Summary
Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.
Abstract
Spinal motoneurons (MNs) ateş içinde nörolojik bozukluklar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı ve spinal kas atrofisi, kas atrofisi ile ilişkili tüm olan da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı. Omurilik MNs birincil kültürleri belirli genler gibi hastalıklar tutulumu göstermek ve onların mutasyonların hücresel sonuçları karakterize yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu iletişim kuralı modelleri birincil MN kültür Henderson ve arkadaşları seminal işten daha fazla yirmi yıl önce türetilmiş. İlk olarak, bir fare embriyo Medulla Spinalis ön boynuzları anatomi ve hücreleri bir yoğunluk gradient kullanarak komşu gelen MNs izole bir yöntem ayrıntı. O zaman, biz verimli bir şekilde transfecting MNs magnetofection kullanarak ifade Plasmid'ler ile yeni bir yol mevcut. Son olarak, biz nasıl düzeltmek için ve immunostain MNs. Charcot Marie Tooth hastalığı tip 2 neden neurofilament mutasyon kullanarak, bu iletişim kuralını proteinler ilgi ifade ve onların katılımı eğitim nitel bir yaklaşım gösteriyor birincil göstermek MN büyüme, bakım ve hayatta kalma.
Introduction
A değişiklik-in kas ve/veya sinir sisteminin değiştirilmesini tarafından karakterize klinik ve genetik olarak farklı patolojiler nöromüsküler hastalıklar kapsamaktadır. Sıralama teknolojik gelişmeler nedeniyle, son on yılda genlerin bu nadir hastalıklar için sorumlu yüzlerce tespit edilmiştir (liste Neuromuscular hastalığı Merkezi, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Tek bir gen farklı mutasyon farklı fenotipleri ve hastalıkları1,2,3 neden olabilir ve farklı genlerdeki mutasyonlar benzer fenotipleri üretebilir saptanan mutasyon çeşitli gösterir 4 , 5. Bu bağlamda, mutasyon sonuçları ve patolojik mekanizmalarını analiz etmek için güçlü araçlar olabilir hücresel modellerinin geliştirilmesi için çaba vardır.
Omurilik MNs ventral boynuzları omurilik, iskelet kas lifleri hedef ve nöromüsküler kavşak, asetilkolin serbest yoluyla gönüllü hareketler için izin vermek için form uzun aksonlar yer alan büyük somas var. MNs nöromüsküler hastalıklar gibi amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı (CMT), etkilenen ve spinal kas atrofisi, Dr Henderson ve arkadaşları ekimi için izin verilen ilk Protokolü6 geliştirilmiş Tüp bebek spinal MNs ve keşif nörotrofik faktör GDNF7 (gliyal hücreye türetilmiş Nörotrofik faktörü). O zamandan beri teknik ayrıntılandırmaları spinal MNs ve FACS8kullanarak kendi alt türlerinden daha doğru arıtma için izin vermiş, ancak güçlü ve yaygın olarak kullanılan birincil spinal MNs ile çalışmakta laboratuarlarında zenginleştirme yoğunluk gradient tarafından kalır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. daha sonra immunopanning bir daha yüksek MN arıtma sınıfa yüzey işaret p75(NTR)15,16,17yararlanarak elde etmek mümkündür.
Omurilik boyun, göğüs ve bel MNs yanı sıra ön boynuz dorso-ventral ekseninde konumlarında arasında farklılık medyan ve yanal motor sütunları farklı alt türlerinden içerir ve hedefler arasında onlar8, innervate 18. birincil MN kültürleri tüm fizyolojik oranlarda bu MN türlerinden kurtarabilirsiniz. Ana bu teknik MNs yordamın bitiminde elde edilen az sayıda kısıtlamasıdır; Aslında, yaklaşık 105 MNs mikroskobu ama Biyokimya deneyler için sınırlama için uygun olan altı embriyolar elde etmek için beklenebilir. Deneyler daha standart alt türlerini ve bol MNs gerçekleştirmek için (> 106 hücreler), embriyonik kök hücre kaynaklı MNs18düşünülmelidir.
Birincil MNs içine vahşi-türü/mutant transgenes veya devirme endojen genlerin transfection özellikle fare modelleri kullanılamaz olduğunda fizyopatolojik yolları, deşifre için hızlı ve yararlı bir araçtır. Magnetofection için transfecting birincil nöronlar, lipofection ilgili nörotoksisite olmadan benzer bir tekniktir. Ayrıca, transfection olgun nöronlar üzerinde birkaç gün vitro, adım9tarihinde temel teknikleri aksine sonra gerçekleştirilebilir. Ancak, bu tekniğin bir dezavantaj boncuk DAPI etiketleme gürültü neden kültür, nükleik asitler bağlamak olduğunu. Viral enfeksiyon büyük olasılıkla transfecting MNs için en etkili tekniktir; Ancak, magnetofection viral üretim ve hücresel enfeksiyon için gerekli bazı güvenlik prosedürleri gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm işlemleri kurum etik kurul tarafından kabul edildi.
1. çözüm hazırlık
- 10 mL % 4 BSA L-15 ortamda diyaliz hazırlayın.
- Sığır serum albümin toz % 4 (w/v) 10 mL L-15 orta geçiyoruz.
- 20 mL diyaliz kaset 20 kDa kesme ile çözüm ekleyin. Ajitasyon 4 ° C'de altında 3 gündür L-15 orta karşı 500 mL diyaliz L-15 orta her gün değiştirin.
- Çözüm bir 0,22 µm membran ve aliquot 15 mL tüpler aracılığıyla filtre. Tüpler-20 ° C'de depolayın
Not: Bu iletişim kuralı aşağıdaki başvuru kullanır: değiştirilmemiş ham L-15 orta L-15 orta, asidik L-15 orta = pH L-15 ve temel L-15 orta = bikarbonat L-15 =.
- 200 mL pH L-15 hazırlayın.
- L-15 orta pH ayarlama: önce yıkama şişe bazı parçalarını kuru buz ile doldurun. Turuncu rengi yaşına gelene kadar gaz (CO2) L-15 orta enjekte (~ pH 6.4 ve ~ 40 baskılar). Standart pH metre ile pH da ayarlanabilir.
- Orta bir 0,22 µm membran ve mağaza 4 ° C'de aracılığıyla bir ay için filtre.
- Bikarbonat L-15 100 mL hazırlayın.
- L-15 orta için 97,5 mL 2.5 mL % 7 sodyum bikarbonat ekleyin ve 4 ° C'de depolayın
- IPCS (insülin Putrescin Conalbumin selenit) takviyeleri hazırlayın.
- İnsülin 0.5 ml 0.1 M HCl. Ekle'yi çift distile su 4.5 mL 2.5 mg geçiyoruz.
- Putrescine 5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) 8 mg geçiyoruz.
- 100 mg conalbumin 10 ml PBS çözülür.
- 1 mg Sodyum selenit 19.3 mL su içinde dağıtılması, pH 7.4 için ayarlamak ve çözüm 10 kat oranında seyreltin.
- 1 mL insülin çözeltisi, 1 mL putrescine çözeltisi, conalbumin 1 mL ve 0.1 mL Sodyum selenit çözeltisi 3.1 mL IPCS ek çözüm elde etmek için birleştirir. Çözüm-20 ° C'de depolayın
- 0,02 mM progesteron çözüm hazırlamak.
- Progesteron % 80 etanol 1.6 ml 1 mg geçiyoruz.
- Çözüm 100-fold içinde % 100 etanol sulandırmak ve -20 ° C'de saklayın
- 100 mL tam L-15 orta hazırlayın.
- 1,8 mL D-glukoz çözeltisi (200 mg/mL) pH 3.5 mg/mL nihai bir konsantrasyon glikoz elde etmek için L-15 92 mL için ekleyin.
- 1 mL / 100 birleştirmek penisilin-streptomisin x (10.000 U/mL), ısı inaktive at serum 2 mL, 3.1 mL IPCS mix ve 0.1 mL progesteron çözeltisi (2 x 10-5 M).
- Orta 0,22 µm membran üzerinde filtre ve 4 ° C'de saklayın
- 5 mL yoğunluğu degrade çözeltisi (% 5.5 son konsantrasyonu) deney başına hazırlayın.
- 476 µL ticari % 60 yoğunluk gradient orta L-15 4524 µL için Ekle (interfaz; adlı görsel kontrastı arttırmak için mümkünse, kırmızı fenol olmadan 1:10. 5 seyreltme oranı).
- -20 ° C'de dondurmak veya çözüm 4 ° C'de 2 hafta boyunca saklayın
- 10 mL kültür ortamının hazırlayın.
- Ek orta 200 µL nöron hücre kültür ortamının 9,6 mL ekleyin.
- (Hangi gliyal hücreye öncüleri ve işleri yayılmasına karşı ayrım eğilimi) ısı inaktive at serum 200 µL glutamin 25 µL ve 2-mercaptoethanol 10 µL ekleyin.
- Medya 0,22 µm filtre.
- Aşağıdaki Nörotrofik faktörler ekleyin: silier nörotrofik faktör (CNTF) 10 ng/mL, son bir konsantrasyon ve beyin türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF) ve 1 ng/ml son konsantrasyonlarda gliyal hücreye türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF).
- Medya 4 ° C'de depolayın
- 50 mL diseksiyon ortam hazırlamak.
- Glikoz (200 mg/mL) 2,25 mL HBSS için 47.05 mL ekleyin. 1 M HEPES 700 µL pH 7.4 ile ekleyin. Medya 4 ° C'de depolayın
- % 4 İngiltere'de yılın çözüm hazırlamak.
- İngiltere'de yılın 20 g 500 ml PBS çözülür.
- Kimyasal bir başlık altında çözüm 60 ° c ısı ve çözüm açık hale gelinceye kadar 1 M NaOH birkaç damla ekleyin.
- Bir filtre kağıdı ile çözüme filtre ve pH 7.2 için ayarlayın. -20 ° C'de depolayın
Not: Alternatif olarak, diğer ticari İngiltere'de yılın çözümleri kullanılabilir ve PBS % 4 oranında sulandırılmış.
- Diseksiyon araçları forseps, makas ve silikon yemekler ile kullanmadan önce % 70 etanol ve sabunla temiz ve berrak su kullanımdan sonra.
2. poly-ornitin/Laminin (Po/L) çanak kaplama
Not: Birimleri kat 24-şey plaka adapte olmuşlardır.
- Gerekirse, steril 12 mm coverslip kuyuda koymak.
- Suda 10 µg/mL Poly-L-Ornithine çözeltinin 500 µL Wells'le kat.
- Oda sıcaklığında 1 h için yerleşmek wells izin.
- Poly-L-Ornithine çözümü kaldırmak ve kuruması için 30 dk.
- Gecede 37 ° C'de 3 µg/mL laminin bikarbonat L-15 içinde 500 µL ile kuyu kat.
Not: Wells kuluçka makinesi 7 günde 37 ° C'de depolanabilir. Uzun incubations için steril PBS kuyular arasında eklemek orta buharlaşma önlemek için yardımcı olabilir.
3. diseksiyon
- Embriyo embriyonik evre at E12.5 ne zaman hamile bir fare kurban. % 70 etanol göbekle temiz.
- İki oviducts ve vajina kesim tarafından rahim kaldırmak ve (olmadan Ca2 + Mg2 +) soğuk PBS ile dolu bir Petri kabına koydum.
- Tüm embriyoların toplamak ve taze, transfer (olmadan Ca2 + Mg2 +) soğuk PBS bir petri içinde.
- Bir embriyo silikon ile kaplanmış ve tam diseksiyon medya (HBSS, 4,5 g/M glikoz ve 7 mM HEPES pH 7,4 ile) bir tabak koyun.
Not: Embriyo diseksiyon temiz iyi forseps ve makas kullanma mikroskop altında gerçekleştirilir. Alternatif olarak, düzenli bir petri silikon olmadan diseksiyon için kullanılabilir. - Baş, kuyruk ve iç organlar, forseps makas kullanarak kaldırın.
- Silikon karşı göbek ile embriyo forseps ile koruyun.
- Forseps ikinci bir çifti ile uçlarından birini rostral Medulla Spinalis merkezi kanalı içine yerleştirin.
- Dorsal doku birkaç milimetre gözyaşı forseps kapatın.
- Tüm omurilik açık olana kaudal yana doğru bu işlemi yineleyin (Şekil 1B).
- Vücuttan spinal kord (serebral gövde) rostral parçası bağlantısını kesin.
- Açık spinal kord silikon karşı korumak için embriyo açın.
- Rostral Medulla Spinalis parçası pinch ve embriyo omurilik ayıklamak için kafanı tarafından çıkar.
Not: Meninkslerde ve dorsal kök gangliyon (DRGs) embriyo için bağlı kalması gerekir. Aksi takdirde, dikkatlice uzakta kalan meninkslerde ve hala bağlı spinal kord DRGs çek. Bu adımda, DRGs aynı zamanda hassas nöron kültürü için toplanan (konuya bakın). - Omurilik silikon üzerinde dümdüz ve neşter kullanarak her iki tarafın ortasında boyunca keserek göbek bağını dorsal yarısı kaldırın. Orta bölüm bir neşter kullanarak 10 parçalar halinde kesilmiş ve parçaları için yeni bir tüp aktarın.
4. Spinal kord hücre süspansiyon
- 6-8 spinal halatlar için bu diseksiyon yordamı yineleyin.
- Omurilik adet tüp alt kısmında toplamak ve HBSS ile 1 mL Ham-F10 orta yerine izin.
- Tripsin (% 2,5 w/v; son konsantrasyonu % 0,025) 10 µL ekleyin. Tüp 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- Enzimatik sindirim durdurmak için 800 µL tam L-15 orta, 100 µL % 4 (w/v) BSA ve 100 µL DNaz (L-15 orta 1 mg/mL) içeren yeni bir 15 mL tüp parçaları aktarın.
- İki kez alıyorum 1 mL P1000 pipet kullanarak tarafından triturate. 2 dk. toplamak süpernatant bir taze 15 mL tüp razı parçaları izin.
- Parçaları için tam L-15 orta 900 µL, 100 µL % 4 (w/v) BSA ve 100 µL DNaz (L-15 orta 1 mg/mL) ekleyin.
- 6 kez alıyorum 1 mL P1000 pipet kullanarak tarafından triturate. 2 dk. 15 mL tüp süpernatant 4.5. adımda elde Ekle razı parçaları izin.
- Parçaları için tam L-15 orta 900 µL, 100 µL % 4 (w/v) BSA ve 100 µL DNaz (L-15 orta 1 mg/mL) ekleyin.
- 10 kez alıyorum 1 mL P1000 pipet kullanarak tarafından triturate. 2 dk. 15 mL tüp süpernatant 4.5. adımda elde Ekle razı parçaları izin. Süpernatant ile devam edin.
- P1000 damlalıklı kullanarak, yavaşça süpernatant tüp alt kısmında 2 mL BSA (w/v) % 4 yastık yerleştirin. 470 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve tam L-15 orta 2 mL ile hücre Pelet resuspend.
5. MN zenginleştirme degrade yoğunluğu tarafından
- Hücre süspansiyon iki 15 mL tüpler (1 mL her) içine bölünmüş. O zaman, tam L-15 orta 2 mL ekleyin. 6 embriyo ile başlayan, orta 3 mL tüp başına 3 embriyo denk kullanın.
- 2 mL yoğunluk gradient çözeltisi yavaş yavaş çözüm keskin bir arabirimi her tüpün dibine ekleyerek.
- Vasıl 830 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj kapasitesi. MNs gibi büyük hücreleri yoğunluk gradient çözüm/orta arayüzü olmalıdır, ancak bu adımdan sonra Tüp, alt kısmında küçük hücre olmalıdır.
- Arayüz hücreleri toplamak ile 1 ya da 2 mL alıyorum ve bir taze 15 mL tüp aktarabilirsiniz. Ses seviyesini L-15 pH orta ile 10 ml.
- %4 BSA yastık 2 mL tüp ve oda sıcaklığında 5 min için 470 x g, santrifüj dipleri ekleyin.
- Süpernatant kaldırmak ve Pelet 3 mL tam L-15 orta resuspend.
- 5.5 arasındaki adımları yineleyin.
- Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 2 mL tam kültür orta resuspend. Cep telefonu numarasını ve canlılığı bir hemasitometre faz kontrast mikroskop altında saymak.
Not: 6 spinal kordonlar için cep numarası 1 x 10-5 MNs olması bekleniyor.
6. MN kültür
- MNs kültür orta 24-şey plaka bir kuyu başına 500 µL genellikle 5.000-10.000 hücrelerde için uygun yoğunluğu oranında seyreltin.
Not: yoğunluk tohum 30.000 ve 1.500 hücreler için 6-96-iyi ve levha, sırasıyla civarındadır. - Bir P1000 laminin çözümle kaldırın.
- Hemen kurutma önlemek için kültür ortamında kaplama kalıplara seyreltilmiş MNs aktarın.
- Kültür 37 ° C'de 2 gün kuluçkaya
7. MNs Magnetofection
Not: aşağıdaki adımlarda, bir 24-şey plaka bir şey transfection için kullanılan miktarlar içindir. Lütfen başka bir biçimi için üreticinin iletişim kuralı bakın.
- DNA 1 µg 50 µL nöronal kültür orta ve 5 için girdap içinde için DNA hazırlık, resuspend s.
- Boncuk tüp için hazırlık, boncuk 1,5 µL nöronal kültür orta 50 µL içinde resuspend.
- 50 µL boncuk çözüm 50 µL DNA çözüm ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya (toplam hacmi 100 µL =).
- Bu kuluçka sırasında 100 µL kültür orta transfected kuyudan geri alıyorum.
Not: 37 ° C'ye ısıtmak için kuluçka Manyetik plaka koymak - DNA/boncuk Mix 100 µL kuyuya aktarmak ve plaka kuluçkaya 20-30 dk 37 ° C'de Manyetik plaka üzerinde
- CDNA ifade tespiti önce en az 24 saat bekleyin.
8. fiksasyon ve boyama
- Kültür 2 kez PBS ile yıkayın.
- Kültür, oda sıcaklığında %4 20 dk için kuluçkaya PFA/PBS.
- Kültür 2 kez PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabelleği (PBS, % 4 BSA, % 2 normal serum, %0.3 Triton X-100, 0.1 M glisin) 500 µL kültüründe kuluçkaya.
Not: Normal serum ikincil antikor (Örneğin, Normal keçi Serum) aynı türlerden elde edilen. - Gecede 4 ° C'de kültür ile birincil antikor engelleme arabellek 250 µL içinde seyreltilmiş kuluçkaya.
Not: Örneğin, 1/1000 TUJ1 kullanıldığında, SMI32 1/1000 kullanılır ve Lc3b 1/200 olarak kullanılır. - Kültür 3 kez PBS ile yıkayın.
- İkincil antikorlar fluorophore Birleşik oda sıcaklığında 1 saat engelleme arabellek 250 µL içinde seyreltilmiş ile kültür kuluçkaya.
- Kültür 3 kez PBS ile yıkayın.
- Cam slaytlara montaj orta kullanarak bağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültür 24 saat sonra motoneurons (MNs) zaten önemli aksonal büyüme (soma boyutundan en az 6 kat daha uzun) göstermelidir. Takip eden günlerde, akson büyümek ve dallanma (Şekil 2) görüntülemek devam etmelidir. Alt tür özelliklerine nedeniyle farklı türleri morfoloji olacak. Örneğin, ortalama sütun Aksiyel kasları innervate MNs daha kısa ve daha dallı aksonlar bacak kasları18innervate yanal motor sütun MNs daha var.
Bu yalıtım ve kodlamayla teknikler yukarıda açıklanan son zamanlarda yeni bir mutasyon neurofilament gen bir otozomal dominant aksonal formu CMT13neden olur NEFH karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu durumda, iki gün sonra kaplama, eGFP için erimiş NEFH mutant bir tür veya eGFP için erimiş vahşi türü formlar kodlama Plasmid'ler ile arıtılmış MNs transfected. İki gün sonra mutasyona uğramış NEFH eGFP toplamları hücre iskeleti ağ boyunca oluşmuş. Dört gün sonra magnetofection, bu toplamları LC3b autophagic işaretçisi (Şekil 3) içeren bir tanınmış Perinükleer aggresome içinde gelişti. Bu yaklaşım bize NEFH mutant formu birincil MNs autophagic yollar ile ilişkili olan toplamları oluşumu indüklenen göstermek için izin.
Şekil 1: yordamı ana adımları bakış. (A) E12.5 fare embriyoların disseke omurilik ventral boynuz ayıklamak için. Daha sonra ventral boynuz hücreleri neurons ayrışmış ve MNs yoğunluğu degrade kaplama önce tarafından arıtılmış. Son olarak, MNs magnetofection tarafından transfected ve bir kaç gün sonra analiz. Çatı plaka omurilik rostro kaudal ekseni boyunca forseps ile açıldığında (B) spinal kord diseksiyon ilk adımdır. O zaman, omurilik beyin gövde çekerek vücuttan ilişkisi kesildi. Bu noktada, zarları ve dorsal kök gangliyon (DRG) embriyonik gövdenin üzerinde kalır. Spinal kord dorsal parçası neşterle boyuna kesilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi MN kültür. (A)MNs morfoloji endojen neurofilament sigara fosforile ağır zinciri (SMI32) boyama tarafından ortaya kültür 4 gün sonra. Ölçek çubuğu 100 µm. (B) MNs morfolojisi 4 gün vitro sonra = ve eGFP transgene için 2 gün magnetofection tarafından transfected. MNs işaret SMI32 ya da pan-nöronal işaret Tuj1 ile counterstained. Oklar nöronların somas gösterir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Magnetofected vahşi-türü veya mutant eGFP NEFH ifade MNs confocal görüntülerini (yeşil) yapıları ve autophagic işaretleyicisinde LC3b (kırmızı) için lekeli. Oklar mutant eGFP-NEFH LC3b pozitif are da protein toplamları görüntüleyin. Ölçek çubuğu = 10 µm. resimler Jacquier ve ark. 2017, Acta Neuropathologica iletişim13değiştirilme tarihi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı kritik noktaları fare embriyo sırasında geliştirme (E12.5) sonunda elde edilen un miktarı optimize etmek için bir kesin zaman penceresinde disseke biridir. Buna ek olarak, en iyi verim için diseksiyon sabah ya da öğleden sonra erken yapılmalıdır. Daha önce E12.5 (Örneğin, E11.5 adlı), diseksiyon meninkslerde kaldırılması ile ilgili özellikle zordur. E12.5 sonra elde edilen MNs sayısı önemli ölçüde düşer. Gelişiminin embriyo aşamasında denetlemek için yetişkin kadın ve erkek ilk birlikte günün sonunda yerleştirilir. Ertesi sabah, Yetişkin ayrılır ve kadın vajinal bir fiş varlığı için kontrol edilir. Bir eklenti varsa, embriyo bu noktada geliştirme E0.5 günde sayılır. Bu deneyler için genellikle güçlü ve verimli bir fare satırını kullanın. Missouri'de yetiştirilmiş bir koloni kaynaklanan ataları bu protokol için kullanılmıştır ve zorlanma CF1 seçildi (Carworth çiftlikleri zorlanma 1). Bu zorlanma Charles River laboratuvarları Fransa 1967 yılında piyasaya sürüldü ve adı OF1 satın aldı (Oncins Fransa 1).
İkinci önemli noktası saflık kültür büyük ölçüde etkileyen Santrifüjü adımdır. MNs omurilik hücreleri (%1) düşük bir yüzdesini temsil eder ve diğer spinal nöronal hücre ve 5'ten % gliyal hücreye ataları arasında % 40-50 ans içeren bir kültür elde etmek için hedeftir. Centrifugations etkinliğini izlemek için önce ve sonra her adım MNs ortamda 24 saat boyunca kaplama alınan süspansiyon örnekleri hücre takip sabitleme ve motor nöron işaretleri Hb9 ifade (81.5C10, DSHB) için boyama veya adacık-1/adacık-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), farklı MNs subpopulation19olan kombinasyonlarını tanımlarsınız. Daha olgun MNs üzerinde Kolin asetil transferaz (sohbet, Ab144P) veya Neurofilament H fosforile sigara gibi diğer işaretleri (SMI - 32 P) kültür kalitesini belirlemede kullanılabilir. Hızlı bir şekilde arınma etkinliğini izlemek için iyi bir alternatif olarak MNs içinde yeşil flüoresan Protein (GFP) hızlı transgenik fareler kullanmaktır. Örneğin, Wichterle ve arkadaşları daha önce transgenik fareler fare (Hlxb9 veya Mnx1 olarak da adlandırılır) Hb9 organizatörü18kontrolü altında GFP ifade geliştirdi. Hb9::Gfp transgenik fareler GFP farklı ifade dendrites, akson ve omurilik embriyonik gün 9.5 postnatal gün 10 MNs somas görüntüler.
MNs keyfi bir substrat Poly-L-ornitin ve laminin kaplama tarafından elde edilen büyüme gerektirir. Plastik, polimer ve cam tabanlı konteynırları çeşitli deneysel koşullar bağlı olarak kullanılabilir (Örneğin, 6-24-, 96-şey kaplamalar, cam coverslips veya oda slaytlar). Bu seçenekler arasında mikrosıvısal aygıtları synapse oluşumu veya aksonal rehberlik ve taşıma20ile ilgili özel sorular adresi ilgi olabilir. MNs desenleri, konsantrasyon faktörler, substrat (Örneğin, sertlik), sırf stres ve kronolojik zamanmekansal degrade yardımlar (Örneğin, topografik mekanik değişiklikler içeren kendi microenvironment değişikliklere duyarlı olduğu bilinmektedir özellikler, yüzeyler desenlendirme farklı hücresel benzeşim maddeler ile). Mikrosıvısal platformlar multifaktöriyel koşulları, en uygun hücresel microenvironments belirlenmesi için izin entegre edebilirsiniz sistemlerdir.
GDNF'ın hayatta kalma etkileri7keşfinden beri Nörotrofik faktörler MN ilk büyüme ve hayatta kalma, rehberlik ve akson gelişimi ve sinaptik plastisite inducing katılan sayısı artıyor. İlginçtir ki, her faktörü MNs8belirli bir subpopulation üzerinde hareket eder. Örneğin, CNTF HGF bacak kasları innervates lateral motor sütun üzerinde (IMC) davranır, ancak Aksiyel kaslar, innervates medyan motor sütun (MMC) korumak için tarif edilmiştir. Öte yandan, GDNF ve BDNF MNs bütün nüfus üzerinde en güçlü yanlısı hayatta kalma faaliyet gösteriyor. Son olarak, GDNF, BDNF ve CNTF birleşimi MN nüfusunun % 70'den fazla korumak için yeterli ve laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılır.
Standart kültür koşullarında MNs içinde vitro 14 gün Kültür medya yarısı ile taze medya her 3 günde bir, yanında eski yerine koymak kültür beşinci gün'den başlayan tutulabilir. Vitro olgunlaşma sırasında MNs magnetofection tarafından bu iletişim kuralını kullanan herhangi bir zamanda transfected. Verimlilik ve toksisite bu tekniğin plazmit ve ekler doğanın modülasyonlu. Magnetofection MN kültür neurofilament cDNA, denetleme 9 kb plazmid CAGGS promotor (pCAGEN21) ile kullanarak 2 gün vitro sonra gerçekleştirildiğinde bizim durumumuzda biz %31.48 ± 9,94 (Standart sapma) ortalama gözlenen transfected MNs 48 saat sonrası transfection. Yine de, diğer yapıları için farklı bir oranı DNA/boncuk üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi test edilmelidir. Transfection düzey verimliliği etkileyen başka bir MNs olgunlaşma zamanla parametresidir. Gerçekten de, kültür ilk 3 gün boyunca, akson büyüme ve genişleme somas, hangi nerede boncuk nüfuz yüzey alanını artırır ortaya çıkar. Bu parametre MN transfection verimliliği olgunlaşma sırasında zaman içinde artabilir.
Son olarak, MN kültürleri ile karşılaştırıldığında, duyusal sinir hücreleri22,23,24yetiştirmek için ilginç olabilir. Özellikle, Charcot Marie Tooth tarafından distal kas atrofisi ile karakterize bir duyusal motor nöropati hem spinal MNs dejenerasyonu ve duyusal nöronlar DRGs. ilginçtir, DRGs omurilik her iki tarafında bulunan ve -ebilmek var olmak ilgili hastalıktır MNs elde etmek için kullanılan aynı diseksiyon işlem sırasında toplanan. Bu bağlamda, bu iki ilgili hücre tipleri, motoneurons ve DRG duyarlı nöronlar içinde işte patofizyolojik mekanizmaları karşılaştırmak mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
"Derneği pour le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquier'ın bursu ve AFM-Telethon için MyoNeurAlp stratejik planı ile verdiği destek için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul ve Doktor Georg Haase, geliştirme ve teknik geliştirme katılan ve onların bilgi yaymak teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
