Summary
Ribonukleotider är bland de vanligast förekommande icke-kanoniska nukleotider införlivas genomet under eukaryota nuclear DNA-replikation. Om inte korrekt bort, kan ribonukleotider orsaka DNA-skador och mutagenes. Här presenterar vi två experimentella metoder som används för att bedöma överflödet av ribonucleotid införlivande i DNA och dess mutagena effekter.
Abstract
Förekomsten av ribonukleotider i nuclear DNA har visat sig vara en källa till genomisk instabilitet. Omfattningen av ribonucleotid införlivande kan bedömas genom alkalisk hydrolys och gel elektrofores som RNA är mycket mottagliga för hydrolys i alkaliska förhållanden. Detta, kan i kombination med Southern blot analys användas för att fastställa platsen och strand i som ribonukleotider har införlivats. Dock detta förfarande är endast semikvantitativt och kanske inte är tillräckligt känslig för att detektera små förändringar i ribonucleotid innehåll, även om strand-specifika Southern blot sondera förbättrar känsligheten. Som ett mått på en av de mest slående biologiska konsekvenserna av ribonukleotider i DNA, kan spontana mutagenes analyseras med hjälp en framåt mutationsanalys. Använda lämpliga reporter gener, sällsynta mutationer som resulterar i förlust av funktion kan vara markerade och övergripande och specifika mutation priser kan mätas genom att kombinera data från fluktuation experiment med DNA-sekvensering av reporter genen. Fluktuation analysen gäller att undersöka ett stort antal mutagena processer i specifika genetiska bakgrunden eller tillväxt villkorar.
Introduction
Under eukaryota nuclear DNA-replikation inlemmas ribonukleotider genomet genom alla tre stora DNA replicases, DNA-polymerases (Pols) α, ε och δ1,2. RNase H2-beroende ribonucleotid excision reparation (RER3) tar bort flesta av dessa inbäddade ribonukleotider.
En ribonucleotid i DNA är mottagliga för hydrolys, som hydroxylgruppen 2' av den socker biexponentiellt kan attackera den intilliggande phosphodiester bond, släppa ena änden med en icke-cyklisk fosfat i 2' - 3'-änden och den andra med en 5'-OH4. Alkaliska förhållanden kan avsevärt påskynda denna reaktion. Således, hydrolys av inbäddade ribonukleotider under inkubation i en grundläggande lösning orsakar fragmentering av genomisk DNA, som kan visualiseras av alkaliska-agaros elektrofores5. Detta DNA kan överföras till ett membran och trotsat av Southern blot analys med strand-specifika prober som tillåter identifiering av Alkalikänsliga webbplatser orsakas av ribonukleotider införlivas i den begynnande ledande - eller släpar-strand DNA, respektive.
I jästceller saknar RNase H2 aktivitet, kan borttagning av ribonukleotider initieras när topoisomeras I (Top1) nicks DNA på den inbäddade ribonucleotid6,7. Men när Top1 klyver på 3' sida av ribonucleotiden, genererar detta 5'-OH och 2' - 3' cykliska fosfat DNA ändar som är refraktära mot religation. Reparation eller avvikande bearbetning av dessa 'smutsiga slutar' kan leda till genomisk instabilitet. Dessutom om snittet sker inom en upprepad DNA-sekvens, kan reparationsprocessen leda till radering mutationer. Detta är särskilt problematiskt för tandem upprepas, där kort borttagningar (av mellan två och fem baspar) är vanligt förekommande i RNase H2-brist celler. Top1-beroende skadliga effekterna i avsaknad av jäst RNase H2 aktiviteten förvärras i en ε muterad DNA-polymeras (pol2-M644G) promiskuös för ribonucleotid införlivande under begynnande ledande strand syntes.
Bearbetning av ribonukleotider i DNA leder till spontana mutationer och denna mutagenes kan upptäckas med hjälp av lämpliga reporter gener och att välja för den medföljande fenotypisk förändringen. En fluktuation test eller Luria och Delbrück experiment är en av de vanligaste metoderna att mäta spontan mutation priser med valbar reporter gener8,9. I jäst, kan URA3 och CAN1 generna användas som reportrar i en framåt mutationsanalys, vilket möjliggör detektering av alla typer av mutation som resulterar i förlust av geners funktion. Den spontana mutationshastighet uppskattas som medianen av som observerats för flera parallella kulturer startade från enstaka kolonier utan mutationer i reporter målgenen. En jäst RNase H2-brist stam som rnh201Δ har en måttligt förhöjda övergripande spontan mutation som orsakas huvudsakligen av en förhöjd incidens av 2-5 bp borttagningar i tandem upprepa sekvenser. Således, för att fullständigt karakterisera de mutagena effekterna av ribonukleotider i genomet, specifik mutation priser behöver fastställas. I detta fall kan URA3 eller CAN1 reporter generna vara förstärkt sekvenserade för att fastställa typer och platser av mutationerna och specifik mutation priser kan beräknas. Sammanställa mutationer identifieras i flera oberoende URA3 eller CAN1 mutanter kan sedan användas för att generera en mutation spektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. alkalisk hydrolys och Strand-specifika Southern Blot (figur 1)
- Celltillväxt och genomisk DNA isolering
- Isolera jäst genomiskt DNA med hjälp av en jäst DNA rening kit följa tillverkarens instruktioner. Använd de kulturer som är i den exponentiella fasen av tillväxt mellan (en optisk densitet 0,5) och 1. Återsuspendera slutliga DNA pelleten i 35 mL 1 x TE buffert (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)).
- Tillsätt 1 mL av 5 mg/mL RNase A till DNA och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Fällningen DNA med 0.1 volymer 3 M natriumacetat (pH 5.2) och 2,5 volymer av 100% etanol i 20 min på is.
- Centrifugera vid 16 000 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten med pipett.
- Tvätta pelleten två gånger med 500 mL 70% etanol. Ta bort supernatanten med pipett.
- Torka pelleten på bänk och resuspendera i 35 ml 1 x TE buffert.
- Kvantifiera DNA med dsDNA BR analyssats en fluorimeter (Tabell för material).
- Fällningen 5 mg av DNA från varje prov med 0.1 volymer 3 M natriumacetat, pH 5.2 och 2.5 volymer av 100% EtOH för en total volym på 200 mL (Lägg H2O om nödvändigt, ytterligare 5 mg DNA behövs om kontrollen neutral gel är nödvändigt). Inkubera i isen i 20 min.
- Centrifugera vid 16 000 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten med pipett.
- Torka pelleten på bänk. Återsuspendera DNA i 14 mL H2O.
- Alkalisk hydrolys och gel elektrofores
- Tillsätt 6 mL 1 M KOH och inkubera vid 55 ° C under 2 h.
- Inkubera proverna på is för 5 min.
- Tillsätt 4 mL 6 x alkaliska DNA lastning buffert: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0, 18% polysucrose (Tabell för material), 0,15% bromkresolgrönt grön och 0,25% xylen cyanol FF.
- Kasta en alkalisk gel som består av 1% agaros, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Använd en kam som möjliggör 24 mL DNA-prov ska lastas per körfält.
- Kör gelen vid rumstemperatur i 1 x alkaliskt elektrofores buffert: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Inkludera en lämplig storlek DNA-markör.
- Snurra ner rören kort och läsa in hela 24 mL provet i den alkaliska agarosgel. Electrophorese för 30 min vid 30 V, följt av 18-20 h på 10 V.
- Neutralisera gelen för 2 inkubationer 45 min varje vid rumstemperatur med mild agitation i neutralisering buffert I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl.
- Fläcken DNA genom att blötlägga neutraliserat gelen i 200 mL vatten som innehåller en 1/10 000 utspädning av SYBR guld fläcken för 2 h vid rumstemperatur med milda skakningar.
- Visualisera DNA med hjälp av en UV-transilluminator. Ökad alkali-känslighet orsakar uppkomsten av mindre DNA-fragment, vilket indikerar en högre täthet av oreparerade ribonukleotider i DNA5.
- Södra överföring
- Överföra DNA från alkaliska gelen till positivt laddade nylon membran genom kapillärkraften10. I Sambrook och Russells manuell10finns ett exempel på hur denna överföring kan ställas in.
- Blötlägg alkaliska gelen under 15 minuter vid rumstemperatur i alkaliska överföra buffert: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.
- Våt nylon membran (klipp till storleken på gelen) kort med vatten, och sedan njuta 5 min i alkaliska överföra buffert.
- Ställa in överföring plattformen genom att invertera 3 glasbägare (100 mL) i ett glas ugnsform. Denna maträtt bör vara något större än storleken på agarosgel. Ange en glasskiva över toppen av dem.
- Drapera 2 stora bitar av 3 MM CHR kromatografipapper (klipp till storleken av den gel plus längre sidor som kan drapera över kanterna i buffert behållaren bredd) över glasskivan.
- Häll alkaliska överföra buffert över kromatografipapper och hälften Fyll glas skålen. Jämna ut bubblor med hjälp av en 5 mL glas pipett.
- Placera agarosgel på toppen, igen jämna ut bubblorna. Omge alla kanter av gelen med parafilm. Häll en liten mängd av alkaliska överföra buffert på gelen.
- Plats före blötläggas nylon membran ovanpå gelen. Jämna ut bubblorna.
- Våta 2 bitar av papper skära till storleken på agarosgel. Placera dem ovanpå membranet, och jämna ut eventuella bubblor.
- Placera en stor bunt hushållspapper (cut till en storlek som är något större än agarosgel) ovanpå överföring smörgås. Placera försiktigt en glasskiva ovanpå pappershanddukar. Lägga till ett vägt objekt överst (en bok med en massa 400 g fungerar bra).
- Låt överföringen fortsätta över natten i rumstemperatur.
- Försiktigt isär överföring stacken och Blötlägg membranet under 15 minuter vid rumstemperatur i neutralisering buffert II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.
- Crosslink laddade nylon membran med hjälp av en UV crosslinker DNA. Placera membranet i cross-linker och använda inställningen autocrosslink.
- Södra sonden förberedelse
Obs: Den metod som beskrivs här för att upptäcka Alkalikänsliga platser i den begynnande ledande-kontra släpar-strand av DNA-strängen är baserad på ett protokoll tidigare publicerade11. För våra experiment görs sondering vid den URA3 reporter gen som har infogats i en av två inriktningar (OR1 eller OR2) intill ARS306 replikering ursprung på kromosom III (figur 3A). Förekomsten av Alkalikänsliga platser i jäst genomiskt DNA är en indikator på ribonucleotid införlivande, tillåta användning av ribonukleotider som biomarkörer DNA-polymeras aktivitet12,13,14. Detta tillvägagångssätt, med ett mål DNA-sekvens som är angränsande till replikering, effektiv ARS306 ursprung bör vara mottagliga för andra genomisk platser och målgener samt.- PCR-Förstärk en 520-bas par segment av den URA3 reporter gen använder följande primer paret: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) och URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
- Utför PCR-reaktionen med 10-20 ng av jäst genomiskt DNA som mall, 4 μL av varje grundfärg (10 μM lager), 10 μL 10 x Ex Taq buffert (Mg2 + plus), 8 μl av dNTP blandning (2,5 mM varje), 0,5 μL av Ex Taq DNA-polymeras (5 U/μL) , och justera den slutliga volymen till 100 μL med H2O.
- Kör programmet följande PCR: 95 ° C i 5 min; 30 cykler av 95 ° C i 1 min, 55 ° C i 1 min, 72 ° C under 2 min; 72 ° C i 10 min och håll vid 4 ° C.
- Rena PCR-produkten med hjälp av en PCR-rening kit och eluera DNA med 50 mL H2O. Detta kan nu användas som mall i radiolabeling reaktionen.
- Använd följande grundfärger för strand-specifika radiolabeling: Använd URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) för att visualisera DNA som anneals till sonden A. Detta motsvarar den begynnande ledande strand DNA när URA3 är i OR2 och den tnascent som släpar strand DNA när URA3 är i OR1. Använd URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) för att visualisera begynnande DNA som anneals till sonden B. Detta motsvarar den begynnande ledande strand DNA när URA3 är i OR1 och begynnande släpar strand DNA när URA3 är i OR2 (figur 3).
- Utföra radiolabeling reaktionen med 10-20 ng förstärks URA3 fragment som mall DNA, 2 μL av primer (10 μM lager), 5 μL 10 x Ex Taq buffert (Mg2 + plus), 4 μL av 2,5 mM dNTP (minus dCTP), 5 μL (50 μCi) en -32P-dCTP , 0,5 μL av ExTaq DNA-polymeras (5 U/μL) och anpassa den slutliga volymen till 50 μL med H2O. Kör följande program för radiolabeling: 94 ° C i 5 min; 25 cykler av 94 ° C i 1 min, 55 ° C för 30 s, 72 ° C i 1 min. 72 ° C i 5 min och håll vid 4 ° C.
- Använd en G-25 spin kolumn för att avlägsna unincorporated radioaktiva etikett. Innan du lägger till radiomärkt provet, Centrifugera kolumnen för 1 min på 720 x g och Avlägsnafixeringsskruven buffert av pipettering. Ladda radiomärkt reaktionsprodukt och Centrifugera under 2 minuter vid 720 x g till eluera märkt sonden.
- Inkubera vid 95 ° C i 5 min att denaturera sonden omedelbart före hybridisering. Cool kort på is.
- Södra hybridisering
- Rulla fuktade membranet i en hybridisering röret och tillsätt 25 mL nyberedd hybridisering buffert: 0,5 M natrium fosfatbuffert, pH 7,2, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% bovint serumalbumin (BSA). Inkubera vid 65 ° C i 1-2 h med rotation i hybridisering ugn.
- Häll av lösningen försiktigt och tillsätt 25 mL av hybridisering buffert plus radiomärkt sonden. Inkubera vid 65 ° C i 16-18 h med rotation.
- Häll av lösningen i en radioaktivt avfall behållare. Utföra 5 tvättar av 5 min varje vid rumstemperatur med fosfat-SDS tvätt lösning I: 40 mM natriumfosfat buffert, pH 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0.
- Utför 2 tvättar 15 min varje vid 65 ° C med fosfat-SDS tvätt lösning II: 40 mM natrium fosfatbuffert, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.
- Ta bort membranet från hybridisering röret med pincett och placera i en öppnade plastficka beskyddare. Täck och utsätt för en tänkbar plattan. Prova ett antal olika exponeringstider alltifrån 4 h till 4 d.
- Om nödvändigt, remsor och åter sond blot med en annan sond cirka 3 - 4 gånger. För att tömma, inkubera membranet för 2 h vid 65 ° C i 25 mL av en 50% formamid, 2 x SSPE lösning.
Obs: 20 x SSPE stamlösning: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4. - Häll av lösningen i en radioaktivt avfall behållare. Utför 2 tvättar 15 min varje vid 65 ° C i fosfat-SDS tvätt lösning II.
- Kolla membranet med en geigermätare och upprepa stripp protokollet om signalen förblir.
- Utför före hybridisering och hybridisering som beskrivs ovan.
2. att mäta mutationshastighet och specificitet i S. cerevisiae stammar
- Förbereda cellkulturen
- Inokulera en enda koloni (friska jäst celler tar 2-3 dagar vid 30 ° C till formuläret korrekt storlek kolonier) odlas på YPD agar kompletterad med 100 mg/mL adenin i 5 mL YPDA buljong kompletteras med 250 mg/mL adenin (komplettering av adenin är bara nödvändigt om den stam som används är en adenin-auxotroph). Växa i en shaker inkubator eller på en rotator vid 30 ° C tills kulturen når mättnad (36-48 h för en stam utan en kraftig tillväxt defekt).
- Snurra ner cellerna vid ~ 2000 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 5 mL sterilt vatten.
- Att resuspendera cellerna i 500 mL sterilt vatten.
- Utspädning av cellodling och plätering
- För icke-urval kontroller, späd cellerna i en plattan med 96 brunnar med en faktor på 1 600 000 och platta 100 mL av varje kultur på komplett (COM) plåt.
- Markera för ura3 mutanter, tallrik 100 mL outspädd celler på en 5-FOA tallrik för en vildtyp (WT) stam. Späd cellerna med detta om mutationshastighet stam av intresse förväntas vara högre än i en WT stam.
- Att markera för can1 mutanter, späd cellerna 5 gånger och platta 100 mL på en canavanine-innehållande tallrik (CAN) för en WT stam. Utspädningsfaktorn är 0,5.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C tills jäst kolonier form. För stammar utan en tillväxt defekt, 2-3 dagar är normalt tillräcklig för COM och kan tallrikar och 3-5 dagar för 5-FOA plattor. För att jämföra de mutation priserna mellan olika stammar, är det bäst att välja samma dag som tillväxt att räkna kolonier. Förvara plattorna redo att räknas i kylrummet (~ 4 ° C).
- Spontan mutation beräkningsgrund
- Räkna synliga kolonier på varje tallrik och ta anteckningar av kolonin nummer
- Beräkna den mutation med Drakes formel: μ = f ÷ ln (μNt). f är den mutationsfrekvensen beräknas av antal mutanter dividerat med antalet celler i den slutliga kulturen. NT är antalet celler i den slutliga kulturen och μ är mutationshastighet. Denna ekvation kan lösas genom en iterativ metod såsom den Newton-Raphson metoden. Det finns andra estimator metoder, inklusive Lea och Coulson testet, för att beräkna de mutation klassar15.
- Beräkna konfidensintervall antar log normalfördelning av de anseende enskilda isolat. Det 95% konfidensintervallet används oftast.
- Analys av mutation spektrum
- Plocka en enda koloni från varje 5-FOA eller kan platta och uppdatera på en YPDA platta.
- Utföra kolonin PCR att förstärka den URA3 eller CAN1 gen och sekvens för att upptäcka mutationer använder följande grundfärger: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') och URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') för båda PCR-amplifiering och sekvensering av 800 bp URA3 genen; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') och CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') för amplifiering och CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') och CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') för sekvensering av 1800 bp CAN1 reporter genen.
- För att utföra kolonin PCR, Omsuspendera en enda koloni i 5 μL av H2O och Använd 1 μL som mall. Lägg till 1 μL av varje av primers (5 μM lager), 2 μL av 5 x KAPA2G buffert (Mg2 + plus), 0,5 μL av dNTP (2,5 mM), 0,5 μL av KAPA2G snabbt DNA-polymeras, 12 μL av H2O.
- För förstärkning av URA3 gen, kör programmet följande PCR: 95 ° C i 5 min; 5 cykler av 95 ° C för 10 s, 61 ° C för 15 s, 72 ° C under 30 s; 35 cykler av 95 ° C för 10 s, 61 ° C för 15 s, 72 ° C under 30 s; 72 ° C under 2 min och håll vid 4 ° C. För förstärkning av CAN1 genen, kör programmet följande PCR: 95 ° C i 5 min; 5 cykler av 95 ° C för 10 s, 61 ° C för 15 s, 72 ° C för 45 s; 35 cykler av 95 ° C för 10 s, 61 ° C för 15 s, 72 ° C för 45 s; 72 ° C under 2 min och håll vid 4 ° C.
- Justera sekvensering resultaten en referens sekvens med ett program som DNASTAR Seqman Pro eller Sequencher för att identifiera mutationer.
- Kompilera mutationer data genom mutation typ (figur 4) eller mutation läge (figur 5). Beräkna de specifika mutation priserna av frekvensen av en mutation (antalet händelser observerades dividerat med antal mutanter sekvenserade) multiplicerat med den totala mutationshastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling av genomisk DNA med alkali följt av alkaliska gelelektrofores tillåter för halvkvantitativ detektion av de DNA-fragmenteringen på grund av överflödet av stabilt bolagiserade ribonukleotider. Figur 2 visar gel bilder av jäst genomiskt DNA behandlas med eller utan KOH5. Den M644L varianten av Pol2, den katalytiska subuniten av Polε, har minskat möjligheten att införliva ribonukleotider medan M644G mutant innehåller mer ribonukleotider än WT polymerasen. Som anges i protokollet, kan alkaliska gelen vara ytterligare trotsat av strand-specifika Southern blot analys. Med kunskap om de sonderade genomisk plats i förhållande till dess intilliggande ursprung, kan vi selektivt sond ribonukleotider införlivas med den begynnande leder eller släpar kardeler. Figur 3 visar södra blot resultaten sondera URA3 reporter genen in i två motsatta riktningar nära en tidig-bränning replikering ursprung, ARS30616. Med hjälp av ledande strand-specifika prober, observerar vi mönstret DNA-fragmentering orsakas av alkali-klyvning på ribonukleotider i begynnande ledande strand DNA i en WT stam och i stammar uttrycker varianter av polymeraser α, δ och ε som är promiskuös för ribonucleotid införlivande.
Använder en fluktuation experiment, kan vi mäta de mutation priserna av jäststammar som innehåller reporter gener. Figur 4 visar de mutation priserna på URA3 och CAN1 loci stammar uttrycker WT-polymeras eller pol2-M644G mutant med eller utan funktionella RNase H2. Bristen på RNase H2 orsakar en måttlig ökning i övergripande mutation priser i både bakgrunder. Närmare granskning av mutation specificitet avslöjar dock att stammar saknar RNase H2 (figur 5), det finns en stark ökning av mutationshastighet för kort borttagningar, särskilt i tandem upprepa sekvenser. Figur 5A jämför mutation specificitet i WT och rnh201Δ stammar och figur 5B visar mutationsanalys effekten av ytterligare förhöjd ribonucleotid införlivande av begynnande ledande DNA-strängen av Pol ε.
Figur 1: protokoll stegen i strand-detektering av Alkalikänsliga platser orsakas av ribonucleotid införlivande i jäst genomiskt DNA. En översikt av olika stora stegen i den här proceduren börjar med jäst genomisk DNA isolering och fortsätter genom den slutliga Southern blot-analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: en representativ bild av resultat erhållna av alkaliska-agaros gelelektrofores. Denna siffra har anpassats från Nick McElhinny, S. A. o.a. 5. jäst genomiskt DNA från stammar av olika genotyper behandlades med KCl (neutralt) eller KOH (alkaliska) och sedan separeras på ett neutralt eller alkaliskt agarosgel. ”WT” och ”M644G” indikerar status för Pol ε. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Strand-specifika sondering av en alkalisk-agarosgel genom södra blot. Denna siffra har anpassats från Williams, J. S. et al. 13. (A) radiomärkt sonderna glödga till begynnande ledande DNA delen inom den URA3 reporter gen som har infogats nära ARS306 i två motsatta riktningar (OR1 och OR2). (B) representativa resultat av södra blotting använder de begynnande ledande strand-specifika proberna. Visas är sondering resultaten för den begynnande ledande strand i en stam med WT DNA-polymerases, eller den pol1-L868M, pol2-M644G eller den pol3-L612M variant stammar med eller utan RNase H2. POL1, POL2, och POL3 generna kodar katalytisk subenheter av Pols α, ε och δ, respektive. Varianterna är mer promiskuösa för ribonucleotid inkorporering5,12,17. (C) kvantifiering av radioaktiva signalen av bråkdel av det totala antalet i varje lane från (B). Värdena uttrycks som en procentandel av totalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: spontan mutation priser i jäststammar. Denna siffra har anpassats från Nick McElhinny, S. A. o.a. 5. URA3 och CAN1 reporter generna användes i den framåt mutationsanalys för att mäta de mutation priserna av de angivna stammarna. URA3 reporter är i ”orientering 2” (OR2, figur 3A). Det 95% konfidensintervallet (CI) ingår för varje mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Mutation spectra för URA3-OR2 reporter gen. Denna siffra har anpassats från tidigare publikationer5,18,19,20. Vilken position och mutation hos varje oberoende 5-FOA-resistenta koloni som valts i den framåt mutationsanalys skildras 804 bp URA3 kodande sekvens. Bokstäver anger base substitutioner, öppna trianglar anger enda bas borttagningar, slutna trianglar ange enda bas infogningar och heldragna linjer anger kort borttagningar. (A) Mutation spectra i WT och rnh201Δ stammar. Röda etiketter ovanför sekvensen är mutationer hos WT medan blå etiketter nedanför sekvensen är de som observerades i en rnh201Δ stam. (B) Mutation spectra i pol2-M644G och pol2-M644G rnh201Δ stammar. Röda etiketter ovanför sekvensen är mutationer hos pol2-M644G medan blå nedanför sekvensen för pol2-M644G rnh201Δ stammar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi protokollen för två uppsättningar av experiment som ofta används till semi kvantitativt analysera ribonukleotider införlivas under DNA-replikation och mutagena effekter av oreparerade ribonukleotider. Även om dessa strategier innebär den modell Eukaryoter S. cerevisiae, kan dessa tekniker enkelt anpassas till andra mikrober och ännu högre Eukaryoter.
Sondera för oreparerade ribonukleotider i DNA använder alkaliska-agaros elektrofores tillsammans med södra blotting ger viktig information om antalet ribonukleotider närvarande och den strand som de har införlivats. Det är dock viktigt att notera den alkali-känsligheten kan också orsakas av andra DNA-skador, såsom en abasic webbplats. Ett annat sätt upptäcka ribonukleotider i DNA är behandling med renat RNase H2 enzym, som har gjorts i däggdjursceller21. Även om vårt förhållningssätt innebär att sondera för Alkalikänsliga platser i begynnande ledande kontra släpar trådar på URA3 reporter genen används i våra mutationsanalys analys experiment, är det möjligt att utforma de sonder som glödga på andra platser i ordning för att få viktig information angående ribonucleotid densitet vid andra genomisk webbplatser. Den södra blot delen av förfarandet kan också användas som referens för andra generiska DNA sonderar experiment.
Mätning av mutation priser med en fluktuation-testet har använts för analys av olika mutagena händelser i mikroorganismer, och därmed inte är begränsat till analys av mutagena konsekvenserna av ribonukleotider i DNA. För detta experiment, kan öka antalet oberoende kulturer märkbart förbättra noggrannheten i mätningen. Oberoende kolonier kan erhållas genom strimmor en stam av intresse till YPDA medium eller genom analys av oberoende spore kolonier erhålls genom triaden dissekering av en diploida jäst fläck. Idealiskt, användning av flera oberoende haploida jäststammar (t.ex., från triaden dissektion) uppmuntras att minimera effekterna av stam-till-stam variation. Detta är särskilt viktigt när spontan mutation är hög eller när stammen har en tillväxt defekt. Ytterligare en metod som kan användas för att mäta spontan mutation är en mutation ackumulering experimentera22. I denna analys Mutationsfrekvensen bestäms för cellerna efter omfattande tillväxt och kan användas för att beräkna för mutationshastighet. Koppling av en mutation ackumulering experiment med djupsekvensering teknik har visat sig vara ett kraftfullt verktyg att analysera mutationshastighet och specificitet hela genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar av Kunkel Lab för deras arbete och diskussioner relaterade till protokollet och återanvändas data som presenteras här. Detta arbete stöds av projektet Z01 ES065070 till T.A.K. av avdelningen för intern forskning av de National institutionerna of Health (NIH), nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
