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Neuroscience

Transfecting माउस प्राथमिक Motoneurons द्वारा इन विट्रो में Charcot-Marie-टूथ रोग मॉडलिंग

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/57988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Institut NeuroMyoGène, CNRS UMR5310, INSERM U1217, Université Lyon, 2Unité Fonctionnelle de Neurogénétique Moléculaire, Hospices Civils de Lyon, 3Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon

Summary

इस तकनीक का लक्ष्य murine रीढ़ की हड्डी से प्राथमिक motoneurons (मनसे) की एक अत्यधिक समृद्ध संस्कृति तैयार करना है. MN रोगों के कारण उत्परिवर्तनों के परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए, हम यहां magnetofection द्वारा इन अलग MNs और उनके अभिकर्मक के अलगाव का वर्णन ।

Abstract

Neurodegeneration स्पाइनल motoneurons (मनसे) पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-दांत रोग, और रीढ़ की मांसपेशियों शोष, जो सभी मांसपेशियों शोष के साथ जुड़े रहे हैं सहित स्नायविक विकारों के एक बड़े स्पेक्ट्रम में फंसा है । रीढ़ की हड्डी MNs की प्राथमिक संस्कृतियों व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है ऐसे रोगों में विशिष्ट जीन की भागीदारी का प्रदर्शन और उनके उत्परिवर्तनों के सेलुलर परिणामों की विशेषता । इस प्रोटोकॉल मॉडल एक प्राथमिक MN हेंडरसन और सहयोगियों से अधिक बीस साल पहले के लाभदायक काम से व्युत्पंन संस्कृति । सबसे पहले, हम विस्तार एक माउस भ्रूण से रीढ़ की हड्डी के पूर्वकाल सींग विदारक और पड़ोसी कोशिकाओं से MNs अलग एक घनत्व ढाल का उपयोग करने का एक तरीका है । उसके बाद, हम magnetofection का उपयोग plasmids अभिव्यक्ति के साथ कुशलता से transfecting MNs का एक नया तरीका प्रस्तुत करते हैं । अंत में, हम वर्णन कैसे ठीक करने के लिए और immunostain प्राथमिक MNs । neurofilament उत्परिवर्तनों कि कारण Charcot-Marie-टूथ रोग प्रकार 2 का उपयोग कर, इस प्रोटोकॉल ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने और उनकी भागीदारी का अध्ययन करने के लिए एक गुणात्मक दृष्टिकोण दर्शाता है MN विकास, रखरखाव, और अस्तित्व ।

Introduction

Neuromuscular रोग चिकित्सीय और आनुवंशिक रूप से अलग विकृतियों कि मांसपेशियों और/या तंत्रिका तंत्र के परिवर्तन की विशेषता है की एक किस्म शामिल हैं । अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में अग्रिमों के कारण, इन दुर्लभ विकारों के लिए जिंमेदार जीन के सैकड़ों पिछले दशक के दौरान की पहचान की गई है (Neuromuscular रोग केंद्र, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html पर उपलब्ध सूची) । की पहचान की उत्परिवर्तनों की विविधता इंगित करता है कि एक जीन में विभिंन उत्परिवर्तनों अलग phenotypes और1,2,3 रोगों का कारण हो सकता है और विभिंन जीनों में उत्परिवर्तनों समान phenotypes का उत्पादन कर सकते है 4 , 5. इस संदर्भ में, वहां सेलुलर मॉडल है कि उत्परिवर्तन परिणाम और रोग तंत्र का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली उपकरण बन सकता है विकसित करने के लिए प्रयास कर रहे हैं ।

स्पाइनल अजेंडे बड़ी सोमाs रीढ़ की हड्डी के ventral सींग में स्थित है, कंकाल की मांसपेशी फाइबर लक्ष्य के लिए फार्म लंबा axons, और neuromuscular जंक्शनों पर acetylcholine की रिहाई के माध्यम से स्वैच्छिक आंदोलनों के लिए अनुमति देते हैं । MNs के बाद से पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग (CMT), और रीढ़ की मांसपेशियों शोष, Dr. हेंडरसन और सहयोगियों की खेती के लिए अनुमति दी है कि पहली प्रोटोकॉल 6 विकसित के रूप में neuromuscular रोगों से प्रभावित कर रहे है इन विट्रो में स्पाइनल एमएनएस और neurotrophic फैक्टर GDNF7 (glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic फैक्टर) की खोज में जुटे हैं । तकनीकी शोधन तब से रीढ़ की हड्डी के अधिक सटीक शुद्धिकरण के लिए अनुमति दी है मनसे और उनके FACS8का उपयोग कर प्रकार, लेकिन घनत्व ढाल द्वारा संवर्धन शक्तिशाली रहता है और व्यापक रूप से वर्तमान में प्राथमिक रीढ़ की हड्डी के साथ काम कर रहे प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. तत्पश्चात्, यह भी संभव है कि सतह मार्कर p75(NTR)15,16,17के लाभ लेने के द्वारा immunopanning के माध्यम से एक उच्च एमएन शुद्धि ग्रेड प्राप्त करने के लिए ।

रीढ़ की हड्डी ग्रीवा, वक्ष, और काठ का MNs के विभिन्न उपप्रकार शामिल हैं, साथ ही माध्य और पार्श्व मोटर कॉलम है कि एक dorso-ventral धुरी पर पूर्वकाल सींग में उनके स्थान के बीच में अलग और लक्ष्य वे 8 अंदर आनाके बीच, 18. प्राथमिक mn संस्कृतियों शारीरिक अनुपात में इन mn उपप्रकार के सभी ठीक हो सकता है । इस तकनीक की मुख्य सीमा प्रक्रिया के अंत में प्राप्त अजेंडे की कम संख्या है; वास्तव में, यह छह भ्रूण, जो माइक्रोस्कोपी लेकिन जैव रसायन प्रयोगों के लिए सीमित के लिए उपयुक्त है से 105 मनसे के आसपास प्राप्त करने की उंमीद कर सकते हैं । अधिक मानकीकृत उपप्रकारों और प्रचुर मात्रा में mns (> 106 कोशिकाओं) के साथ प्रयोग करने के लिए, भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पंन मनसे18माना जाना चाहिए ।

अभिकर्मक के जंगली-प्रकार/उत्परिवर्ती transgenes या पछाड़ना अंतर्जात जीन प्राथमिक MNs में physiopathological रास्ते, विशेष रूप से जब माउस मॉडल अनुपलब्ध है समझने के लिए एक तेजी से और उपयोगी उपकरण है । Magnetofection transfecting प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए एक तकनीक है, संबंधित neurotoxicity के बिना lipofection के समान. इसके अलावा, अभिकर्मक में कई दिनों के बाद परिपक्व ंयूरॉंस पर किया जा सकता है विट्रो,9electroporation के आधार पर तकनीक के विपरीत । हालांकि, इस तकनीक का एक नुकसान यह है कि मोतियों की संस्कृति में न्यूक्लिक एसिड बांध, DAPI लेबलिंग में शोर पैदा कर रहा है । वायरल संक्रमण की संभावना transfecting MNs के लिए सबसे कुशल तकनीक है; हालांकि, magnetofection कुछ सुरक्षा वायरल उत्पादन और सेलुलर संक्रमण के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है ।

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Protocol

पशुओं को शामिल करने वाली सभी प्रक्रियाओं को संस्था की नैतिक समिति ने स्वीकार कर लिया ।

1. समाधान तैयारी

  1. एल-15 मीडियम में 4% BSA dialyzed के 10 मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. एल-15 मध्यम के 10 मिलीलीटर में 4% (डब्ल्यू/वी) पर गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन पाउडर भंग ।
    2. एक 20 मिलीलीटर डायलिसिस कैसेट के साथ समाधान जोड़ें 20 केडीए की कट ऑफ । 4 ° c पर आंदोलन के तहत 3 दिनों के लिए एल के ५०० एमएल के खिलाफ Dialyze-15 मध्यम । हर दिन एल-15 मीडियम बदलें ।
    3. एक ०.२२ µm झिल्ली के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और 15 मिलीलीटर ट्यूबों में aliquot । -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों की दुकान ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है निंन संदर्भ: unmodified कच्चे एल-15 मध्यम = एल-15 मध्यम, अंलीय एल-15 मध्यम = पीएच एल 15, और बुनियादी एल-15 मध्यम = बिकारबोनिट एल-15 ।
  2. पीएच एल-15 के २०० मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. एल के पीएच-15 मध्यम समायोजित करें: सबसे पहले, सूखी बर्फ के कुछ टुकड़े के साथ एक धोने की बोतल भरें । इंजेक्षन गैस (CO2) एल में-15 मध्यम जब तक रंग नारंगी जाता है (~ पीएच ६.४ और ~ ४० दबाव) । पीएच भी एक मानक पीएच मीटर के साथ समायोजित किया जा सकता है ।
    2. एक ०.२२ µm झिल्ली के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर और एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  3. बिकारबोनिट एल-15 की १०० मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. 7% सोडियम बिकारबोनिट की २.५ मिलीलीटर जोड़ें L-15 मध्यम और 4 ° c पर स्टोर के ९७.५ मिलीलीटर ।
  4. IPCS (इंसुलिन Putrescin Conalbumin Selenite) की खुराक तैयार करें ।
    1. ०.१ एम एचसीएल के ०.५ मिलीलीटर में इंसुलिन की २.५ मिलीग्राम भंग. डबल आसुत पानी की ४.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. 8 फॉस्फेट के 5 मिलीलीटर में putrescine के मिलीग्राम भंग-बफर खारा (पंजाब) ।
    3. पंजाब के 10 मिलीलीटर में conalbumin के १०० मिलीग्राम भंग ।
    4. भंग 1 पानी की १९.३ मिलीलीटर में सोडियम selenite के मिलीग्राम, ७.४ के लिए पीएच समायोजित, और समाधान 10 गुना पतला ।
    5. 1 मिलीलीटर इंसुलिन समाधान का मिश्रण, putrescine समाधान की 1 मिलीलीटर, conalbumin के 1 मिलीलीटर, और सोडियम selenite के ०.१ मिलीलीटर IPCS पूरक समाधान के ३.१ मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए समाधान । -20 ° c पर समाधान संग्रहीत है ।
  5. एक ०.०२ mM प्रोजेस्टेरोन समाधान तैयार करें ।
    1. भंग 1 ८०% इथेनॉल के १.६ मिलीलीटर में प्रोजेस्टेरोन के मिलीग्राम ।
    2. पतला समाधान १००-१००% इथेनॉल में गुना और यह दुकान पर-20 ° c ।
  6. तैयार १०० मिलीलीटर की पूरी एल-15 मध्यम ।
    1. १.८ एमएल के डी ग्लूकोज समाधान (२०० मिलीग्राम/एमएल) के ९२ मिलीलीटर पीएच एल-15 के लिए एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें ३.५ मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज ।
    2. 1 मिलीलीटर 100x पेनिसिलिन-Streptomycin (१०,००० U/एमएल), गर्मी के 2 मिलीलीटर-निष्क्रिय हार्स सीरम, IPCS मिश्रण के ३.१ मिलीलीटर, और प्रोजेस्टेरोन समाधान के ०.१ मिलीलीटर (2 x 10-5 एम) का मिश्रण ।
    3. एक ०.२२ µm झिल्ली पर मध्यम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
  7. घनत्व ढाल समाधान के 5 मिलीलीटर तैयार (प्रति प्रयोग ५.५% की अंतिम एकाग्रता) ।
    1. वाणिज्यिक ६०% घनत्व ढाल माध्यम के ४७६ µ एल जोड़ें एल के ४५२४ µ एल-15 (यदि संभव हो, लाल phenol के बिना के लिए चरण में दृश्य कंट्रास्ट वृद्धि; 1:10.5 के कमजोर पड़ने अनुपात) ।
    2. 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान या-20 डिग्री सेल्सियस पर इसे फ्रीज ।
  8. संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
    1. पूरक मध्यम के २०० µ एल जोड़ें ंयूरॉन सेल संस्कृति माध्यम के ९.६ मिलीलीटर ।
    2. जोड़ें २०० µ गर्मी के निष्क्रिय हार्स सीरम (जो glial कोशिका के अग्रदूतों और प्रसार के खिलाफ काम करता है अंतर करने के लिए जाता है) के लिए 25 µ एल के glutamine और 10 µ एल के 2-mercaptoethanol ।
    3. एक ०.२२ µm फ़िल्टर के माध्यम से मीडिया को फ़िल्टर करें ।
    4. निम्नलिखित neurotrophic कारकों जोड़ें: सिलिअरी neurotrophic फैक्टर (CNTF) के एक अंतिम एकाग्रता पर 10 एनजी/एमएल, और मस्तिष्क व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ) और glial कोशिका व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (GDNF) के अंतिम सांद्रता पर 1 एनजी/
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया स्टोर ।
  9. विच्छेदन मीडिया के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    1. HBSS के ४७.०५ मिलीलीटर के लिए २.२५ मिलीलीटर ग्लूकोज (२०० मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें । ७०० पीएच ७.४ के साथ 1 एम HEPES के µ एल जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया स्टोर ।
  10. एक 4% पीएफए समाधान तैयार करें ।
    1. पंजाब के ५०० मिलीलीटर में पीएफए के 20 ग्राम भंग ।
    2. एक रासायनिक डाकू के तहत, ६० डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान गर्मी और 1 मीटर NaOH की कुछ बूंदें जोड़ने जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है ।
    3. फ़िल्टर काग़ज़ के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें और ७.२ करने के लिए पीएच समायोजित करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अंय वाणिज्यिक पीएफए समाधान इस्तेमाल किया जा सकता है और पंजाब में 4% से पतला ।
  11. उपयोग करने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ संदंश, कैंची, और सिलिकॉन व्यंजन सहित विच्छेदन उपकरण साफ, और उपयोग के बाद साबुन और साफ पानी के साथ ।

2. पाली-ornithine/Laminin (पीओ/एल) डिश कोटिंग

नोट: खंड कोट एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए अनुकूलित कर रहे हैं ।

  1. यदि आवश्यक हो, एक बाँझ 12 मिमी coverslip में अच्छी तरह से डाल दिया ।
  2. कोट कुओं के साथ ५०० µ l के 10 µ g/एमएल पाली-l-Ornithine हल पानी में घुल.
  3. कुएँ को १ एच के लिए कमरे के तापमान पर बसा दें.
  4. पाली-एल-Ornithine समाधान और 30 मिनट के लिए हवा सूखी निकालें ।
  5. कोट ३७ ° c पर रात भर कुएं के साथ ५०० µ एल के 3 µ g/एमएल laminin के बिकारबोनिट एल-15 में ।
    नोट: वेल्स मशीन में 7 दिनों के लिए ३७ ° c पर संग्रहित किया जा सकता है । लंबी गर्मी के लिए, कुओं के बीच बाँझ पंजाबियों जोड़ने के लिए मध्यम वाष्पीकरण से बचने में मदद कर सकते हैं ।

3. विच्छेदन

  1. एक गर्भवती माउस त्यागें जब भ्रूण पर कर रहे है भ्रूण स्तर e 12.5 । ७०% इथेनॉल के साथ पेट साफ ।
  2. दो oviducts और योनि को काटने से गर्भ को हटा दें और ठंडे पंजाबियों से भरे पेट्री डिश में डाल दें (बिना सीए2 + मिलीग्राम2 +) ।
  3. सभी भ्रूण ले लीजिए और एक पेट्री डिश में ताजा, ठंडे पंजाबियों (Ca2 + मिलीग्राम2 +) के बिना) के लिए स्थानांतरण ।
  4. एक सिलिकॉन के साथ लेपित पकवान में एक भ्रूण रखो और विच्छेदन मीडिया से भरा (HBSS, ४.५ g/L ग्लूकोज के साथ, और 7 मिमी HEPES पीएच ७.४) ।
    नोट: भ्रूण विच्छेदन स्वच्छ ठीक संदंश और कैंची का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, सिलिकॉन के बिना एक नियमित पेट्री डिश विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. सिर, पूंछ, और आंत, कैंची के रूप में संदंश का उपयोग कर निकालें ।
  6. संदंश के साथ सिलिकॉन के खिलाफ पेट के साथ भ्रूण बनाए रखें ।
  7. संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ, rostral रीढ़ की हड्डी के केंद्रीय नहर में सुझावों में से एक डालें ।
  8. संदंश बंद पृष्ठीय ऊतक कुछ मिलीमीटर आंसू ।
  9. caudal पक्ष की ओर इस आपरेशन दोहराने जब तक पूरे रीढ़ की हड्डी खुला है (आंकड़ा 1b) ।
  10. शरीर से रीढ़ की हड्डी (सेरेब्रल ट्रंक) के rostral हिस्सा अलग ।
  11. बारी भ्रूण सिलिकॉन के खिलाफ खुला रीढ़ की हड्डी को बनाए रखने के लिए ।
  12. रीढ़ की हड्डी के rostral भाग चुटकी और रीढ़ की हड्डी को निकालने के लिए सिर से भ्रूण खींच ।
    नोट: मेनिन्जेस और पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (DRGs) भ्रूण से जुड़े रहना चाहिए । अंयथा, ध्यान से दूर किसी भी शेष मेनिन्जेस और रीढ़ की हड्डी से जुड़ी DRGs अभी भी खींच । इस कदम पर, DRGs भी संवेदनशील ंयूरॉन संस्कृति के लिए एकत्र किया जा सकता है (चर्चा देखें) ।
  13. सिलिकॉन पर रीढ़ की हड्डी को समतल और एक स्केलपेल का उपयोग कर प्रत्येक पक्ष के बीच के साथ काटने से गर्भनाल के पृष्ठीय आधा हटा दें । एक स्केलपेल का उपयोग कर 10 टुकड़ों में मध्य भाग में कटौती, और एक नई ट्यूब के लिए टुकड़े हस्तांतरण ।

4. स्पाइनल कॉर्ड सेल सस्पेंशन

  1. 6 से 8 रीढ़ की हड्डी के लिए इस विच्छेदन प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  2. रीढ़ की हड्डी के टुकड़े ट्यूब के तल पर इकट्ठा करने और हैम के 1 मिलीलीटर-F10 मध्यम के साथ HBSS की जगह चलो ।
  3. trypsin के 10 µ l को जोड़ें (२.५% w/v; अंतिम एकाग्रता ०.०२५%) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूब मशीन ।
  4. एंजाइमी पाचन को रोकने के लिए, एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब को पूरा एल के ८०० µ l-15 मध्यम, 4% (डब्ल्यू/वी) BSA के १०० µ एल, और १०० µ एल के लिए टुकड़े हस्तांतरण (1 मिलीग्राम/एमएल में एल-15 मध्यम) ।
  5. एक P1000 पिपेट का उपयोग करके aspirating 1 मिलीलीटर से दो बार Triturate । टुकड़े 2 मिनट के लिए व्यवस्थित चलो एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में supernatant लीजिए ।
  6. टुकड़े करने के लिए, पूरा एल के ९०० µ एल-15 मध्यम, 4% के १०० µ एल जोड़ें (डब्ल्यू/वी) BSA, और १०० µ एल के DNase (1 मिलीग्राम/एमएल में एल-15 मध्यम) ।
  7. Triturate द्वारा 6 बार aspirating 1 मिलीलीटर का प्रयोग कर एक P1000 पिपेट । टुकड़े 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करते हैं. supernatant 15 एमएल ४.५ चरण में प्राप्त ट्यूब के लिए जोड़ें ।
  8. टुकड़े करने के लिए, पूरा एल के ९०० µ एल-15 मध्यम, 4% के १०० µ एल जोड़ें (डब्ल्यू/वी) BSA, और १०० µ एल के DNase (1 मिलीग्राम/एमएल में एल-15 मध्यम) ।
  9. Triturate द्वारा 10 बार aspirating 1 मिलीलीटर का प्रयोग कर एक P1000 पिपेट । टुकड़े 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करते हैं. supernatant 15 एमएल ४.५ चरण में प्राप्त ट्यूब के लिए जोड़ें । supernatant के साथ आगे बढ़ें ।
  10. एक P1000 प्लास्टिक का प्रयोग, धीरे supernatant ट्यूब के तल पर एक 2 मिलीलीटर BSA 4% (डब्ल्यू/ 5 मिनट के लिए ४७० x g पर केंद्रापसारक ।
  11. supernatant निकालें और पूरा एल के 2 मिलीलीटर के साथ सेल गोली पुनः स्थगित-15 मध्यम ।

५. ग्रैडिएंट घनत्व द्वारा MN संवर्धन

  1. सेल निलंबन २ १५ मिलीलीटर ट्यूबों (1 मिलीलीटर प्रत्येक) में विभाजित । फिर, पूरा एल के 2 मिलीलीटर-15 मध्यम जोड़ें । अगर 6 भ्रूण के साथ शुरू, मध्यम के 3 मिलीलीटर में ट्यूब प्रति 3 भ्रूण के बराबर का उपयोग करें ।
  2. धीरे से एक तेज अंतरफलक प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के नीचे करने के लिए समाधान जोड़ने से घनत्व ढाल समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ८३० x g पर केंद्रापसारक । इस कदम के बाद, छोटे कोशिकाओं ट्यूब के तल पर होना चाहिए, जबकि इस तरह के अजेंडे के रूप में बड़ी कोशिकाओं को घनत्व ढाल समाधान/
  4. aspirating 1 या 2 मिलीलीटर द्वारा इंटरफेस पर कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए उन्हें हस्तांतरण । एल-15 पीएच माध्यम के साथ 10 मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें ।
  5. ट्यूब के नीचे से 4% BSA तकिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ४७० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. supernatant निकालें और पूरा एल के 3 मिलीलीटर में गोली पुनः स्थगित-15 मध्यम ।
  7. चरण ५.५ दोहराएँ ।
  8. supernatant निकालें और पूरा संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । एक hemocytometer के साथ एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत सेल संख्या और व्यवहार्यता गिनती ।
    नोट: 6 रीढ़ की हड्डी के लिए, सेल संख्या के आसपास 1 x 105 MNs होने की उंमीद है ।

6. एमएन कल्चर

  1. उपयुक्त घनत्व के अजेंडे को पतला, आमतौर पर ५,००० के लिए १०,००० कोशिकाओं में एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के ५०० µ एल में ।
    नोट: बीज घनत्व ३०,००० और 6 के लिए १,५०० कोशिकाओं के आसपास है और ९६-अच्छी तरह से प्लेटें, क्रमशः ।
  2. एक P1000 के साथ laminin समाधान निकालें ।
  3. तुरंत कल्चरल मीडियम में पतला होने वाले अजेंडे को सुखाने से बचने के लिए कोटिंग प्लेट्स में ट्रांसफर करें ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए संस्कृति की मशीन ।

7. मनसे का Magnetofection

नोट: निम्न चरणों में, उपयोग की गई मात्रा एक 24-well प्लेट की एक अच्छी तरह से अभिकर्मक के लिए होती हैं । कृपया किसी अंय स्वरूप के लिए निर्माता का प्रोटोकॉल देखें ।

  1. डीएनए तैयार करने के लिए, 5 एस के लिए न्यूरॉनल कल्चरल मीडियम और भंवर के ५० µ एल में डीएनए के 1 µ जी को फिर से सस्पेंड करें ।
  2. मनका ट्यूब तैयारी के लिए, ५० µ एल में मोतियों की १.५ µ एल resuspend ंयूरॉन संस्कृति माध्यम के ।
  3. ५० µ एल मनका समाधान जोड़ें ५० µ एल डीएनए समाधान और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन (कुल मात्रा = १०० µ एल) ।
  4. इस मशीन के दौरान, संस्कृति के माध्यम से १०० µ एल को वापस लेने के लिए अच्छी तरह से है कि transfected किया जाएगा ।
    नोट: यह ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म करने के लिए मशीन में चुंबकीय प्लेट रखो ।
  5. डीएनए/मनका मिश्रण के १०० µ एल स्थानांतरण अच्छी तरह से करने के लिए, और 20 प्लेट गर्मी-३७ डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय प्लेट पर 30 मिनट ।
  6. सीडीएनए व्यंजक का पता लगाने से पहले कम से 24 h तक प्रतीक्षा करें ।

8. निर्धारण और धुंधला

  1. संस्कृति को 2 बार पंजाबियों से धोएं ।
  2. 4% पीएफए में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए संस्कृति की मशीन/
  3. संस्कृति को 2 बार पंजाबियों से धोएं ।
  4. बफर अवरुद्ध के ५०० µ एल में संस्कृति की मशीन (पंजाब, 4% BSA, 2% सामांय सीरम, ०.३% ट्राइटन एक्स-१००, ०.१ M glycine) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
    नोट: सामान्य सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, सामान्य बकरी सीरम) के रूप में एक ही प्रजाति से व्युत्पंन किया जाना चाहिए.
  5. मुख्य एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति की मशीन को अवरुद्ध बफर के २५० µ l में पतला ।
    नोट: उदाहरण के लिए, TUJ1 1/1000 पर उपयोग किया जाता है, SMI32 1/1000 पर उपयोग किया जाता है, और Lc3b 1/200 पर उपयोग किया जाता है ।
  6. संस्कृति को 3 बार पंजाबियों से धोएं ।
  7. fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संस्कृति की गर्मी के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर के २५० µ एल में पतला ।
  8. संस्कृति को 3 बार पंजाबियों से धोएं ।
  9. माउंट बढ़ते माध्यम का उपयोग कर कांच स्लाइड पर ।

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Representative Results

संस्कृति में 24 घंटे के बाद motoneurons (मनसे) को पहले से ही महत्वपूर्ण axonal वृद्धि (सोमा आकार से कम 6 गुना अधिक) दिखाना चाहिए । अगले दिनों में, axons बढ़ने और शाखाओं का प्रदर्शन (चित्रा 2) जारी रखना चाहिए । उपप्रकारीय विशिष्ठताओं के कारण विभिन्न morphologies होंगे । उदाहरण के लिए, माध्य स्तंभ mns कि अंदर आना अक्षीय मांसपेशियों को पार्श्व मोटर स्तंभ mns की तुलना में कम और अधिक बंटी axons है कि अंदर आना अंग मांसपेशियों18.

इन अलगाव और संवर्धन तकनीक ऊपर वर्णित हाल ही में neurofilament जीन NEFH है कि13axonal के एक autosomal प्रमुख CMT रूप का कारण बनता है में एक नया उत्परिवर्तन विशेषताएं इस्तेमाल किया गया है । इस मामले में, चढ़ाना के बाद दो दिन, शुद्ध MNs या तो NEFH के एक उत्परिवर्ती रूप eGFP या जंगली प्रकार eGFP से जुड़े फार्म से जुड़े plasmids एंकोडिंग के साथ transfected थे । दो दिन बाद, उत्परिवर्ती NEFH-eGFP cytoskeletal नेटवर्क के साथ समुच्चय का गठन किया । चार दिन magnetofection के बाद, इन समुच्चय LC3b autophagic मार्कर (चित्रा 3) युक्त एक प्रमुख perinuclear aggresome में विकसित । इस दृष्टिकोण हमें प्रदर्शन करने की अनुमति दी है कि NEFH के उत्परिवर्ती फार्म समुच्चय है कि प्राथमिक MNs में autophagic रास्ते से जुड़े रहे है के गठन प्रेरित किया ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया मुख्य चरणों का अवलोकन. (क) ई 12.5 माउस भ्रूण रीढ़ की हड्डी के ventral सींग निकालने के लिए विच्छेदित कर रहे हैं । फिर, ventral सींग कोशिकाओं से ंयूरॉंस असंबद्ध और MNs चढ़ाना से पहले घनत्व ढाल द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । अंत में, MNs magnetofection द्वारा transfected और कुछ दिनों के बाद विश्लेषण कर रहे हैं । (ख) रीढ़ की हड्डी विच्छेदन में पहला कदम है जब रीढ़ की हड्डी की छत की थाली संदंश के साथ rostro-caudal धुरी के साथ खोला है । फिर, रीढ़ की हड्डी मस्तिष्क ट्रंक खींच द्वारा शरीर से अलग है । इस बिंदु पर, मेनिन्जेस और पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) भ्रूण शरीर पर रहते हैं । रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय भाग एक स्केलपेल के साथ longitudinally काट रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि MN संस्कृति । (क) अंतर्जात गैर phosphorylated neurofilament भारी श्रृंखला (SMI32) के दाग से पता चला संस्कृति के 4 दिनों के बाद मनसे आकृति विज्ञान । स्केल बार = १०० µm. (B) इन विट्रो में 4 दिनों के बाद MNs आकृति विज्ञान और transfected द्वारा eGFP transgene के लिए magnetofection दिन में 2. MNs मार्कर SMI32 या पैन-न्यूरॉन मार्कर Tuj1 के साथ counterstained थे. तीर न्यूरॉन्स की सोमा दिखा. स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: magnetofected मनसे की फोकल छवियां जंगली-प्रकार या उत्परिवर्ती eGFP-NEFH का निर्माण (हरे रंग में) और autophagic मार्कर LC3b के लिए दाग (लाल रंग में) । तीर दिखाएं उत्परिवर्ती eGFP-NEFH प्रोटीन समुच्चय भी LC3b सकारात्मक रहे हैं । स्केल बार = 10 µm. images Jacquier et al. २०१७, Acta Neuropathologica13संचार से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक यह है कि माउस भ्रूण विकास के दौरान एक सटीक समय खिड़की पर विच्छेदित कर रहे है (12.5 ई) के लिए अंत में प्राप्त MNs की राशि का अनुकूलन । इसके अलावा, इष्टतम उपज के लिए, विच्छेदन सुबह में किया जाना चाहिए या दोपहर में जल्दी । e 12.5 से पहले (उदा., e 11.5 पर), विच्छेदन कठिन है, विशेष रूप से मेनिन्जेस के उंमूलन के संबंध में । ई 12.5 के बाद, प्राप्त अजेंडे की संख्या काफी गिरता है । विकास के भ्रूण चरण को नियंत्रित करने के लिए, वयस्क महिलाओं और पुरुषों को पहले दिन के अंत में एक साथ रखा जाता है । अगली सुबह, वयस्कों अलग कर रहे हैं, और महिलाओं को एक योनि प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच कर रहे हैं. यदि एक प्लग मौजूद है, भ्रूण इस बात को विकास के 0.5 दिन ई में माना जाता है । इन प्रयोगों के लिए, हम आम तौर पर एक माउस लाइन है कि जोरदार और उत्पादक का उपयोग करें । एक मिसौरी में नस्ल की कॉलोनी से उद्भव Progenitors इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है, और तनाव CF1 (Carworth खेतों तनाव 1) का नाम था । इस तनाव १९६७ में चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं फ्रांस में पेश किया गया था, और यह नाम OF1 (Oncins फ्रांस 1) हासिल कर लिया ।

एक दूसरे महत्वपूर्ण बिंदु है कि बहुत से संस्कृति की पवित्रता को प्रभावित करने के लिए कदम है । MNs रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं के कम प्रतिशत का प्रतिनिधित्व (लगभग 1%), और लक्ष्य के लिए एक से युक्त संस्कृति प्राप्त करने के लिए है ४० ५०% अंय रीढ़ की हड्डी के बीच MNs कोशिकाओं और 5% से कम glial सेल progenitors । केंद्रापसारक की प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए, सेल निलंबन के नमूनों से पहले और बाद में प्रत्येक चरण को 24 घंटे के लिए MNs माध्यम में चढ़ाया जा सकता है, फिक्सिंग और मोटर ंयूरॉन मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए दाग के बाद Hb9 (81.5 c10, DSHB) या टाप-1/टाप-2 (ISL1/ २, 40.2 d6/39.4D5, DSHB), जिनके संयोजन भिन्न मनसे उपजनसंख्या१९को परिभाषित करते हैं. अधिक परिपक्व अजेंडे पर, Choline एसिटाइल ट्रांस्फ़्रेज़ (CHAT, Ab144P) या Neurofilament H non-phosphorylated (SMI-32P) जैसे अन्य मार्करों का उपयोग संस्कृति की गुणवत्ता का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है । जल्दी शुद्धि की प्रभावकारिता की निगरानी के लिए एक अच्छा विकल्प ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के लिए है कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) विशेष रूप से MNs में व्यक्त करते हैं । उदाहरण के लिए, Wichterle और सहकर्मियों ने पहले विकसित ट्रांसजेनिक चूहों को माउस Hb9 के नियंत्रण में GFP व्यक्त किया (जिसे Hlxb9 या Mnx1 भी कहा जाता है) प्रवर्तक18. Hb9:: GFP ट्रांसजेनिक चूहों dendrites में GFP की अलग अभिव्यक्ति प्रदर्शन, axons, और स्पाइनल MNs के सोमाs भ्रूण दिवस ९.५ से जन्मोत्तर दिन 10 ।

एमएनएस को पाली-एल-Ornithine और laminin कोटिंग द्वारा प्राप्त स्वतंत्र सब्सट्रेट पर विकास की आवश्यकता है । प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, प्लास्टिक की एक किस्म-, बहुलक, और ग्लास आधारित कंटेनरों (जैसे, 6, 24, ९६-अच्छी तरह से प्लेटें, ग्लास coverslips, या चैंबर स्लाइड) इस्तेमाल किया जा सकता है । इन विकल्पों के अलावा, microfluidic उपकरणों के हित के synapse गठन या axonal मार्गदर्शन और20परिवहन के बारे में विशिष्ट प्रश्नों के पते के लिए हो सकता है । MNs के लिए उनके पैटर्न, एकाग्रता कारकों, सब्सट्रेट में यांत्रिक परिवर्तन (जैसे, कठोरता), सरासर तनाव, और spatiotemporal ढाल cues शामिल microenvironment में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होने के लिए जाना जाता है (जैसे, स्थलाकृतिक सुविधाओं, अलग सेलुलर समानताएं के पदार्थों के साथ सतहों की patterning) । Microfluidic प्लेटफार्मों प्रणाली है कि multifactorial शर्तों को एकीकृत कर सकते हैं, इष्टतम सेलुलर microenvironments के निर्धारण के लिए अनुमति देता है ।

के बाद से है GDNF अस्तित्व प्रभाव7की खोज, MN प्रारंभिक विकास और अस्तित्व, मार्गदर्शन और axons के विकास में शामिल neurotrophic कारकों की संख्या, और synaptic प्लास्टिक की उत्प्रेरण बढ़ रही है । दिलचस्प बात यह है कि प्रत्येक फैक्टर मनसे के एक विशिष्ट उपजनसंख्या8पर कार्य करता है । उदाहरण के लिए, CNTF माध्य मोटर स्तंभ (MMC) जो innervates अक्षीय मांसपेशियों की रक्षा के लिए वर्णित किया गया है, जबकि पार्श्व मोटर कॉलम (LMC) जो innervates अंग की मांसपेशियों पर एचजीएफ कार्य करता है । दूसरी ओर, GDNF और बीडीएनएफ दोनों ही एमएनएस की पूरी आबादी पर सबसे मजबूत समर्थक अस्तित्व गतिविधि दिखाते हैं । अंत में, GDNF, बीडीएनएफ, और CNTF का संयोजन एक MN आबादी के ७०% से अधिक की रक्षा के लिए पर्याप्त है और सामांयतः प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है ।

मानक संस्कृति की स्थिति में, MNs को इन विट्रो में 14 दिनों तक ताजा मीडिया के साथ संस्कृति मीडिया के आधे से एक बार हर 3 दिन की जगह, संस्कृति के पांचवें दिन से शुरू रखा जा सकता है । इन विट्रो में परिपक्वता के दौरान, MNs magnetofection द्वारा किसी भी समय इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके transfected जा सकता है । इस तकनीक की दक्षता और विषाक्तता plasmids और आवेषण की प्रकृति द्वारा संग्राहक जा सकता है । हमारे मामले में, जब magnetofection MN संस्कृति पर प्रदर्शन किया गया था इन विट्रो में 2 दिनों के बाद एक CAGGS मोटर (pCAGEN21) के साथ एक 9 केबी प्लाज्मिड का उपयोग neurofilament सीडीएनए को नियंत्रित करने, हम ३१.४८% ± ९.९४ के एक औसत मनाया (मानक विचलन) के transfected मनसे ४८ hours post-अभिकर्मक. फिर भी, अंय निर्माणों के लिए, डीएनए/मोतियों का एक अलग अनुपात के निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में परीक्षण किया जाना चाहिए । अभिकर्मक स्तर दक्षता प्रभावित हो सकता है एक अन्य पैरामीटर समय के साथ MNs की परिपक्वता है. वास्तव में, संस्कृति के पहले 3 दिनों के दौरान, axons के विकास और सोमाओं की वृद्धि हो जाएगा, जो सतह क्षेत्र बढ़ जाती है जहां मोतियों घुसना होगा । इस पैरामीटर परिपक्वता के दौरान समय के साथ MN अभिकर्मक क्षमता बढ़ सकता है ।

अंत में, MN संस्कृतियों की तुलना में, यह संवेदी ंयूरॉंस की खेती के लिए दिलचस्प होगा22,23,24। विशेष रूप से, Charcot-Marie-टूथ रोग एक संवेदी मोटर DRGs के रीढ़ की हड्डी और संवेदी न्यूरॉन्स दोनों के अध-पतन से संबंधित बाहर पेशी शोष द्वारा विशेषता है । दिलचस्प है, DRGs रीढ़ की हड्डी के दोनों किनारों पर स्थित है और हो सकता है MNs प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया एक ही विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान एकत्र । इस संबंध में, इन दो प्रासंगिक सेल प्रकार, motoneurons और डीआरजी संवेदनशील न्यूरॉन्स में काम पर pathophysiological तंत्र की तुलना करने के लिए संभव है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Telethon रणनीतिक योजना के माध्यम से अपने समर्थन के लिए डॉ Jacquier फैलोशिप और AFM-MyoNeurAlp के लिए "एसोसिएशन डालो le développement de la neurogénétique" शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम यह भी डॉ. क्रिस हेंडरसन, डॉ विलियम Camu, डॉ ब्रिजित Pettmann, डॉ सिडरिक Raoul, और डॉ Georg हास, जो विकसित करने और तकनीक में सुधार लाने और उनके ज्ञान को फैलाने में भाग लिया शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Silicone dissection dish Living systems instrumentation DD-90-S-BLK-3PK Sylgard
round coverslip NeuVitro, Knittel glass GG-12-Pre 12 mm
Slide a Lyzer cassettes ThermoFisher Scientific 66030 20,000 MWCO ; 30 mL
Filter unit Millipore SCGVU02RE
GP Sterile Syringe Filters Millipore SLGP033RS
4 well plate ThermoFisher Scientific 167063 Nunclon Delta treated plate
forceps FST by Dumont 11252-20 #5 forceps
scissor FST by Dumont 14060-10 fine scissors
scalpel FST by Dumont 10035-20 curved blade
scalpel FST by Dumont 10316-14 micro-knife scalpel
Petri dish Greiner 663102 ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tube Falcon 352096
filter paper Watman 1001125 circle, 125 mm diameter
glass chamber slide Lab-Tek 154526 4 chambers
Plasmid pCAGEN Addgene #11160
Name Company Catalog Number Comments
Solutions and mediums
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
L-15 medium ThermoFisher Scientific 11415056
L-15 medium, no red phenol ThermoFisher Scientific 21083027
Insulin Sigma-Aldrich I6634
Putrescine Sigma-Aldrich P5780
Conalbumin Sigma-Aldrich C7786
Sodium selenite Sigma-Aldrich S5261
Progesterone Sigma-Aldrich P8783
Poly-DL-Ornithine Sigma-Aldrich P8638
Laminin Sigma-Aldrich L2020
trypsin 2.5%, 10x ThermoFisher Scientific 15090046
DNAse Sigma-Aldrich DN25
PBS w/o Ca Mg ThermoFisher Scientific 14190144 without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific 25080094
Neuron cell culture medium ThermoFisher Scientific A3582901 Neurobasal Plus medium
HBSS Sigma-Aldrich H6648-500ML
HEPES buffer 1 M ThermoFisher Scientific 15630056
Density gradiant medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep
supplement medium ThermoFisher Scientific A3582801 B-27 Plus
Horse serum heat inactivated ThermoFisher Scientific 26050-088
L-Glutamine 200 mM ThermoFisher Scientific 25030024
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350010
penicilline/streptomycine ThermoFisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Name Company Catalog Number Comments
Immuno fluorescence
PBS, 10x ThermoFisher Scientific X0515 without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244
normal goat serum Sigma-Aldrich G6767
glycine Sigma-Aldrich G7126
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT) Chemicon Ab144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) Biolegends SMI-32P IF at 1/1000
Islet-1 DSHB 40.2D6
Islet-2 DSHB 39.4D5
Hb9 DSHB 81.5C10
Vectashield mounting medium Vector Lab H-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone) Biolegends 801201 IF at 1/1000
Lc3b Cell Signaling Technology #2775 IF at 1/200

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References

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ Motoneurons रीढ़ की हड्डी में Motoneurons neuromuscular विकार Charcot-Marie-टूथ रोग neurofilament magnetofection neurodegeneration
Transfecting माउस प्राथमिक Motoneurons द्वारा <em>इन विट्रो में</em> Charcot-Marie-टूथ रोग मॉडलिंग
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Jacquier, A., Risson, V., Schaeffer, … More

Jacquier, A., Risson, V., Schaeffer, L. Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons. J. Vis. Exp. (143), e57988, doi:10.3791/57988 (2019).

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