Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Studere Ribonucleotide inkorporering: Strand-spesifikke påvisning av Ribonucleotides i gjær genomet og måler Ribonucleotide-indusert mutagenese

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/58020
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS
* These authors contributed equally

Summary

Ribonucleotides er blant de rikeste ikke-kanoniske nukleotider innlemmet i genomet eukaryote kjernefysiske utryddelse. Hvis ikke riktig fjernet, kan det forårsake ribonucleotides DNA skade og mutagenese. Her presenterer vi to eksperimentell tilnærminger som brukes til å vurdere overflod av ribonucleotide inkorporering DNA og dens mutagene effekter.

Abstract

Tilstedeværelsen av ribonucleotides i kjernefysiske DNA har vist seg å være en kilde til genomisk ustabilitet. Omfanget av ribonucleotide innlemmelse kan bli vurdert av alkalisk hydrolyse og gel geleelektroforese RNA er svært utsatt for hydrolyse i alkaliske forhold. Dette, kan sammen med sørlige blot analyse brukes til å bestemme plasseringen og strand inn som ribonucleotides er innarbeidet. Men denne prosedyren er bare semi kvantitative og kan ikke være sensitive nok til å oppdage små endringer i ribonucleotide innhold, men strand-spesifikke sørlige blot sondering forbedrer sensitiviteten. Som et mål på en av de mest slående biologiske konsekvensene av ribonucleotides i DNA, kan spontan mutagenese analyseres ved hjelp av en frem mutasjon analysen. Bruker riktig reporter gener, sjeldne mutasjoner som resulterer i tap av funksjon kan være valgt og generelle og spesifikke mutasjonen priser kan måles ved å kombinere data fra svingninger eksperimenter med DNA sekvensering av reporteren genet. Svingninger analysen gjelder undersøke en rekke mutagene prosesser i bestemt genetisk bakgrunn eller betingelser for vekst.

Introduction

Eukaryote kjernefysiske utryddelse, er ribonucleotides innlemmet i genomet av alle tre store DNA replicases, DNA polymerases (Pols) α, ε og ses1,2. RNase H2-avhengige ribonucleotide excision reparasjon (RER3) fjerner fleste av disse innebygde ribonucleotides.

En ribonucleotide i DNA er utsatt for hydrolyse, som 2 hydroksyl gruppen av sukker moiety kan angripe den tilstøtende phosphodiester bond, slippe en ende med en 2 - 3' syklisk fosfat og den andre med en 5'-OH4. Alkaliske forhold kan sterkt akselerere denne reaksjonen. Dermed fører hydrolyse av innebygde ribonucleotides under inkubasjonen i en grunnleggende løsning fragmentering av genomisk DNA, som kan visualiseres alkaliske-agarose geleelektroforese5. Denne DNA kan overføres til en membran og analysert av sørlige blot analyse ved hjelp av strand-spesifikke sonder at identifikasjon av lut-sensitive områder skyldes ribonucleotides innlemmet i den gryende ledende - eller henger-stranden DNA, henholdsvis.

I gjærceller mangler RNase H2 aktivitet, kan fjerning av ribonucleotides startes når topoisomerase jeg (Top1) kutt DNA på den innebygde ribonucleotide6,7. Men når Top1 kløyver på 3 side av ribonucleotide, genererer dette 5'-OH og 2 - 3' syklisk fosfat DNA ender som er ildfaste til religation. Reparasjon eller avvikende behandling av disse skitne ender kan føre til genomisk ustabilitet. I tillegg hvis i snitt i en gjenta DNA sekvens, kan reparasjonsprosessen føre til sletting mutasjoner. Dette er spesielt problematisk for tandem gjentas, der korte slettinger (på mellom to og fem base parene) er ofte observert i RNase H2-mangelfull celler. Avhengig av Top1 skadelige effektene i fravær av gjær RNase H2 aktivitet er forsterket en DNA polymerase ε mutant (pol2-M644G) promiskuøse for ribonucleotide innlemmelse i begynnende ledende strand syntese.

Behandling av ribonucleotides i DNA fører til spontane mutasjoner og denne mutagenese kan oppdages ved hjelp av riktig reporter gener og velger for tilhørende fenotypiske endringen. En svingninger test eller Luria og Delbrück eksperiment er en av de mest brukte metodene for å måle spontan mutasjon priser bruker valgbar reporter gener8,9. I gjær, kan URA3 og CAN1 gener brukes som journalister i en frem mutasjon analysen, som gir mulighet for gjenkjenning av alle mutasjon typer som resulterer i tap av gen funksjon. Spontan Mutasjonshastigheten er beregnet som medianen til som observert i flere parallelle kulturer startet fra enkelt kolonier uten mutasjoner i målet reporter genet. En gjær RNase H2-mangelfull belastning som rnh201Δ har en moderat opphøyet samlet spontan mutasjon rente som skyldes i stor grad en forhøyet forekomst av 2-5 bp slettinger i tandem gjenta sekvensene. Dermed fullt betegner mutagene effekten av ribonucleotides i genomet, må spesifikke mutasjonen priser bestemmes. I dette tilfellet URA3 eller CAN1 reporter genene kan forsterkes og rekkefølge for å fastslå hvilke typer og plassering av mutasjoner, og spesifikke mutasjonen priser kan beregnes. Kompilering mutasjoner i flere uavhengige URA3 eller CAN1 mutanter kan deretter brukes til å generere en mutasjon spektrum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. alkalisk hydrolyse og Strand-spesifikke sørlige Blot (figur 1)

  1. Cellevekst og genomisk DNA isolasjon
    1. Isolere gjær genomisk DNA ved hjelp av en gjær DNA rensing kit følge instruksjonene fra produsenten. Bruk kulturer i den eksponentielle vekstfase mellom (en optisk tetthet på 0,5) og 1. Resuspend de siste DNA-pellet i 35 mL 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)).
    2. Legg til 1 mL av 5 mg/mL RNase A DNA og ruge i 30 min på 37 ° C.
    3. Utløse DNA med 0,1 mengder 3 M natrium acetate (pH 5.2) og 2,5 volum av 100% etanol etter 20 min på is.
    4. Sentrifuge 16.000 x g for 20 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting bruker en pipette.
    5. Vask pellet to ganger med 500 mL 70% etanol. Fjerne nedbryting bruker en pipette.
    6. Tørr pellet på benken og resuspend i 35 ml 1 x TE buffer.
    7. Quantitate DNA ved hjelp av en fluorimeter (Tabell for materiale) med dsDNA BR analysen kit.
    8. Utløse 5 mg av DNA fra hvert utvalg bruker 0,1 mengder 3 M natrium acetate, pH 5.2 og 2,5 mengder 100% EtOH for et totalt volum på 200 mL (Legg H2O hvis nødvendig, ytterligere 5 mg DNA er nødvendig hvis kontrollen nøytral gel er nødvendig). Ruge på is 20 min.
    9. Sentrifuge 16.000 x g for 20 min på 4 ° C. Fjerne nedbryting bruker en pipette.
    10. Tørr pellet på benken. Resuspend DNA i 14 mL H2O.
  2. Alkalisk hydrolyse og gel geleelektroforese
    1. Legg til 6 mL 1 M KOH og ruge ved 55 ° C i 2 timer.
    2. Inkuber prøvene på is 5 min.
    3. Legge til 4 mL av 6 x alkaliske DNA laste buffer: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, 18% polysucrose (Tabell for materiale), 0,15% bromocresol grønne og 0,25% xylen cyanol FF.
    4. Kastet en alkalisk gel som består av 1% agarose, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Bruk en kam som gir 24 mL av DNA-prøve lastes per kjørefelt.
    5. Kjøre gel i romtemperatur i 1 x alkalisk geleelektroforese buffer: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Inkluder en passende DNA størrelse markør.
    6. Nedspinning rør kort og laste inn hele 24 mL prøven i alkalisk agarose gel. Electrophorese i 30 min 30 V, etterfulgt av 18-20 h på 10 V.
    7. Nøytralisere gel for 2 incubations av 45 min hver ved romtemperatur med mild agitasjon i nøytralisering Buffer I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl.
    8. Stain DNA av soaking men gel i 200 mL vann som inneholder en 1/10 000 fortynning av SYBR Gold flekken for 2 timer ved romtemperatur med mild risting.
    9. Visualisere DNA ved hjelp av en UV-transilluminator. Økt lut-følsomhet forårsaker utseendet på mindre DNA fragmenter, som indikerer en høyere tetthet av ikke er reparert ribonucleotides i DNA5.
  3. Sørlige overføring
    1. Overføre DNA fra alkaliske gel til positivt ladede nylon membranen av kapillær handling10. Et eksempel på hvordan denne overføringen kan defineres tilbys i Sambrook og Russells manuell10.
    2. Nyt alkaliske gel i 15 min ved romtemperatur i alkaliske overføre Buffer: 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.
    3. Våt nylon membranen (kuttet til størrelsen på gel) kort med vann, og deretter suge i 5 min alkaliske overføre buffer.
    4. Definere overføring plattformen ved å snu 3 glass kanner (100 mL) i et glass bakervarer parabol. Denne retten bør være litt større enn størrelsen på agarose gel. Sett en glassplate over toppen av dem..
    5. Drapere 2 store deler av 3 MM CHR kromatografi papir (kuttet til størrelsen på bredden av gel pluss lenger sider som kan drapere over kantene i bufferen reservoaret) over glassplaten.
    6. Hell alkaliske overføre Buffer over kromatografi papiret og halv fyll glasset parabolen. Glatt ut bobler med en 5 mL glass pipette.
    7. Plass agarose gel på toppen, igjen glatter ut bobler. Rundt kantene av gel med parafilm. Hell en liten mengde alkaliske overføre Buffer på gel.
    8. Plass pre-gjennomvåt nylon membranen over gel. Glatt ut bobler.
    9. Våt 2 papirark klippe til størrelsen på agarose gel. Plasser dem på toppen av membranen og jevne ut bobler.
    10. Sett en stor stabel med papirhåndklær (kuttet til en størrelse litt større enn agarose gel) på overføring sandwich. Forsiktig plassere en glassplate over på papirhåndklær. Legge til et vektet objekt til toppen (en bok med en masse 400 g fungerer bra).
    11. La overføring fortsette over natten i romtemperatur.
    12. Forsiktig ta overføring stakken fra hverandre og suge membranen i 15 min ved romtemperatur i nøytralisering Buffer II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.
    13. Krysskobling DNA til ladet nylon membranen bruker en UV-crosslinker. Plasser membranen i kryss-linker og bruke innstillingen autocrosslink.
  4. Sørlige sonde forberedelse
    Merk: Fremgangsmåten beskrevet her for å oppdage lut-sensitive områder i den gryende ledende-kontra henger-strand DNA strand er basert på en protokoll publisert tidligere11. For våre eksperimentet utføres sondering på URA3 reporter genet som er satt inn i en av to retninger (OR1 eller OR2) ved ARS306 replikering opprinnelse på kromosom III (figur 3A). Lut-sensitive områder i gjær genomisk DNA er en indikator på ribonucleotide innlemmelse, tillater bruk av ribonucleotides som biomarkers DNA polymerase aktivitet12,13,14. Denne tilnærmingen, med et mål DNA sekvensen ved effektiv ARS306 opprinnelsen til replikering skal være mottakelig for andre genomisk steder og målet gener også.
    1. PCR-forsterke en 520-base par del av URA3 reporter genet bruker følgende primer paret: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) og URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
    2. Utføre PCR reaksjonen med 10-20 ng gjær genomisk DNA som en mal, 4 μL av hver primer (10 μM lager), 10 μL 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + pluss), 8 μL dNTP blanding (2,5 mM hver), 0,5 μL av Ex Taq DNA Polymerase (5 U/μL) , og Juster det endelige volumet til 100 μL med H2O.
    3. Kjøre følgende PCR program: 95 ° C i 5 min; 30 sykluser av 95 ° C for 1 minutt, 55 ° C for 1 min, 72 ° C i 2 min; 72 ° C i 10 min og hold på 4 ° C.
    4. Rense PCR produktet bruker en PCR rensing kit og elute DNA bruker 50 mL av H2O. Dette kan nå brukes som mal i radiolabeling reaksjonen.
    5. Bruk følgende primerne for strand-spesifikke radiolabeling: Bruk URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) for å visualisere DNA som anneals til sonde A. Dette tilsvarer begynnende ledende strand DNA når URA3 er i OR2 og tnascent henger strand DNA når URA3 er i OR1. Bruk URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) for å visualisere begynnende DNA som anneals til sonde B. Dette tilsvarer begynnende ledende strand DNA når URA3 er i OR1 og gryende henger strand DNA når URA3 er i OR2 (Figur 3).
      1. Utføre radiolabeling reaksjonen bruker 10-20 ng forsterket URA3 fragment som mal DNA, 2 μL primer (10 μM stock), 5 μL 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + pluss), 4 μL 2,5 dNTPs (minus dCTP), 5 μL (50 μCi) i en32P-dCTP , 0,5 μL av ExTaq DNA Polymerase (5 U/μL) og justere endelige volumet til 50 μL med H2O. kjøre følgende program for radiolabeling: 94 ° C i 5 min; 25 sykluser av 94 ° C for 1 minutt, 55 ° C for 30 s, 72 ° C i 1 min; 72 ° C i 5 min og hold på 4 ° C.
    6. Bruk en G-25 spinn kolonne for å fjerne kommunefritt radioaktivt etiketten. Før du legger radiolabeled prøven, sentrifuge kolonnen for 1 min på 720 x g og removethe av pipettering. Last radiolabeled reaksjon produktet og sentrifuger i 2 minutter på 720 x g til elute merket sonden.
    7. Ruge på 95 ° C i 5 min til denature sonden umiddelbart før hybridisering. Kul kort på is.
  5. Sørlige hybridisering
    1. Rull fuktet membranen i en hybridisering rør og legge 25 mL av nylagde hybridisering buffer: 0,5 M natrium fosfatbuffer, pH 7.2, 7% natrium dodecyl sulfate (SDS), 1% bovin serum albumin (BSA). Inkuber ved 65 ° C i 1-2 h med rotasjon i hybridisering ovn.
    2. Nøye hell av løsningen og legge 25 mL hybridisering buffer pluss radiolabelled sonden. Inkuber ved 65 ° C i 16-18 h med rotasjon.
    3. Hell av løsningen i en radioaktivt avfall beholder. Utføre 5 vasker for 5 min hver ved romtemperatur med fosfat-SDS vaske løsning I: 40 mM natrium fosfatbuffer, pH 7.2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8.0.
    4. Utføre 2 vasker av 15 minutter hver til 65 ° C med fosfat-SDS vaske løsning II: 40 mM natrium fosfatbuffer, pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.
    5. Fjern membranen fra hybridisering røret ved hjelp av pinsett og plasser i en åpen plast ermet beskytter. Dekk og avsløre en tenkelig plate. Prøv en rekke forskjellige lukkertider mellom 4 h 4 d.
    6. Om nødvendig fjerner og re probe klatt bruker en annen sonde ca 3 - 4 ganger. For å kle, ruge membranen 2 h på 65 ° C i 25 mL av en 50% formamide, 2 x SSPE løsning.
      Merk: 20 x SSPE lager løsning: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO40.02 M EDTA, pH 7.4.
    7. Hell av løsningen i en radioaktivt avfall beholder. Utføre 2 vasker av 15 minutter hver til 65 ° C i fosfat-SDS vaske løsning II.
    8. Gjenta stripping protokollen hvis signalet fortsatt sjekke membranen med en Geiger-teller.
    9. Utfør pre hybridisering og hybridisering som beskrevet ovenfor.

2. måle Mutasjonshastigheten og spesifisitet i S. cerevisiae stammer

  1. Forberede cellekultur
    1. Vaksinere en enkelt koloni (sunn gjær celler tar 2-3 dager på 30 ° C til skjemaet riktig størrelse kolonier) dyrket på YPD agar supplert med 100 mg/mL adenine i 5 mL av YPDA buljong med 250 mg/mL adenine (tilskudd av adenine er bare nødvendig hvis påkjenningen brukes er en adenine auxotroph). Vokse i en shaker inkubator eller på et rotator på 30 ° C til kultur når metning (36-48 h for en belastning uten alvorlige vekst feil).
    2. Nedspinning cellene ~ 2000 x g i 5 min.
    3. Forkaste nedbryting og vask cellene med 5 mL av sterilt vann.
    4. Resuspend cellene i 500 mL sterilt vann.
  2. Fortynning av cellekultur og plating
    1. For ikke-utvalg kontroller fortynne cellene i en 96-brønns plate med en faktor på 1,600,000 og plate 100 mL i hver kultur på en komplett (COM)-tallerken.
    2. For å velge for ura3 mutanter, plate 100 mL ufortynnet celler på en 5-FOA plate for en vill-type (WT) belastning. Fortynne cellene tilsvarende hvis Mutasjonshastigheten av belastningen av interesse er forventet å være høyere enn i en WT belastning.
    3. Du velger for can1 mutanter, fortynne cellene 5-fold og plate 100 mL på en canavanine som inneholder plate (CAN) for en WT belastning. Den fortynningsfaktoren er 0,5.
    4. Inkuber platene på 30 ° C før gjær kolonier skjemaet. For stammer uten en vekst-feil, 2-3 dager er vanligvis tilstrekkelig for COM og kan plater og 3-5 dager for 5-FOA plater. Hvis du vil sammenligne mutasjon priser mellom ulike stammer, er det best å velge samme dag vekst telle kolonier. Lagre platene klar telles på kalde rommet (~ 4 ° C).
  3. Beregning av spontan mutasjon
    1. Telle synlig kolonier på hver plate og ta notater av kolonien tall
    2. Beregne Mutasjonshastigheten bruke Drakes formel: μ = f ÷ ln (μNt). f er mutasjon frekvensen beregnet antall mutanter delt på antall celler i siste kultur. NT er antallet celler i siste kultur og μ Mutasjonshastigheten. Dette kan løses ved en iterative metode som metoden Newton-Raphson. Det er andre estimator metoder, inkludert Lea og Coulson testen å beregne mutasjon rate15.
    3. Beregne konfidensintervallet antar Logg normalfordeling av utation utbredelsen av personlige isolerer. 95% konfidensintervall brukes oftest.
  4. Analyse av mutasjon spektrum
    1. Velg en enkelt koloni fra hver 5-FOA eller kan plate og oppdatere på en YPDA plate.
    2. Utføre kolonien PCR å forsterke URA3 eller CAN1 genet og rekkefølgen for å oppdage mutasjoner bruker følgende primerne: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3 ") og URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3") for begge PCR forsterkning og sekvensering av 800 bp URA3 genet; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3 ") og CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3") for forsterkning og CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3 ") og CAN1-BR ( 5-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3 ") for sekvensering av 1800 bp CAN1 reporter genet.
    3. For å utføre kolonien PCR, resuspend en enkelt koloni i 5 μL H2O og bruke 1 μL som mal. Tilsett 1 μL av hver primerne (5 μM lager), 2 μL 5 x KAPA2G Buffer (Mg2 + pluss), 0,5 μL dNTP (2,5), 0,5 μL av KAPA2G rask DNA Polymerase, 12 μL H2O.
    4. For forsterkning av URA3 genet, kjøre programmet følgende PCR: 95 ° C i 5 min; 5 sykluser av 95 ° C for 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C for 30 s; 35 sykluser av 95 ° C for 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C for 30 s; 72 ° C i 2 min og hold på 4 ° C. For forsterkning av CAN1 genet, kjøre programmet følgende PCR: 95 ° C i 5 min; 5 sykluser av 95 ° C for 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C i 45 s; 35 sykluser av 95 ° C for 10 s, 61 ° C i 15 s, 72 ° C i 45 s; 72 ° C i 2 min og hold på 4 ° C.
    5. Juster sekvensering resultatene til en referanse sekvens bruker et program som DNASTAR Seqman Pro eller Sequencher til å identifisere mutasjoner.
    6. Kompilere mutasjoner dataene etter mutasjon type (Figur 4) eller mutasjon plassering (figur 5). Beregne den spesifikke mutasjon prisen av hyppigheten av en mutasjon (antall hendelser observert delt på antall mutanter sekvensert) multiplisert med generelle Mutasjonshastigheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Behandling av genomisk DNA med lut etterfulgt av alkaliske gel geleelektroforese tillater semi kvantitative oppdagelsen av DNA fragmentering på grunn av overflod av stabilt innarbeidet ribonucleotides. Figur 2 viser gel bilder av gjær genomisk DNA behandlet med eller uten KOH5. M644L-variant av Pol2, den katalytiske delenhet i Polε, har redusert muligheten til å innlemme ribonucleotides mens M644G mutant inneholder flere ribonucleotides enn WT utvalg. Som beskrevet i protokollen, kan alkaliske gel bli videre undersøkt av strand-spesifikke sørlige blot analyse. Med kunnskap om den probed genomisk området i forhold til sin tilstøtende opprinnelse, kan vi velge sondere ribonucleotides innlemmet i den gryende fører eller henger tråder. Figur 3 viser sørlige blot resultatene sondering URA3 reporter genet settes inn i to motsatte retninger nær en tidlig-skyting replikering opprinnelse, ARS30616. Bruker ledende strand-spesifikke sonder, observerer vi DNA fragmentering mønsteret forårsaket av lut-cleavage på ribonucleotides i begynnende ledende strand DNA i en WT belastning og stammer uttrykke variantene av polymerases α, ses og ε som er promiskuøse for ribonucleotide innlemmelse.

Bruker en svingninger eksperiment, kan vi måle mutasjon utbredelsen av gjær påkjenningen inneholder reporter gener. Figur 4 viser mutasjon URA3 og CAN1 loci av stammer uttrykke WT polymerase eller pol2-M644G mutant med eller uten funksjonell RNase H2. Mangel på RNase H2 forårsaker en moderat økning i total mutasjon priser i begge bakgrunnene. Nærmere undersøkelse av mutasjon spesifisitet viser imidlertid at i stammer mangler RNase H2 (figur 5), det er en sterk økning i Mutasjonshastigheten for kort slettinger, spesielt i tandem gjenta sekvenser. Figur 5A sammenligner mutasjon spesifisitet i WT og rnh201Δ stammer og figur 5B viser mutational effekten av ytterligere forhøyet ribonucleotide innlemmelse i den gryende ledende DNA stranden ved Pol ε.

Figure 1
Figur 1: protokoll trinnene involvert i strand-spesifikke påvisning av lut-sensitive områder skyldes ribonucleotide inkorporering gjær genomisk DNA. En oversikt over de ulike store trinnene involvert i denne prosedyren, begynner med gjær genomisk DNA isolasjon og fortsetter gjennom siste sørlige blot analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: et representativt bilde av resultatene oppnås ved alkaliske-agarose gel geleelektroforese. Dette tallet har blitt tilpasset fra Nick McElhinny, S. A. et al. 5. gjær genomisk DNA fra stammer av ulike genotyper ble behandlet med KCl (nøytral) eller KOH (alkaliske) og deretter skilles på en nøytral eller alkalisk agarose gel. "WT" og "M644G" angir statusen til Pol ε. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Strand-spesifikke undersøkelser av en alkalisk-agarose gel av sørlige blot. Dette tallet er tilpasset fra Williams, J. S. et al. 13. (A) radiolabeled sonder anneal til den gryende ledende DNA stranden i URA3 reporter genet har satt inn nær ARS306 i to motsatte retninger (OR1 og OR2). (B) representant resultatene av Southern blotting bruker begynnende ledende strand-spesifikke sonder. Vises er prøvende resultatene for den begynnende ledende stranden i en stamme med WT DNA polymerases, eller pol1-L868M, pol2-M644G eller pol3-L612M variant stammer med eller uten RNase H2. POL1, POL2, og POL3 gener kode katalytisk underenheter av Pols α, ε og ses, henholdsvis. Variantene er mer promiskuøse for ribonucleotide innlemmelse5,12,17. (C) kvantifisering av radioaktivt signalet ved brøkdel av totalen i hver bane fra (B). Verdiene uttrykkes som en prosentdel av totalen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: spontan mutasjon priser i gjær påkjenningen. Dette tallet har blitt tilpasset fra Nick McElhinny, S. A. et al. 5. URA3 og CAN1 reporter genene ble brukt i fremover mutasjon analysen for å måler mutasjon av de angitte stammene. URA3 reporter er i "orientering 2" (OR2, figur 3A). 95% konfidensintervall (CI) inkluderes for hver måling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: mutasjon spectra for URA3-OR2 reporter genet. Dette tallet har blitt tilpasset fra tidligere publikasjoner5,18,19,20. Hvilken posisjon og mutasjon i hver uavhengige 5-FOA-resistant kolonien valgt i fremover mutasjon analysen er avbildet i 804 bp URA3 koding sekvens. Bokstavene angir base erstatninger, åpne trekanter angir enkelt base slettinger, lukket trekanter angir enkelt base innsettinger, og heltrukne linjer angir kort slettinger. (A) mutasjon spectra i WT og rnh201Δ stammer. Rød etiketter over sekvensen er mutasjoner observert i WT mens blå etiketter under sekvensen som er observert i en rnh201Δ belastning. (B) mutasjon spectra i pol2-M644G og pol2-M644G rnh201Δ stammer. Rød etiketter over sekvensen er mutasjoner i pol2-M644G mens blå under rekkefølgen for pol2-M644G rnh201Δ stammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi protokollene for to sett av eksperimenter som ofte brukes til å analysere semi kvantitativt ribonucleotides innlemmet under utryddelse og mutagene effekten av ikke er reparert ribonucleotides. Selv om disse tilnærminger involvere modell eukaryoter S. cerevisiae, kan disse teknikkene lett tilpasses andre mikrober og enda høyere eukaryoter.

Leter etter ikke er reparert ribonucleotides i DNA bruker alkaliske-agarose geleelektroforese kombinert med Southern blotting gir viktig informasjon om antall ribonucleotides stede og strand som de er innarbeidet. Det er imidlertid viktig å merke seg at lut følsomhet kan også forårsakes av andre DNA lesjoner, som et abasic område. En annen måte å oppdage ribonucleotides i DNA er i behandling med renset RNase H2 enzym, som har blitt gjort i pattedyrceller21. Selv om vår tilnærming innebærer undersøkelser for alkaliske-sensitive områder i begynnende ledende versus henger tråder på URA3 reporter genet vår mutational analyse forsøk, er det mulig å utforme sonder som anneal andre steder i rekkefølge å få viktig informasjon vedrørende ribonucleotide tetthet på andre genomisk områder. Den sørlige blot delen av fremgangsmåten kan også brukes som referanse for andre generiske DNA prøvende eksperimenter.

Måling av mutasjon priser ved bruk av en svingninger test er blitt vidt anvendt for analyse av ulike mutagene hendelser i mikroorganismer, og dermed er ikke begrenset til analyse av mutagene konsekvensene av ribonucleotides i DNA. For dette eksperimentet forbedrer øke antall uavhengige kulturer nøyaktigheten for måling. Uavhengige kolonier kan fås ved striper en stamme av interesse på YPDA medium eller analyse av uavhengige spore kolonier ved tetrad Disseksjon av en diploide gjær flekk. Ideelt sett bruk av flere uavhengige haploid gjær påkjenningen (f.eks., fra tetrad disseksjon) oppfordres til å minimere virkningen av stamme til stamme variasjon. Dette er spesielt viktig når spontan mutasjon er høy eller når belastningen har en vekst-mangel. En ekstra metode som kan brukes til å måle spontan Mutasjonshastigheten er en mutasjon akkumulering eksperimentere22. I denne analysen var mutasjon frekvens bestemmes for cellene etter stor vekst og kan brukes til å beregne for Mutasjonshastigheten. Koblingen av en mutasjon akkumulering eksperimentere med dyp sekvensering teknologi har vist seg for å være et kraftig verktøy for å analysere Mutasjonshastigheten og spesifisitet over genomet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle nåværende og tidligere Kunkel Lab medlemmer for deres arbeid og diskusjoner relatert til protokollen og gjenbrukes dataene som presenteres her. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet Z01 ES065070 til T.A.K. fra delingen av Intramural forskning av National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
YPD media 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.
COM plates 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate.
CAN plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.
5-FOA plates 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.
L-Canavanine sulfate US Biological C1050
5-FOA US Biological F5050
20 mL glass culture tube Any brand
Culture rotator in 30 °C incubator Shaker incubator can be used instead
96 well round bottom plates Sterile, any brand
3 mm glass beads Fisher Scientific 11-312A Autoclave before use
12-channel pipettes Any brand
Ex Taq DNA Polymerase TaKaRa RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit Epicenter MPY80200
3 M sodium acetate Sigma-Aldrich S7899
100% ethanol
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866 Newer model available
dsDNA BR Assay kit Invitrogen Q32850
KOH Sigma-Aldrich 221473
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Ficoll 400 Dot Scientific Inc. DSF10400
Bromocresol green Eastman 6356
Xylene cyanol FF International Technologies Inc. 72120
NaOH Sigma-Aldrich S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0) Teknova T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen S11494
UV transilluminator
Amersham Nylon membrane Hybond-N+ GE Healthcare RPN303B
3 MM CHR Chromotography paper Whatman 3030-392
NaCl Caledon 7560-1
Stratalinker 1800 Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
G-25 spin column GE Healthcare 27-5325-01
1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) Sigma-Aldrich NaH2PO4 (S9638);
Na2HPO4 (S9390)
SDS Sigma-Aldrich L4522
BSA Sigma-Aldrich A3059
Formamide Sigma-Aldrich 47671
Geiger counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
  2. Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
  3. Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
  4. Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
  5. Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
  6. Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
  7. Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
  8. Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
  9. Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
  10. Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  11. Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
  12. Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
  13. Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
  14. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
  15. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
  16. Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
  17. Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
  18. Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
  19. Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
  20. Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
  21. Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
  22. Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).

Tags

Biologi problemet 137 Ribonucleotide innlemmelse utryddelse RNase H2 alkaliske gel geleelektroforese svingninger test mutagenese
Studere Ribonucleotide inkorporering: Strand-spesifikke påvisning av Ribonucleotides i gjær genomet og måler Ribonucleotide-indusert mutagenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, Z. X., Williams, J. S.,… More

Zhou, Z. X., Williams, J. S., Kunkel, T. A. Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis. J. Vis. Exp. (137), e58020, doi:10.3791/58020 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter