Summary
Målet med denne teknik er at forberede en yderst højberiget kultur af primær motoneurons (MNs) fra murine rygmarven. For at vurdere konsekvenserne af mutationer forårsager MN sygdomme, vi beskriver her isolation af disse isolerede MNs og deres Transfektion af magnetofection.
Abstract
Neurodegeneration af spinal motoneurons (MNs) er impliceret i et stort spektrum af neurologiske lidelser herunder Amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom og spinal muskelatrofi, som er alle forbundet med muskelsvind. Primære kulturer af spinal MNs har været anvendes bredt til at dokumentere inddragelse af specifikke gener i sådanne sygdomme og karakterisere de cellulære konsekvenser af deres mutationer. Denne protokol modeller en primær MN kultur stammer fra den skelsættende arbejde af Henderson og kolleger mere end tyve år siden. Først, vi detalje en metode til at dissekere de forreste horn af rygmarven fra en mus Foster og isolere MNs fra tilstødende celler ved hjælp af en tæthed farveforløb. Derefter, vi præsenterer en ny måde at effektivt transfecting MNs med udtryk plasmider ved hjælp af magnetofection. Endelig vil illustrere vi hvor hen til lave og immunostain primære MNs. ved hjælp af neurofilament mutationer, der forårsager Charcot-Marie-Tooth sygdom type 2, denne protokol viser en kvalitativ tilgang til at udtrykke proteiner af interesse og studere deres inddragelse i MN vækst, vedligeholdelse og overlevelse.
Introduction
Neuromuskulære sygdomme omfatter en række klinisk, og genetisk forskellige patologier, der er karakteriseret ved ændring af muskel og/eller nervesystemet. På grund af fremskridt i sekventering teknologier, hundredvis af gener ansvarlige for disse sjældne sygdomme er blevet identificeret i det sidste årti (liste findes på Neuromuscular sygdom Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Forskellige identificerede mutationer angiver at forskellige mutationer i et enkelt gen kan forårsage forskellige fænotyper og sygdomme1,2,3 og at mutationer i forskellige gener kan producere tilsvarende fænotyper 4 , 5. i denne sammenhæng, der er bestræbelser på at udvikle cellulære modeller, der kan blive stærke redskaber til at analysere mutation konsekvenser og patologiske mekanismer.
Spinal MNs har store svovldepositioner i de ventrale horn af rygmarven, form lang axons at målrette skelet muskelfibre, og gøre det muligt for frivillige bevægelser gennem frigivelse af acetylcholin i neuromuskulære vejkryds. Da MNs påvirkes af neuromuskulære sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose, udviklet Charcot-Marie-Tooth sygdom (CMT), og spinal muskelatrofi, Dr. Henderson og kolleger den første protokol6 , der er tilladt for dyrkning af in vitro- spinal MNs og opdagelsen af neurotrope faktor GDNF7 (glial celle afledte neurotrope faktor). Tekniske forbedringer siden da har tilladt for mere præcise rensning af spinal MNs og deres undertyper bruger FACS8, men tilsætning af tæthed farveforløb forbliver stærk og udbredt i laboratorier, der i øjeblikket arbejder med primære spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. efterfølgende, det er også muligt at opnå en højere MN rensning grade gennem immunopanning ved at udnytte overflade markør p75(NTR)15,16,17.
Rygmarven indeholder forskellige undertyper af livmoderhalskræft, torakal og lumbal MNs samt median og laterale motor kolonner, der adskiller sig blandt deres placering i den forreste horn på en dorso-ventrale akse og blandt mål, der innerverer de8, 18. primære MN kulturer kan inddrive alle disse MN undertyper i fysiologiske proportioner. Den største begrænsning af denne teknik er det lave antal MNs opnået ved afslutningen af proceduren; i virkeligheden, kan det forventes at få omkring 105 MNs fra seks embryoner, som er egnet til mikroskopi men begrænsende for biokemi eksperimenter. At udføre eksperimenter med mere standardiserede undertyper og rigelige MNs (> 106 celler), embryonale stamceller-afledt MNs bør overvejes18.
Transfektion af wild-type/mutant transgener eller knockdown endogene gener i primære MNs er en hurtig og nyttigt værktøj til afkodning physiopathological veje, især når musen modeller er ikke tilgængelig. Magnetofection er en teknik til transfecting primære neuroner, svarende til lipofection uden den relaterede neurotoksicitet. Derudover kan Transfektion udføres på modne neuroner efter flere dage i vitro, i modsætning til teknik baseret på elektroporation9. En ulempe ved denne teknik er imidlertid at perlerne binde nukleinsyrer i kultur, forårsager støj i DAPI mærkning. Virusinfektion er sandsynligvis den mest effektive teknik til transfecting MNs; magnetofection kræver dog ikke visse sikkerhedsprocedurer, der er nødvendige til fremstilling af viral og cellulær infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev accepteret af det etiske udvalg af institutionen.
1. løsning forberedelse
- Forberede 10 mL 4% BSA dialysebehandling i L-15 medium.
- Opløse bovint serumalbumin pulver på 4% (w/v) i 10 mL af L-15 medium.
- Føje løsningen til en 20 mL dialyse kassette med 20 kDa afskæring. Dialyze mod 500 mL af L-15 medium i 3 dage under agitation ved 4 ° C. Ændre L-15 medium hver dag.
- Filtreres gennem et 0,22 µm membran og alikvot i 15 mL rør. Gemme rør ved-20 ° C.
Bemærk: Denne protokol bruger følgende referencer: umodificeret raw L-15 medium = L-15 medium, surt L-15 medium = pH L-15 og grundlæggende L-15 medium = bikarbonat L-15.
- Forberede 200 mL af pH L-15.
- PH-værdien af L-15 medium: først, udfylde en vaskeflaske med nogle stykker af tøris. Tilføre L-15 medium gas (CO2), indtil farven bliver orange (~ pH 6.4 og ~ 40 pres). PH kan også justeres med en standard pH-meter.
- Filtrer medium gennem et 0,22 µm membran og opbevares ved 4 ° C for en måned.
- Forberede 100 mL af bikarbonat L-15.
- Tilsættes 2,5 mL af 7% natriumbikarbonat 97.5 mL L-15 medium og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede IPCS (Insulin Putrescin Konalbumin Selenite) kosttilskud.
- Opløs 2,5 mg af insulin i 0,5 mL af 0,1 M HCl. Tilføj 4,5 mL dobbeltdestilleret vand.
- Opløse 8 mg af putrescine i 5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Opløs 100 mg af Konalbumin i 10 mL PBS.
- 1 mg natrium selenite i 19,3 mL vand opløses, ph indstilles til 7.4, og fortynd løsningen 10-fold.
- Kombiner 1 mL af insulin løsning, 1 mL af putrescine løsning, 1 mL af Konalbumin og 0,1 mL af natrium selenite løsning at opnå 3,1 mL af IPCS supplement løsning. Gemme løsningen på-20 ° C.
- Forberede en 0,02 mM progesteron løsning.
- Opløs 1 mg af progesteron i 1,6 mL 80% ethanol.
- Fortynd løsning 100-fold i 100% ethanol og opbevar den ved-20 ° C.
- Forberede 100 mL af komplet L-15 medium.
- Tilføje 1,8 mL af D-glucose opløsning (200 mg/mL) til 92 mL af pH L-15 at opnå en endelig koncentration på 3,5 mg/mL glukose.
- Kombiner 1 mL 100 x Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL), 2 mL af varme-inaktiverede hest serum, 3,1 mL IPCS mix og 0,1 mL af progesteron (2 x 10-5 M).
- Filter medie på et 0,22 µm membran og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede 5 mL af tæthed gradient løsning (endelig koncentration på 5,5%) pr. eksperiment.
- Tilføje 476 µL af den kommercielle 60% tæthed gradient medium til 4524 µL af L-15 (hvis det er muligt, uden røde phenol at øge den visuelle kontrast på interfase; fortyndingsforholdet af 1:10. 5).
- Gemme løsning ved 4 ° C i 2 uger eller fryse det ved-20 ° C.
- Forberede 10 mL af Kulturmedier.
- Tilføje 200 µL af supplement medium til 9,6 mL af neuron cellekulturmedium.
- Tilføje 200 µL af varme-inaktiverede hest serum, (som har en tendens til at differentiere glial celler prækursorer og arbejder mod spredning) til 25 µL af glutamin og 10 µL af 2-mercaptoethanol.
- Filter medier gennem et 0,22 µm filter.
- Tilføj følgende neurotrope faktorer: ciliaere neurotrope faktor (CNTF) i en endelig koncentration på 10 ng/mL, og hjernen afledte neurotrope faktor (BDNF) og glial celle afledte neurotrope faktor (GDNF) i endelige koncentrationer på 1 ng/mL.
- Gemme medier ved 4 ° C.
- Forberede 50 mL af dissektion medier.
- Tilføje 2,25 mL glukose (200 mg/mL) til 47.05 mL HBSS. Tilføje 700 µL 1 m HEPES med pH 7,4. Gemme medier ved 4 ° C.
- Forberede en 4% PFA løsning.
- 20 g af PFA i 500 mL PBS opløses.
- Under en kemisk hætte, varme løsning på 60 ° C og tilsæt et par dråber 1 M NaOH, indtil løsningen bliver klar.
- Filtreres gennem et filtrerpapir og ph indstilles til 7,2. Opbevar den ved-20 ° C.
Bemærk: Alternativt, andre kommercielle PFA løsninger kan bruges og fortyndet til 4% i PBS.
- Ren dissektion værktøjer herunder pincet, saks og silikone retter med 70% ethanol før brug og med sæbe og klart vand efter brug.
2. poly-ornithin/Laminin (Po/L) fad belægning
Bemærk: Diskenheder er tilpasset frakke en 24-godt plade.
- Hvis det er nødvendigt, skal du sætte en steril 12 mm coverslip i brønden.
- Coat brønde med 500 µL af 10 µg/mL Poly-L-ornithin løsning opløst i vand.
- Lad brøndene afregne ved stuetemperatur i 1 time.
- Fjerne Poly-L-ornithin løsningen og lufttørre for 30 min.
- Coat wells natten over ved 37 ° C med 500 µL af 3 µg/mL laminin i bikarbonat L-15.
Bemærk: Brønde kan opbevares ved 37 ° C i 7 dage i væksthuset. For lang inkubationer, kan tilføje steril PBS mellem brøndene bidrage til at undgå medium fordampning.
3. dissektion
- Ofre en gravid mus, når embryoner på embryostadiet E12.5. Rense mave med 70% ethanol.
- Fjerne livmoderen ved at skære de to æggelederne og skeden og sætte det i en petriskål, fyldt med koldt PBS (uden Ca2 + Mg2 +).
- Indsamle alle embryoner og overføre dem til frisk, kold PBS (uden Ca2 + Mg2 +) i en petriskål.
- Læg ét embryon i et fad, belagt med silikone og fuld af dissektion medier (med HBSS, 4,5 g/L glukose og 7 mM HEPES pH 7,4).
Bemærk: Embryo dissektion udføres under et mikroskop ved hjælp af ren fine pincet og saks. Alternativt, en regelmæssig petriskål uden silikone kan bruges til dissektion. - Fjern hoved, hale og indvolde, bruge pincet som saks.
- Vedligeholde embryo med maven mod silikone med pincet.
- Med et andet par pincet, indsætte en af tips i den centrale kanal af den rostralt rygmarven.
- Luk pincet til at rive den dorsale væv et par millimeter.
- Gentag denne handling mod den caudale side, indtil hele rygmarven er åben (figur 1B).
- Frigøre den rostralt del af rygmarven (cerebral trunk) fra kroppen.
- Drej Foster for at opretholde den åbne rygmarven mod silikone.
- Knib den rostralt del af rygmarven og trække embryo af hovedet for at udtrække rygmarven.
Bemærk: Meninges og dorsalrodsganglier (DRG) bør forblive knyttet til fosteret. Ellers, træk forsigtigt væk eventuelle resterende meninges og DRG stadig fastgjort til rygmarven. På dette trin kunne DRG også indsamles for følsomme neuron kultur (Se diskussion). - Flade rygmarven på silikone og fjerne den dorsale halvdel af ledningen ved at skære langs midten af hver side ved hjælp af en skalpel. Skær den midterste del i 10 stykker ved hjælp af en skalpel, og overføre brikkerne til en ny tube.
4. rygmarven cellesuspension
- Gentag denne dissektion procedure for 6 til 8 rygmarv.
- Lad rygmarven stykker indsamle i bunden af røret og erstatte HBSS med 1 mL af skinke-F10 medium.
- Tilsæt 10 µL af trypsin (2,5% w/v; slutkoncentration 0.025%). Inkuber røret i 10 minutter ved 37 ° C.
- For at stoppe den enzymatiske fordøjelse, overføre fragmenter til en ny 15 mL tube indeholder 800 µL af komplet L-15 medium, 100 µL af 4% (w/v) BSA og 100 µL af DNase (1 mg/mL i L-15 medium).
- Hakkede to gange af sugning 1 mL ved hjælp af en P1000 pipette. Lad fragmenter nøjes med 2 min. indsamle supernatanten i en frisk 15 mL tube.
- At glassplinterne, tilføje 900 µL af komplet L-15 medium, 100 µL af 4% (w/v) BSA og 100 µL af DNase (1 mg/mL i L-15 medium).
- Hakkede 6 gange af sugning 1 mL ved hjælp af en P1000 pipette. Lad fragmenter nøjes med 2 min. Tilføj supernatanten til 15 mL rør fremstillet i trin 4.5.
- At glassplinterne, tilføje 900 µL af komplet L-15 medium, 100 µL af 4% (w/v) BSA og 100 µL af DNase (1 mg/mL i L-15 medium).
- Hakkede 10 gange af sugning 1 mL ved hjælp af en P1000 pipette. Lad fragmenter nøjes med 2 min. Tilføj supernatanten til 15 mL rør fremstillet i trin 4.5. Fortsætte med supernatanten.
- Bruger en P1000 pipette, blidt sted en 2 mL BSA 4% (w/v) pude i bunden af supernatanten tube. Der centrifugeres ved 470 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspenderes celle med 2 mL af komplet L-15 medium.
5. MN berigelse af Gradient tæthed
- Opdel cellesuspension i to 15 mL rør (1 mL). Derefter tilsættes 2 mL af komplet L-15 medium. Hvis startende med 6 embryoner, skal du bruge svarende til 3 embryoner pr tube i 3 mL af medium.
- Tilsættes 2 mL af tæthed gradient løsning af langsomt tilføje løsningen i bunden af hvert rør til at opnå en skarp grænseflade.
- Der centrifugeres ved 830 x g i 15 min. ved stuetemperatur. Efter dette trin, bør små celler være i bunden af røret, boer store celler såsom MNs på grænsefladen tæthed gradient løsning/medium.
- Indsamle cellerne på grænsefladen ved sugning 1 eller 2 mL og overføre dem til en frisk 15 mL tube. Regulér lydstyrken til 10 mL med L-15 pH medium.
- Tilsættes 2 mL 4% BSA pude til bunden af røret og centrifugeres ved 470 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 3 mL af komplet L-15 medium.
- Gentag trin 5.5.
- Fjern supernatanten og resuspenderes celle i 2 mL af komplet næringssubstratet. Tælle cell antal og levedygtighed under en fase kontrast mikroskop med en hemocytometer.
Bemærk: For 6 rygmarv, celle nummer forventes at være omkring 1 x 105 MNs.
6. MN kultur
- Fortynd MNs til den passende tæthed, normalt 5.000 til 10.000 celler i 500 µL af næringssubstratet pr. brønd i en 24-godt plade.
Bemærk: Såning densitet er omkring 30.000 og 1.500 celler til 6 - og 96-godt plader, henholdsvis. - Fjerne laminin løsning med en P1000.
- Straks overføre MNs fortyndet dyrkningsmedium i belægning plader for at undgå udtørring.
- Inkuber kulturen i 2 dage ved 37 ° C.
7. Magnetofection af MNs
Bemærk: I de følgende trin er de anvendte mængder beregnet til Transfektion af et godt af en 24-godt plade. Henvises der til producentens protokollen til et andet format.
- Forberedelsen DNA resuspend 1 µg af DNA i 50 µL af neuronal næringssubstratet og vortex for 5 s.
- Perle tube forberedelse, resuspend 1,5 µL af perler i 50 µL af neuronal næringssubstratet.
- Tilsæt 50 µL perle løsning til 50 µL DNA løsning og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur (samlede volumen = 100 µL).
- Under denne inkubering, skal du trække 100 µL af næringssubstratet fra brønden, der vil være transfekteret.
Bemærk: Sætte den magnetiske plade i inkubator at varme det til 37 ° C. - Overføre 100 µL DNA/perle-mix til brønden, og der inkuberes pladen 20 – 30 min. på den magnetisk plade ved 37 ° C.
- Vent mindst 24 timer før påvisning af cDNA udtryk.
8. fiksering og farvning
- Vask kultur 2 gange med PBS.
- Inkuber kultur i 20 min. ved stuetemperatur i 4% PFA/PBS.
- Vask kultur 2 gange med PBS.
- Inkuber kulturen i 500 µL blokerende buffer (PBS, 4% BSA, 2% normal serum, 0,3% Triton X-100, 0,1 M Glycin) i 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Normale serum skal være afledt af samme art som den sekundære antistof (fx Normal ged Serum). - Inkuber kultur natten over ved 4 ° C med primær antistof fortyndet i 250 µL blokerende buffer.
Bemærk: For eksempel, TUJ1 er brugt på 1/1000, SMI32 bruges på 1/1.000, og Lc3b bruges på 1/200. - Vask kultur 3 gange med PBS.
- Inkuber kulturen med fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer fortyndet i 250 µL blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask kultur 3 gange med PBS.
- Montere på glas dias ved hjælp af montering medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 24 timer i kulturen vise motoneurons (MNs) allerede betydelige cytoskeletale vækst (mindst 6 gange længere end soma størrelsen). I de følgende dage, bør axoner fortsætte med at vokse og vise forgrening (figur 2). Der vil være forskellige morfologier på grund af subtype specificiteter. For eksempel, median kolonne MNs, der innerverer aksiale muskler har kortere og mere forgrenet axoner end laterale motor kolonne MNs, der innerverer lemmer muskler18.
Disse isolation og dyrkningsbaserede teknikker beskrevet ovenfor har for nylig været anvendt til at karakterisere en ny mutation i neurofilament-genet NEFH, der forårsager en autosomal dominerende cytoskeletale form for CMT13. I dette tilfælde var to dage efter plating, renset MNs transfekteret med plasmider kodning enten en mutant af NEFH sammenvokset til eGFP wild-type formen eller smeltet til eGFP. To dage senere, mutant NEFH-eGFP dannet aggregater langs cytoskeletal netværket. Fire dage efter magnetofection, disse aggregater udviklet sig i en fremtrædende perinuclear aggresome indeholdende LC3b autophagic markør (figur 3). Denne tilgang tilladt os at vise, at mutant form af NEFH induceret dannelse af aggregeringer, der er forbundet med autophagic veje i primære MNs.
Figur 1: oversigt over proceduren hovedtrin. (A) E12.5 mus embryoner er dissekeret for at udtrække den ventrale horn af rygmarven. Derefter, neuroner fra de ventrale horn celler der dissocieres og MNs er renset af tæthed farveforløb før plating. Endelig er MNs transfekteret af magnetofection og analyseres efter et par dage. (B) det første skridt i rygmarven dissektion er når topplade af rygmarven er åbnet langs den rostro-caudale akse med pincet. Derefter, rygmarven er skilt fra kroppen ved at trække den cerebrale trunk. På dette tidspunkt, forbliver meninges og dorsalrodsganglier (DRG) på det embryonale organ. Den dorsale del af rygmarven er skåret på langs med en skalpel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative MN kultur. (A) MNs morfologi efter 4 dages kultur afsløret ved farvning af endogene ikke fosforyleret neurofilament tunge kæde (SMI32). Skalalinjen = 100 µm. (B) MNs morfologi efter 4 dage i vitro og transfekteret for eGFP transgenet ved magnetofection på dag 2. MNs var counterstained med markør SMI32 eller den pan-neuronal markør Tuj1. Pilene viser svovldepositioner af neuroner. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konfokal billeder af magnetofected MNs udtrykker wild-type eller mutant eGFP-NEFH konstruktioner (med grønt) og farves for den autophagic markør LC3b (i rødt). Pilene viser mutant eGFP-NEFH protein aggregeringer, der er også LC3b positive. Skalalinjen = 10 µm. billeder er ændret fra Jacquier et al. 2017, Acta Neuropathologica meddelelse13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En af de kritiske punkter i denne protokol er at mus embryoner er dissekeret på en præcis tidsvindue under udvikling (E12.5) til at optimere størrelsen af MNs opnået ved afslutningen. For optimal udbytte, skal der desuden udføres et dissektion, i morgen eller tidligt på eftermiddagen. Før E12.5 (f.eks. på E11.5) er dissektion svært, især med hensyn til afskaffelse af meninges. Efter E12.5 falder antallet af opnåede MNs markant. For at styre embryo udviklingstrin, voksne hunner og hanner er første gang bragt sammen i slutningen af dagen. Den næste morgen, voksne er adskilt, og hunner er kontrolleret for tilstedeværelsen af en vaginal plug. Hvis et stik er til stede, er embryoner på dette tidspunkt anses for at være i E0.5 dag af udvikling. For disse eksperimenter bruger vi typisk en mus linje, der er kraftig og produktiv. Ophavene med oprindelse fra en koloni opdrættet i Missouri blev brugt i denne protokol, og stammen blev opkaldt CF1 (Carworth gårde stamme 1). Denne stamme blev introduceret på Charles River Laboratories Frankrig i 1967, og det er erhvervet navnet OF1 (Oncins Frankrig 1).
Et andet kritisk punkt er centrifugering trinnene stor indflydelse renheden af kulturen. MNs repræsenterer en lav procentdel af rygmarven celler (omkring 1%), og målet er at opnå en kultur, der indeholder 40-50% MNs blandt andre spinal neuronale celler og mindre end 5% glial celler stamfaderen. At overvåge effekten af centrifugations, cell suspension prøver erhvervet før og efter hvert trin kan være forgyldt i MNs medium for 24 timer, efterfulgt af fastsættelse og farvning for udtryk for motorneuron markører Hb9 (81.5C10, DSHB) eller Holmen-1/Holmen-2 (ISL1 / 2, 40.2D6 /39.4D5, DSHB), hvis kombinationer definere forskellige MNs delpopulation19. På mere modne MNs, kan andre markører som cholin-Acetyl-Transferase (CHAT, Ab144P) eller Neurofilament H ikke fosforyleret (SMI - 32 P) anvendes til at vurdere kvaliteten af kulturen. Et godt alternativ til hurtigt overvågning af effektiviteten af rensning er at bruge Transgene mus, der udtrykker den grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis) specifikt i MNs. For eksempel, udviklet Wichterle og kolleger tidligere Transgene mus udtryk for normal god landbrugspraksis under kontrol af mus Hb9 (også kaldet Hlxb9 eller Mnx1) promotor18. Hb9::GFP Transgene mus vise forskellige udtryk for normal god landbrugspraksis i dendritter, axoner og svovldepositioner af spinal MNs fra embryonale dag 9.5 til postnatal dag 10.
MNs kræver vækst på en eftergivende underlag indhentet af Poly-L-ornithin og laminin belægning. Afhængigt af eksperimentelle betingelser, der kan bruges en række plast-, polymer- og glas-baserede beholdere (f.eks. 6-, 24-, 96-brønd plader, glas coverslips, eller kammer dias). Blandt disse muligheder, kan mikrofluid enheder være af interesse at behandle specifikke spørgsmål vedrørende synapse dannelse eller cytoskeletale vejledning og transport20. MNs er kendt for at være følsomme over for ændringer i deres mikromiljø, der omfatter mønstre, koncentration faktorer, mekaniske ændringer i substratet (fx stivhed), lutter stress og spatiotemporelle gradient stikord (fx Topografisk funktioner, mønstre på overflader med stoffer i forskellige cellulære tilhørsforhold). Mikrofluid platforme er systemer, der kan integrere multifaktoriel betingelser, giver mulighed for bestemmelse af optimal cellulære microenvironments.
Siden opdagelsen af GDNFS overlevelse effekter7vokser antallet af neurotrope faktorer involveret i MN indledende vækst og overlevelse, vejledning og udvikling af axoner, og overtalelse af synaptisk plasticitet. Interessant, handlinger hver faktor på en bestemt delpopulation af MNs8. For eksempel er CNTF blevet beskrevet for at beskytte den mediane motor kolonne (MMC), som innerverer aksiale muskler, der henviser til, at HGF fungerer på den laterale motor kolonne (LMC) som innerverer lemmer muskler. På den anden side viser GDNF og BDNF både den stærkeste Pro overlevelse aktivitet på hele populationer af MNs. Endelig, kombinationen af GDNF, BDNF og CNTF er tilstrækkelige til at beskytte mere end 70% af MN indbyggere og er almindeligt anvendt i laboratorier.
I standard dyrkningsbetingelser, kan MNs holdes in vitro til 14 dage ved at udskifte halvdelen af kultur medier med friske medier en gang hver 3 dag, start fra den femte dag i kultur. Under in vitro- modning, kan MNs være transfekteret af magnetofection til enhver tid ved hjælp af denne protokol. Effektivitet og toksicitet af denne teknik kan moduleres af arten af plasmider og skær. I vores tilfælde, da magnetofection blev udført på MN kultur efter 2 dage i vitro ved hjælp af en 9 kb plasmid med en CAGGS promotor (pCAGEN21) kontrol neurofilament cDNA, vi observeret gennemsnitligt 31.48% ± 9.94 (standardafvigelse) af transfekteret MNs 48 timer efter Transfektion. Ikke desto mindre for andre konstruktioner, et andet ratio af DNA/perler, afprøves som beskrevet i producentens protokol. En anden parameter, der kan påvirke Transfektion niveau effektivitet er modning af MNs over tid. Faktisk, de første 3 dage af kultur, vækst af axoner og udvidelsen af svovldepositioner vil forekomme, som øger overfladearealet hvor perlerne vil trænge ind. Denne parameter kan øge MN Transfektion effektivitet over tid under modning.
I forhold til MN kulturer, ville det være interessant at dyrke sensoriske neuroner22,23,24. Især er Charcot-Marie-Tooth sygdom en sensorisk motoriske neuropati karakteriseret ved distale muskelatrofi relateret til degeneration af både spinal MNs og sensoriske neuroner i DRG. interessant, DRG er beliggende på begge sider af rygmarven og kan være indsamlet i løbet af den samme dissektion procedure anvendes til at opnå MNs. I denne forbindelse er det muligt at sammenligne de patofysiologiske mekanismer på arbejde i disse to relevante celletyper, motoneurons og DRG følsomme neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke den "Association pour le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquier fellowship og AFM-Telethon for dets støtte gennem MyoNeurAlp strategiske plan. Vi vil også gerne takke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul og Dr. Georg Haase, der deltog i udvikling og forbedring af teknik og sprede deres viden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
