비누 사용 하기 전에, 70% 에탄올과 해 부 도구를 청소 하 고 사용 후 맑은 물.
2. 폴 리-ornithine/Laminin (포/L) 코팅 접시
참고: 볼륨 코트 24-잘 접시에 적응은.
- 필요한 경우, 살 균 12 mm coverslip 잘 넣어.
- 물에 녹아 10 µ g/mL 폴 리-L-Ornithine 솔루션의 500 µ L로 웰 스 코트.
- 실 온에서 1 h 정착 우물을 하자.
- 폴 리-L-Ornithine 솔루션을 제거 하 고 30 분 동안 건조.
- 탄산염 L-15에서에서 3 µ g/mL laminin의 500 µ L 37 ° C에서 하룻밤 웰 스 코트.
참고: 웰 스 저장할 수 있습니다 37 ° C에 인큐베이터에서 7 일 동안. 긴 외피, 우물 사이 살 균 PBS 추가 중간 증발을 피하기 위해 도울 수 있다.
3입니다. 해 부
- E12.5 배아 단계에서 배아는 임신 마우스를 희생. 70% 에탄올과 배꼽 청소.
- 두 oviducts와 질을 절단 하 여 자 궁을 제거 하 고 차가운 PBS (없이 캘리포니아2 + Mg2 +)으로 가득 페 트리 접시에 넣어.
- 모든 배아를 수집 하 고 신선한에 그들을 전송 차가운 PBS (없이 캘리포니아2 + Mg2 +) 페 트리 접시에서.
- 실리콘 코팅 및 (HBSS와 포도 당 4.5 g/L, 7 mM HEPES pH 7.4) 해 부 미디어의 전체 접시에 하나의 배아를 넣어.
참고: 배아 해 부 현미경으로 깨끗 한 고 운 집게와가 위를 사용 하 여 수행 됩니다. 또는 실리콘 없이 일반 배양 접시 해 부에 대 한 사용할 수 있습니다. - 머리, 꼬리, 내장가 위 집게를 사용 하 여 제거 합니다.
- 집게와 실리콘에 대 한 배와 배아를 유지 합니다.
- 집게의 두 번째 쌍 rostral 척수의 중앙 채널에 삽입 팁 중 하나.
- 눈물 등 조직 몇 밀리미터에 집게를 닫습니다.
- 전체 척수 오픈 될 때까지 꼬리 쪽으로이 작업을 반복 (그림 1B).
- 시체에서 척수 (대뇌 간선)의 rostral 부분을 분리 합니다.
- 실리콘에 대 한 오픈 척수를 유지 하기 위해 배아를 설정 합니다.
- 척수의 rostral 부분을 꼬 집 고 머리 척수를 추출 하 여 태아를 당겨.
참고: Meninges과 지 루트 신경 절 (Drg) 태아에 부착 되어 있어야 합니다. 그렇지 않으면, 조심 스럽게 빼냅니다 멀리 어떤 나머지 meninges과 Drg 여전히 척수에 연결 된. 이 단계에서 Drg 수 또한 민감한 신경 문화에 대 한 수집 될 (내용 참조). - 실리콘에 척수를 평평 하 고 메스를 사용 하 여 각 면의 중앙을 따라 절단 하 여 코드의 등 절반을 제거 합니다. 메스를 사용 하 여 10 조각으로 중간 부분을 잘라내어 새로운 튜브 조각을 전송.
4. 척수 세포 현 탁 액
- 6 ~ 8 척수에 대 한이 해 부 절차를 반복 합니다.
- 하자 척수 조각 튜브의 하단에 수집 하 고 햄 F10 매체의 1 mL에는 HBSS 바꿉니다.
- 트립 신 (2.5 %w / v, 최종 농도 0.025%)의 10 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에서 10 분 동안 튜브를 품 어
- 효소 소화를 중지, 완전 한 L-15 매체, 4% (w/v) BSA 100 µ L DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L의 800 µ L을 포함 하는 새로운 15 mL 튜브에 파편을 전송.
- 두번 P1000 피 펫을 사용 하 여 1 mL 발음 하 여 triturate. 조각 2 분 수집 신선한 15 mL 튜브에 상쾌한 정착 하자.
- 조각을, 완전 한 L-15 매체의 900 µ L, 4% (w/v) BSA 100 µ L 및 DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다.
- 1 mL P1000 피 펫을 사용 하 여 발음 하 여 6 번 triturate. 조각 2 분 추가 15 mL 튜브에 상쾌한 단계 4.5에서에서 얻은 정착 하자.
- 조각을, 완전 한 L-15 매체의 900 µ L, 4% (w/v) BSA 100 µ L 및 DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다.
- 1 mL P1000 피 펫을 사용 하 여 발음 하 여 10 배 triturate. 조각 2 분 추가 15 mL 튜브에 상쾌한 단계 4.5에서에서 얻은 정착 하자. 상쾌한 진행.
- 부드럽게 장소 P1000 피펫으로 사용 하 여, 표면에 뜨는 튜브의 아래쪽 2 mL BSA 4% (w/v) 쿠션. 5 분 동안 470 x g에서 원심.
- 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 L-15 매체의 2 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend.
5. 미네소타 농축 그라데이션 밀도
- 두 개의 15 mL 튜브 (각 1 mL)으로 세포 현 탁 액을 분할. 그런 다음 완전 한 L-15 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 6 배아에서 시작 해 서, 매체의 3 mL에 튜브 당 3 배아의 동등한을 사용 합니다.
- 천천히 날카로운 인터페이스를 각 튜브의 하단에 솔루션을 추가 하 여 밀도 그라데이션 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 실 온에서 15 분 동안 830 x g에서 원심. 이 단계 후 작은 셀 MNs 같은 큰 세포 밀도 그라데이션 솔루션/매체 인터페이스에 있어야 하는 반면 튜브의 하단에 있어야 합니다.
- 인터페이스에서 세포를 수집으로 1 또는 2 mL를 발음 하 고 신선한 15 mL 튜브에 그들을 전송. L-15 pH 매체와 10 mL을 볼륨을 조정 합니다.
- 튜브 및 실 온에서 5 분 동안 470 x g에서 원심 분리기의 바닥에 4 %BSA 쿠션의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 L-15 매체의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 5.5 단계를 반복 합니다.
- 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 문화 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 휴대폰 번호와 생존 한 hemocytometer와 위상 대비 현미경을 계산 합니다.
참고: 6 척수에 대 한 셀 수 약 1 × 105 MNs 예상입니다.
6. 미네소타 문화
- 보통 5000 ~ 10000 셀 24-잘 접시에 잘 당 문화 매체의 500 µ L에 적절 한 밀도를 MNs 희석.
참고: 각각 6-96 잘 접시, 30000 및 1500 셀 주위는 밀도 시드입니다. - 한 P1000 laminin 솔루션을 제거 합니다.
- 즉시에 건조 하지 않도록 코팅 판으로 문화 매체에 희석 MNs 전송.
- 37 ° c.에 2 일 동안 문화를 품 어
7입니다. MNs의 Magnetofection
참고: 다음 단계에 사용 하는 수량 24-잘 접시의 한 우물의 transfection에 대 한 의미가 있다. 다른 형식에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 참조 하십시오.
- DNA 준비를 위해 resuspend 1 µ g의 DNA 신경 문화 매체와 5 소용돌이의 50 µ L에서 s.
- 비드 튜브 준비, 대 한 신경 문화 매체의 50 µ L에서 구슬의 1.5 µ L을 resuspend.
- 50 µ L DNA 솔루션을 50 µ L 비드 솔루션을 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어 (전체 용량 = 100 µ L).
- 이 부 화 하는 동안 페는 우물에서 문화 매체의 100 µ L를 철회.
참고: 그것을 따뜻하게 37 ° c 배양 기에서 자기 접시를 넣어 - 잘, DNA/구슬 믹스 100 µ L를 전송 하 고 접시를 품 어 37 ° c.에 자기 접시에 20-30 분
- CDNA 식의 감지 하기 전에 적어도 24 시간을 기다립니다.
8. 고정 및 얼룩
- PBS로 2 회 문화를 씻어.
- 4%에서 실 온에서 20 분에 대 한 문화를 품 어 PFA/PBS.
- PBS로 2 회 문화를 씻어.
- 실 온에서 1 h 블로킹 버퍼 (PBS, BSA는 4%, 2% 정상 혈 청, 0.3% 트라이 톤 X-100, 0.1 m M 글리신)의 500 µ L에서 문화를 품 어.
참고: 일반 혈 청 (예: 정상 염소 혈 청) 2 차 항 체로 동일한 종에서 파생 되어야 한다. - 블로킹 버퍼의 250 µ L에 희석 하는 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.
참고: 예를 들어, TUJ1은 1/1000에 사용 SMI32 1/1000, 사용 되 고 Lc3b는 1/200에서 사용 됩니다. - 3 회 PBS 가진 문화를 씻어.
- Fluorophore 활용 된 이차 항 체 실 온에서 1 시간 동안 블로킹 버퍼의 250 µ L에 희석 된 문화를 품 어.
- 3 회 PBS 가진 문화를 씻어.
- 설치 매체를 사용 하 여 유리 슬라이드에 탑재 합니다.
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Representative Results
24 시간 후 문화에서, motoneurons (MNs) 이미 상당한 axonal 성장 (적어도 6 시간 이상 소마 크기)을 표시 합니다. 다음 일에 축 삭 성장 분기 (그림 2)를 표시 하 고 계속 해야 합니다. 하위 특이성으로 인해 다른 형태학을 있을 것입니다. 예를 들어 중간 열 MNs 축 근육을 자극 하는 자극 다리 근육18측면 모터 열 MNs 보다 짧고 더 분기 축 삭을 있다.
이러한 격리 및 위에서 설명한 자란 기술을 최근 neurofilament 유전자 CMT13의 상 염색체 지배적인 axonal 형태를 NEFH에에서 새로운 돌연변이 특성화 하기 위해 사용 되었습니다. 이 경우에, 도금, 후에 2 일 순화 된 MNs 인코딩 eGFP 융합 NEFH의 돌연변이 형태 또는 야생-타입 양식을 eGFP 융합 하는 플라스 미드와 페 했다. 2 일 후, 돌연변이 NEFH eGFP cytoskeletal 네트워크 따라 집계 형성. Magnetofection, 후 4 일이이 집계 LC3b autophagic 표식 (그림 3)를 포함 하는 저명한 perinuclear aggresome에서 진화. 이 방법을 사용 하 여 NEFH의 돌연변이 형태 주 MNs autophagic 경로와 관련 된 집계의 형성을 유발 입증 수 있었습니다.
그림 1: 절차 주요 단계 개요. (A) E12.5 마우스 배아는 척수의 복 부 경적을 추출 해 부. 그리고 복 부 경적 세포에서 뉴런 해리는 MNs 도금 전에 밀도 그라데이션에 의해 순화 된다. 마지막으로, MNs는 magnetofection에 의해 페 하 고 몇 일 후 분석. (B) 척수 해 부의 첫 번째 단계는 척수의 지붕 접시 집게와 rostro 꼬리 축 열 때 이다. 다음, 척수는 대뇌 트렁크를 당겨 시체에서 분리 됩니다. 이 시점에서, meninges 및 지 루트 신경 절 (DRG) 배아 시체에 남아 있다. 척수의 등 쪽 부분 경도 메스로 잘라입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 미네소타 문화. (A) 문화 생 비 phosphorylated neurofilament 무거운 체인 (SMI32)의 얼룩에 의해 계시의 4 일 후에 MNs 형태학. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) MNs 형태학 생체 외에서 4 일 후 고 주 2에서 magnetofection에 의해 eGFP transgene에 대 한 페. MNs는 마커 SMI32 또는 팬-신경 마커 Tuj1 counterstained 했다. 화살표는 뉴런의 somas 표시. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Magnetofected 표현 야생-타입 또는 돌연변이 eGFP NEFH MNs의 공초점 이미지 (녹색)에 생성 하 고는 autophagic 마커 LC3b (빨간색)에 대 한 스테인드. 화살표는 또한 긍정적인 LC3b 단백질 집계 돌연변이 eGFP-NEFH를 표시 합니다. 눈금 막대 = 10 µ m 이미지 Jacquier 외. 2017 년 Acta Neuropathologica 통신13에서 수정 됩니다.
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Discussion
이 프로토콜에서 중요 한 포인트 중 하나는 마우스 배아는 개발 (E12.5) 끝에 얻은 MNs의 양을 최적화 하는 동안 정확한 시간대에 해 부입니다. 또한, 최적의 생산량에 대 한 해 부 수행 되어야 한다 아침 이나 이른 오후에. E12.5 (예를 들어, E11.5에서), 전에 해 부가 어렵습니다, 특히 meninges의 제거에 관한. E12.5, 후 얻은 MNs의 수는 크게 떨어진다. 개발의 배아 단계 제어, 성인 여성 및 남성 처음 배치 됩니다 함께 하루의 끝에서. 다음날 아침, 성인 구분 됩니다, 그리고 여성 질 플러그의 존재를 확인 합니다. 있으면 플러그, 배아는이 시점에서 개발의 E0.5 일에 것으로 간주 됩니다. 이러한 실험에 대 한 우리는 일반적으로 적극적이 고 생산적인 마우스 선을 사용 합니다. 미주리에서 자란 식민지에서 발생 하는 창시자가이 프로토콜에 사용 되 고 변형 CF1 선정 됐다 (Carworth 농장 스트레인 1). 이 긴장에서 찰스 강 실험실 프랑스에서 1967 년에, 소개 되었다 그리고 그것은 이름을 OF1 획득 (Oncins 프랑스 1).
두 번째 중요 한 포인트는 크게 문화권의 순도 영향을 주는 원심 분리 단계입니다. MNs는 척수 세포 (약 1%)의 낮은 백분율을 대표 한다 그리고 다른 척추 신경 세포와 미만 5 %glial 세포 창시자 중 40 ~ 50 %MNs 포함 하는 문화를 목표는. Centrifugations의 효능을 모니터링, 인수 전과 후에 각 단계는 24 시간에 대 한 MNs 매체에서 도금 될 수 있다 현 탁 액 샘플을 뒤에 고정 하 고 (81.5C10, DSHB) 모터 신경 마커 Hb9의 표현에 대 한 얼룩 또는 섬-1/섬-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), 그 조합을 정의 다른 MNs 부분 모집단19. 더 성숙한 MNs에 문화의 품질을 예측 하 콜린 아 세 틸 전이 효소 (채팅, Ab144P) 또는 비 phosphorylated Neurofilament H 등 다른 마커 (SMI-32 P)를 사용할 수 있습니다. 신속 하 게 정화의 효능을 모니터링 하기 위한 좋은 대안 MNs에 특히 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 사용 하는 것입니다. 예를 들어 Wichterle와 동료 이전 마우스 Hb9 (Hlxb9 또는 Mnx1 라고도 함) 발기인18의 통제 GFP를 표현 하는 유전자 변형 마우스 개발. Hb9::GFP 유전자 변형 쥐 dendrites 축 삭, 생 후 10 일째에 배아 일 9.5에서에서 척추 MNs의 somas GFP의 독특한 표현을 표시합니다.
MNs 폴 리-L-Ornithine laminin 코팅에 의해 얻은 허용 기판에 성장을 해야 합니다. 실험 조건에 따라 다양 한 플라스틱, 폴리머 및 유리 기반 컨테이너를 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 6-24-96 잘 접시, coverslips, 유리 또는 챔버 슬라이드). 이러한 옵션 중에서 미세 장치 시 냅 스 형성 또는 axonal 지도 및 전송20에 관한 특정 질문에 관심이 있을 수 있습니다. MNs는 그들의 microenvironment 패턴, 농도 요인, 기계적 변화 기판 (예를 들어, 뻣 뻣 함), 완전 한 스트레스, 그리고 spatiotemporal 그라데이션 단서 (예를 들어, 지형에 변화에 민감한 것으로 알려져 있습니다. 기능, 다른 세포 친 화력의 물질과 표면 패턴화). 미세 플랫폼은 multifactorial 조건, 최적의 세포 microenvironments의 결정에 대 한 허용을 통합할 수 있는 시스템 이다.
GDNF의 생존 효과7의 발견 이후 미네소타 초기 성장 및 생존, 지도 축 삭의 개발 및 시 냅 스가 소성의 유도에 관련 된 neurotrophic 요인의 수는 성장 하고있다. 흥미롭게도, 각 요소는 MNs8의 특정 한 부분 모집단에 수행 됩니다. 예를 들어 CNTF HGF 측면 모터 열 (LMC)는 innervates 사지 근육에 작용 하는 반면 중간 모터 열 (MMC) innervates 축 근육을 보호 하기 위해 설명 하고있다. 다른 한편으로, GDNF와 BDNF MNs의 전체 인구에 강한 직업 생존 활동을 보여줍니다. 마지막으로, GDNF, BDNF, 및 CNTF의 조합 보호만 인구의 70% 이상에 대 한 충분 한 이며 실험실에서 주로 사용 됩니다.
표준 문화 조건에 MNs 수 유지 에 체 외 14 한 일에 한 번, 신선한 미디어와 문화 미디어의 절반을 대체 하 여 문화의 다섯 번째 날부터 시작. 체 외에서 성숙 하는 동안 언제 든 지가이 프로토콜을 사용 하 여 MNs magnetofection에 의해 페 수 있습니다. 효율성과이 기술의 독성 플라스 미드와 삽입의 성격에 의해 변조 수 있습니다. 우리의 경우에, magnetofection 2 일에서 체 외에 는 9 kb 플라스 미드 CAGGS promotor (pCAGEN21)와 neurofilament cDNA, 제어를 사용 하 여 후 미네소타 문화에 수행한 때 우리 31.48% ± 9.94 (표준 편차)의 평균 관찰 페 MNs 48 시간 후 transfection 그럼에도 불구 하 고, 다른 구문에 대 한 DNA/구슬의 다른 비율 테스트 해야 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로. Transfection 수준의 효율에 영향을 미칠 수 있는 다른 매개 변수는 시간이 지남에 MNs의 성숙. 실제로, 문화의 첫 3 일 동안 축 삭의 성장 및 somas의 확대 발생 합니다는 구슬 침투 한다 표면 영역을 증가. 이 매개 변수는 성숙 하는 동안 시간이 지남에 미네소타 transfection 효율을 증가할 수 있습니다.
마지막으로, 미네소타 문화에 비해 그것은 감각 뉴런22,,2324를 육성 하기 위해 재미 있을 것. 특히, Charcot Marie이 질병은 감각 모터 신경 말 초 근육 위축 특징 관련 모두 척추 MNs의 퇴보와 Drg. 감각 뉴런 흥미롭게도, Drg 척수의 양쪽에 위치 하 고 있을 수 있습니다. MNs를 사용 하는 동일한 해 부 프로시저 동안 수집. 이와 관련,이 두 관련 세포 유형, motoneurons DRG 민감한 신경에 직장에서 pathophysiological 메커니즘을 비교할 수입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 "협회 부 르 지속 가능성 드 라 neurogénétique" 박사 Jacquier의 친목 및 AFM-텔 레 톤 MyoNeurAlp 전략적 계획을 통해 그것의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 박사 크리스 헨 더 슨, 박사 윌리엄 Camu, 박사 Brigitte Pettmann, 박사 세 드 릭 라울, 누가 개발 하 고 기술 향상에 참가 하 고 그들의 지식을 전파 하는 박사 게오르그 세 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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