Summary
Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.
Abstract
Genomik istikrarsızlık kaynağı olmaya ribonucleotides nükleer DNA'varlığı gösterilmiştir. Ribonucleotide birleşme ölçüde alkali hidroliz tarafından tespit edilebilir ve RNA hidroliz alkali koşullarda son derece duyarlı olduğu gibi Elektroforez jel. Bu, Southern blot analizi ile birlikte yerini belirlemek ve ribonucleotides dahil var haline hangi strand için kullanılabilir. Ancak, bu yordam yalnızca yarı nicel ve strand özgü Southern blot sondalama hassasiyeti artırır, ancak ribonucleotide içeriğinde, küçük değişiklikleri algılamak için duyarlı olmayabilir. En çarpıcı biyolojik sonuçlarından biri DNA'ribonucleotides ölçüsü olarak, kendiliğinden mutagenesis bir ileri mutasyon tahlil kullanılarak analiz edilebilir. Uygun reporter genler kullanarak, işlev kaybına neden olur nadir mutasyonlar seçili ve genel olabilir ve muhabir gen DNA sıralama ile dalgalanma deney verileri birleştirerek belirli mutasyon oranları ölçülebilir. Dalgalanma tahlil çok çeşitli mutajenik işlemlerinde belirli genetik arka plan veya büyüme koşulları incelemek için geçerlidir.
Introduction
Ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında ribonucleotides tüm üç büyük DNA replicases, DNA polimerazlar (siyaset bilimi) α, ε ve δ1,2tarafından genom dahil edilmiştir. RNase H2-bağımlı ribonucleotide eksizyon tamir (RER3) Bu katıştırılmış ribonucleotides çoğunluğu kaldırır.
2' hidroksil grubu şeker yan 2' - 3' döngüsel fosfat ve diğer 5'-OH4ile bir ucu serbest bitişik fosfodiester bağı saldırabilir gibi DNA'ribonucleotide hidroliz için açıktır. Alkali koşullar büyük ölçüde bu reaksiyon hızlandırabilir. Böylece, temel bir çözümde kuluçka sırasında katıştırılmış ribonucleotides hidroliz özel alkalin Elektroforez5tarafından görüntülenmiştir genomik DNA'ın parçalanma neden olur. Bu DNA'yı bir membran transfer ve doğmakta olan lider - veya ahşap kaplama-strand içine DNA dahil ribonucleotides neden alkali duyarlı sitelerin kimlik izin strand özgü probları Southern blot Analizi tarafından probed, anılan sıraya göre.
Ne zaman topoizomeraz ı (Top1) katıştırılmış ribonucleotide6,7' de DNA nicks RNase H2 etkinlik eksik Maya hücrelerinde ribonucleotides kaldırılması başlatılabilir. Top1 3' tarafında ribonucleotide cleaves, ancak, bu 5'-OH ve religation için ateşe dayanıklı 2' - 3' döngüsel fosfat DNA uçları oluşturur. Hata onarım veya bu 'kirli biter' anormal işlenmesi için genomik istikrarsızlık neden olabilir. Ayrıca, tekrar bir DNA dizisi içinde belgili tanımlık kesme ortaya çıkarsa, onarma işleminin silme mutasyonlar için yol açabilir. Bu özellikle sorunlu tandem tekrarlar için olduğunu, nerede silme işlemlerini kısa (, beş ve iki baz çifti arasındaki) RNase H2-eksik hücrelerinde yaygın olarak gözlenmektedir. Top1 bağımlı zararlı etkileri Maya RNase etkinlik şiddetlenir DNA polimeraz ε mutant (pol2-M644G) ribonucleotide birleşme sırasında doğmakta olan önde gelen strand sentezi için karışık içinde H2 yokluğunda.
DNA'ribonucleotides işlenmesi için spontan mutasyonlar neden olur ve bu mutagenesis uygun reporter genler kullanarak ve beraberindeki fenotipik değişiklik için seçildiğinde tespit edilebilir. Bir dalgalanma test veya Luria ve Delbrück deney seçilebilir reporter genler8,9kullanarak spontan mutasyon oranları ölçmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Maya, URA3 ve CAN1 genler gen fonksiyon kaybına neden tüm mutasyon tipleri tespiti için sağlar bir ileri mutasyon tahlil gazetecilere olarak kullanılabilir. Spontan mutasyon oranı hedef muhabir gen mutasyonlar olmadan tek kolonilerden başladı birden çok paralel kültürü için gözlenen ortancası olarak tahmin edilmektedir. Bir Maya RNase H2-eksik soy rnh201Δ büyük ölçüde 2-5 bp silme tandem yükseltilmiş bir insidansı neden olur orta derecede yüksek bir genel olarak spontan mutasyon oranı gibi dizileri yineleyin. Böylece, tamamen ribonucleotides genom içinde mutajenik etkileri karakterize için belirli mutasyon oranları tespit gerekir. Bu durumda, URA3 veya CAN1 muhabir genleri güçlendirilmiş ve türleri ve mutasyonlar yerlerini belirlemek için sıralı ve belirli mutasyon oranları hesaplanabilir. Birden çok bağımsız URA3 veya CAN1 mutantlar tanımlanan mutasyonlar derleme daha sonra bir mutasyon spektrum oluşturmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. alkali hidroliz ve Strand özgü Southern Blot (Şekil 1)
- Hücre büyümesi ve genomik DNA izolasyon
- Bir Maya DNA arıtma kit üreticinin talimatları kullanarak Maya genomik DNA izole et. Üstel büyüme (0,5 bir optik yoğunluk) ile 1 arasında aşamasında olan kültürler kullanın. Son DNA Pelet 35 ml 1 x TE arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) resuspend.
- DNA'yı 5 mg/mL RNase A 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- 3 M sodyum asetat (pH 5.2) 0.1 birimleri kullanma DNA çökelti ve %2.5 100 etanol için buz üzerinde 20 dk hacimleri.
- 4 ° C'de 20 dk için 16.000 x g, santrifüj Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.
- Pelet iki kez 500 mL % 70 etanol ile yıkayın. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.
- Pelet bankta kuru ve 35 ml 1 x TE arabellek resuspend.
- Bir fluorimeter (Malzeme tablo) dsDNA BR tahlil kiti ile kullanarak DNA quantitate.
- DNA 5 mg 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve 2.5 birimleri %100 0.1 birimleri kullanma her örnekten çökelti alkol için 200 mL toplam hacmi (H2O tarafsız jel denetim gerekli ise DNA'ın gerekli, ek 5 mg gerekirse ekleyin). 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
- 4 ° C'de 20 dk için 16.000 x g, santrifüj Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.
- Pelet bankta kuru. DNA 14 mL H2O. resuspend
- Alkalin hidroliz ve jel elektroforez
- 1 M KOH 6 mL ekleyin ve 55 ° c 2 h için kuluçkaya.
- Örnekleri 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
- 6 x alkalin DNA yükleme arabellek 4 mL ekleyin: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, % 18 polysucrose (Malzeme tablo), % 0.15 bromocresol yeşil ve % 0.25 ksilen cyanol FF.
- % 1'özel, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0 oluşan bir alkali jel döküm. DNA örneği için 24 mL lane yüklenmesine olanak sağlar bir tarak kullanın.
- 1 x alkalin Elektroforez arabellek içinde oda sıcaklığında jel çalıştırın: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Uygun bir DNA boyutu işaretleyici içerir.
- Kısaca tüpler spin ve tüm 24 mL örnek Alkalin özel jel yükleyin. 30 V, 18-20 h tarafından 10 V izleyen 30 dk için electrophorese.
- 45 dk her nazik ajitasyon nötralizasyon tampon ı: 1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl ile Oda sıcaklığında 2 incubations için jel etkisiz hale getirin.
- DNA'yı etkisiz jel 200 mL su 1/10.000 seyreltme nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 2 h için SYBR altın leke, içeren ıslatarak leke.
- UV transilluminator kullanarak DNA görselleştirin. Alkali duyarlılık arttı DNA5düzeltilmemiş ribonucleotides daha yüksek yoğunluğu gösteren daha küçük DNA parçalarının görünümünü neden olur.
- Güney transfer
- DNA alkalin jel kılcal eylem10tarafından pozitif yüklü naylon membran için transfer. Nasıl bu transfer ayarlanabilir bir örnek Sambrook ve Russell'ın el ile10içinde sağlanır.
- Alkali aktarım arabellek içinde oda sıcaklığında 15dk için alkali jel emmek: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.
- (Jel boyutuna kesme) naylon membran kısaca su ile ıslak ve daha sonra 5 dakika içinde alkalin aktarım arabellek için emmek.
- Aktarım platformu 3 cam şişeler (100 mL) ters çevirme yemek pişirme bir cam ayarlayın. Bu yemek biraz özel jel boyutundan daha büyük olmalıdır. Bir cam levha onları üst üzerinde ayarlayın.
- 3 MM CHR Kromatografi kağıt (jel artı kenarları üzerinde arabellek göle asmak uzun taraf genişliğini boyutuna kesme) 2 büyük parçaları üzerinde cam levha asmak.
- Alkali aktarım arabellek Kromatografi kağıt ve yarım dolgu cam tabak üzerine dökün. 5 mL Cam Pipet kullanarak kabarcıklar dışarı pürüzsüz.
- Üzerine tekrar kabarcıklar yumuşatma, özel jel yerleştirin. Jel parafilm ile tüm kenarlarını çevreleyen. Alkali aktarım arabellek az miktarda jel üzerine dökün.
- Öncesi naylon membran jel üstüne yerleştirin. Baloncuklar dışarı pürüzsüz.
- Kağıt ıslak 2 adet özel jel boyutuna kesme. Onları membran üstüne yerleştirin ve herhangi bir kabarcıklar pürüzsüz.
- Büyük bir yığın kağıt havlu (kesim özel jel biraz daha büyük bir boyuta) aktarım sandviç üstüne yerleştirin. Dikkatle kağıt havlu üzerine bir cam plaka yer. Üst (bir kitle 400 g çalışır kitapla) ağırlıklı bir nesne ekleyin.
- Gecede oda sıcaklığında devam transfer izin.
- Dikkatli bir şekilde transfer yığın ayrı almak ve nötralizasyon arabellek II oda sıcaklığında membran 15dk için emmek: 0,5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.
- Crosslink UV crosslinker kullanarak şarj edilmiş naylon membran için DNA. Membran cross-linker ve autocrosslink ayarını kullanın.
- Güney soruşturma hazırlık
Not: bir protokol tabanlı doğmakta olan lider-ahşap kaplama iplikçikli DNA iplikçiğinin karşı alkali duyarlı siteleri bulmak için burada açıklanan yaklaşım daha önce11yayınlandı. Deneyimiz için sondalama adlı bir iki yönler (OR1 veya OR2) kromozom III (Şekil 3A) ARS306 çoğaltma köken bitişik eklenen URA3 muhabir gen gerçekleştirdi. Alkali duyarlı siteleri Maya genomik DNA'varlığı ribonucleotide birleşme, DNA polimeraz etkinlik12,13,14biyolojik ribonucleotides kullanımına izin veren bir göstergesidir. Bu yaklaşım, bir hedef DNA dizisi çoğaltma, verimli ARS306 kökeni bitişik kullanarak diğer genomik mekanlar ve hedef genlerin de mükellef olmalıdır.- PCR-yükseltmek 520-baz çifti kesimi aşağıdaki astar çiftini kullanarak URA3 muhabir gen: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) ve URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
- 10-20 ng bir şablon olarak Maya genomik DNA'ın, her astar (10 μm kalınlığında hisse senedi) 10 x Taq arabellek Ex (Mg2 + artı işareti), 8 μL dNTP karışımı (2.5 mM her), 0,5 μL in Ex Taq DNA polimeraz 10 μL 4 μL kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirmek (5 U/μL) ve H2o 100 μL için son ses seviyesini
- Aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 30 döngüleri 95 ° c için 1 dakika, 55 ° C için 1 dakika, 2 dk 72 ° C; 10 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
- PCR arıtma seti kullanarak PCR ürünü arındırmak ve 50 mL H2O. kullanarak DNA elute Bu şimdi radiolabeling tepki olarak şablon olarak kullanılabilir.
- Strand özel radiolabeling için aşağıdaki astar kullanın: sonda A. anneals DNA görüntülenmesi için kullanım URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) URA3 OR2 ve URA3 OR1 içinde olduğunda iplikçik DNA kalmış tnascent olduğunda bu da doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA karşılık gelir. URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) prob B. anneals doğmakta olan DNA görüntülenmesi için kullanın URA3 OR2 içinde olduğunda OR1 ve doğmakta olan ahşap kaplama iplikçik DNA URA3 olduğunda bu da doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA karşılık gelir (Şekil 3).
- Şablon DNA, astar (10 μm kalınlığında hisse senedi), 10 x Taq arabellek (Mg2 + artı) Ex 5 μL, 2.5 mM dNTPs (dCTP), eksi 4 μL 2 μL olarak 10-20 ng güçlendirilmiş URA3 parçası kullanarak radiolabeling reaksiyonu gerçekleştirmek 5 μL (50 μCi) bir -32P-dCTP , 0.5 μL ExTaq DNA polimeraz (5 U/μL) ve H2O. Çalıştır aşağıdaki programı radiolabeling için 50 μL için son ses seviyesini: 94 ° C 5 dakika; 94 ° C 25 döngüleri için 1 dakika, 55 ° C 30 s, 72 ° C için 1 dk; 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
- Bir G-25 spin sütun unincorporated radyoaktif etiketi kaldırmak için kullanın. Radiolabeled örnek eklemeden önce 1dk 720 x g ve MemberForm'un arabellek adlı için sütun pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Radiolabeled reaksiyon ürünü ve etiketli sonda elute 720 x g de 2 dk santrifüj yük.
- Hibridizasyon hemen önce sonda denatüre 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya. Serin kısa bir süre buz.
- Güney hibridizasyon
- Islak membran hibridizasyon tüp içine rulo ve taze hazırlanmış hibridizasyon arabellek 25 mL ekleyin: 0,5 M sodyum fosfat tampon, pH 7.2, % 7 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), %1 sığır serum albumin (BSA). 65 ° c 1-2 h döndürme hibridizasyon fırında için kuluçkaya.
- Dikkatle solüsyonu dökün ve hibridizasyon arabellek artı radiolabelled sonda 25 mL ekleyin. 16-18 h döndürme için 65 ° C'de kuluçkaya.
- Çözüm bir radyoaktif atık konteyner içine dökün. 5 dk her olarak fosfat-SDS yıkama çözüm ı: 40 mM sodyum fosfat tampon, pH 7.2, oda sıcaklığında 5 yıkama gerçekleştirmek %5 SDS, % 0.5 BSA, 1 mM EDTA, pH 8.0.
- 15 dk her fosfat-SDS yıkama çözüm II ile 65 ° C'de 2 yıkama gerçekleştirmek: 40 mM sodyum fosfat tampon, pH 7.2, % 1 SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.
- Membran Cımbız kullanarak hibridizasyon tüpünden çıkarın ve bir açılan plastik kol koruyucusu yerleştirin. Kapak ve bir görüntüleme plakasına bulaşmasına neden. 4 h 4 d arasında değişen kez farklı pozlama bir dizi deneyin.
- Gerekirse, şerit ve yaklaşık 3 - 4 kez farklı bir sonda kullanarak leke yeniden sonda. Şerit için 2 h 65 ° c 25 ml % 50 formamide, 2 x SSPE çözüm için membran kuluçkaya.
Not: 20 x SSPE hisse senedi çözüm: 3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7.4. - Çözüm bir radyoaktif atık konteyner içine dökün. 15 dk her 65 ° C'de 2 yıkama fosfat-SDS yıkama çözüm II içinde gerçekleştirin.
- Bir Gayger sayacı ile membran kontrol ve sinyal kalırsa sıyırma Protokolü tekrarlayın.
- Öncesi hibridizasyon ve hibridizasyon yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
2. ölçme mutasyon oranı ve özgüllük S. cerevisiae suşları
- Hücre kültürü hazırlamak
- YPD agar 5 mL 250 mg/mL adenin (adenin takviyesi sadece gerekli ise takıma YPDA suyu içine 100 mg/mL adenin ile desteklenmiş olarak yetiştirilen bir koloni (sağlıklı Maya hücreleri alır 2-3 gün 30 ° c ile formu uygun boyutlu kolonileri) aşılamak kullanılan yük olduğunu bir adenin auxotroph). Doygunluk (36-48 h ciddi büyüme kusur olmadan büyük bir yük için) kültür ulaşıncaya kadar bir shaker kuluçka veya bir rotator 30 ° C üzerinde büyür.
- Spin aşağı hücreleri ~ 2000 x g 5 min için de.
- Süpernatant atın ve hücreleri 5 mL steril su ile yıkayın.
- 500 mL steril su hücrelerde resuspend.
- Seyreltme hücre kültür ve kaplama
- Sigara seçim denetimleri için 96-şey plaka hücrelerde 1.600.000 ve plaka her kültür tam (COM) plaka üzerine 100 mL faktör tarafından oranında seyreltin.
- Ura3 mutantlar için seçmek için bir vahşi-tipi (WT) yük için 5-FOA levha üzerine su katılmamış hücrelerinin 100 mL plaka. Mutasyon oranı faiz baskı bir WT yük daha yüksek olması bekleniyor Eğer hücreleri buna göre oranında seyreltin.
- Can1 mutantlar için seçmek için hücreleri 5-fold sulandırmak ve canavanine içeren için bir tabak (CAN) bir WT yük üzerine 100 mL plakası. 0,5 seyreltme faktörüdür.
- 30 ° C'de tabak mantar kolonileri formu kadar kuluçkaya. Suşları bir büyüme kusur olmadan için 2-3 gün COM için genellikle yeterli olur ve plakaları ve 3-5 gün 5-FOA plakaları için olabilir. Mutasyon oranları farklı suşları arasında karşılaştırmak için aynı gün büyüme kolonileri saymak için seçmek en iyisidir. Soğuk Oda (~ 4 ° C) sayılacak hazır plakaları saklayın.
- Spontan mutasyon oranı hesaplama
- Her plaka üzerinde görünür kolonileri saymak ve koloni sayıların notlar almak
- Drake'in formülü kullanarak mutasyon oranı hesaplamak: μ = f ÷ ln (μNt). f son kültür hücre sayısı bölü mutantlar sayısına göre hesaplanan mutasyon sıklığıdır. NT son kültür hücre sayısı ve μ mutasyon oranı. Bu denklem Newton-Raphson yöntemi gibi yinelemeli bir yöntem tarafından çözülebilir. Mutasyon oranı15hesaplamak için Lea ve Coulson testi de dahil olmak üzere diğer Tahmincisi yöntemleri de vardır.
- Güven aralığı varsayarak günlük normal dağılım bireysel yalıtır utation oranları hesaplamak. % 95 güven aralığı en sık kullanılır.
- Mutasyon spektrum analizi
- Plaka veya bir koloni her 5 FOA üzerinden almak ve yenileme YPDA tabağa.
- Koloni URA3 veya CAN1 gen ve sıralaması aşağıdaki primerler kullanılarak mutasyonlar algılamak için yükseltmek için PCR gerçekleştirmek: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') ve URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') için her iki PCR güçlendirme ve 800 bp URA3 gen sıralama; Can1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') ve CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') amplifikasyon ve CAN1-AR için (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') ve CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1 muhabir gen sıralama için.
- Koloni PCR gerçekleştirmek için bir koloni içinde 5 μL H2O resuspend ve 1 μL şablon olarak kullanın. Eklemek her birinin astar (5 mikron hisse senedi) 5 x KAPA2G arabelleği (Mg2 + artı) 2 μL 1 μL, 0.5 μL dNTP (2.5 mM), 0,5 μL, KAPA2G hızlı DNA polimeraz, H2o 12 μL
- URA3 gen amplifikasyon için aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 5 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 30 72 ° C s; 35 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 30 72 ° C s; 2 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C CAN1 gen amplifikasyon için aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 5 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 45 72 ° C s; 35 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 45 72 ° C s; 2 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
- Mutasyonlar tanımlamak için DNASTAR Seqman Pro veya Sequencher gibi bir program kullanarak bir başvuru sırası sıralama sonuçları hizalayın.
- Mutasyon türü (Şekil 4) veya mutasyon konumu (Şekil 5) göre mutasyonlar veri derlemek. (Gözlenen olayları sıralı mutantlar numarasına göre bölünmüş) bir mutasyon sıklığına göre belirli mutasyon oranları genel mutasyon oranı ile çarpımı hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tedavi ile alkali jel elektroforez tarafından takip alkali genomik DNA'ın DNA fragmantasyonu stabil anonim ribonucleotides çokluğu nedeniyle yarı kantitatif algılanması için izin verir. Şekil 2 genomik DNA veya KOH5olmadan tedavi Maya jel görüntüleri gösterir. Pol2, Polε, katalitik alt M644L türevi M644G mutant WT polimeraz daha daha fazla ribonucleotides içerir iken ribonucleotides dahil yeteneği azalttı. İletişim kuralındaki detaylı olarak alkali jel daha fazla strand özgü Southern blot analizi ile probed. Problu genomik siteye bitişik kökeni göre konumunu bilgi ile biz seçmeli olarak doğmakta olan dahil ribonucleotides yoklama başında veya sonunda iplikçikleri gerisinde kalmış. Şekil 3 bir erken ateş çoğaltma kökeni, ARS30616yakın iki zıt yönelimleri takılı URA3 muhabir gen sondalama Southern blot sonuçlarını gösterir. Strand özgü probları önde gelen kullanarak, biz DNA parçalanma desen alkali-bölünme doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA WT zorlanma ve suşları için promiscuous vardır polimerazlar α, δ ve ε türevleri ifade ribonucleotides, neden gözlemlemek ribonucleotide birleşme.
Bir dalgalanma deney kullanarak, muhabir genleri içeren maya suşları mutasyon oranları ölçebilirsiniz. Şekil 4 mutasyon oranları URA3 ve CAN1 loci suşlarının WT polimeraz veya pol2-M644G mutant veya fonksiyonel RNase H2 olmadan ifade gösterir. RNase H2 eksikliği ılımlı bir artış genel mutasyon oranları her iki arka planlar içinde neden olur. Ancak, içinde suşları RNase H2 eksik mutasyon özgüllüğü daha yakından incelendiğinde ortaya koymaktadır (Şekil 5), mutasyon oranı özellikle de tandem tekrar dizileri kısa silme işlemleri için güçlü bir artış yoktur. 5A rakam karşılaştırır WT ve rnh201Δ suşları mutasyon özgüllük ve Şekil 5B görüntüler daha da yüksek ribonucleotide birleşme doğmakta olan önde gelen DNA zinciri içine mutational etkisi Pol tarafından ε.
Şekil 1: protokol strand özgü algılama içine Maya genomik DNA ribonucleotide birleşme nedeniyle alkali duyarlı sitelerin katılan adımlar. Bu yordam, Maya genomik DNA izolasyon ile başlayan ve son Southern blot analizi ile devam katılan çeşitli büyük adımlar genel bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sonuçları temsilcisi bir görüntüsünü elde edilen özel alkalin jel elektroforez ile. Bu rakam Nick McElhinny, S. A. vd adapte 5. farklı genotip suşları Maya genomik DNA KCl (nötr) veya KOH (alkali) ile tedavi ve bir nötr veya alkali özel jel ayrılmış. "Ne" ve "M644G" Pol durumunu gösterir ε. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Strand özgü bir özel alkalin jöleyi Southern blot tarafından sondalama. Bu rakam üzerinden adapte edilmiş Williams, J. S. vd. 13. (A) radiolabeled sondalar tavlamak için ARS306 yakın iki zıt yönler (OR1 ve OR2) eklenen URA3 muhabir gen içinde doğmakta olan önde gelen DNA dizisi. (B) doğmakta olan önde gelen strand özgü problar kullanarak Southern Blot temsilcisi sonuçları. Görüntülenen problama bir gerilme WT DNA polimeraz, ya da pol1-L868M, pol2-M644G veya pol3-L612M ile doğmakta olan önde gelen iplikçik için varyant suşları ile ya da ezelî RNase H2 sonuçlarıdır. POL1, POL2 ve POL3 genler Pols α, ε ve δ, katalitik alt birimleri sırasıyla kodlamak. Değişik ribonucleotide birleşme5,12,17için daha promiscuous vardır. (C) miktar (b) her şeritte toplam kısmını tarafından radyoaktif sinyal. Değerleri toplamının bir yüzdesi ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: spontan mutasyon oranları maya suşları. Bu rakam Nick McElhinny, S. A. vd adapte 5. URA3 ile CAN1 muhabir gen ileri mutasyon assay olarak belirtilen suşları mutasyon oranları ölçmek için kullanıldı. URA3 muhabir olduğunu "yönde 2" (OR2, Şekil 3A). Her ölçüm için % 95 güven aralığı (CI) bulunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: URA3-OR2 muhabir gen mutasyon spectra. Bu rakam önceki yayınları5,18,19,20uyarlanmıştır. Her bağımsız 5 FOA dayanıklı koloni ileri mutasyon assay olarak seçilen gözlenen konumu ve mutasyon türü 804 içinde tasvir bp URA3 kodlama dizisi. Harfler gösterir Bankası oyuncu değişikliği, açık üçgen gösterir tek temel silme, kapalı üçgenler belirtir tek temel eklemeleri ve düz çizgiler kısa silme işlemleri gösterir. (A) mutasyon spectra WT ve rnh201Δ suşları içinde. Kırmızı üzerinde sıra sıra aşağıda mavi etiket o bir rnh201Δ zorlanma gözlenen iken WT içinde gözlenen mutasyon etiketleridir. (B) mutasyon spectra pol2-M644G ve pol2-M644G rnh201Δ suşları içinde. Kırmızı sıra yukarıda pol2-M644G mavi pol2-M644G rnh201Δ suşları için sıra aşağıda sırasında gözlenen mutasyon etiketleridir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, DNA ikileşmesi ve düzeltilmemiş ribonucleotides mutajenik etkileri sırasında dahil ribonucleotides yarı kantitatif analiz için sık sık kullanılır deneyler iki kümesi protokollerde açıklayın. Bu yaklaşımlar modeli ökaryot S. cerevisiaeiçeren rağmen bu teknikleri diğer mikroplar ve daha yüksek Ökaryotlar kolayca adapte edilebilir.
DNA'daki özel alkalin Elektroforez Southern Blot ile birleştiğinde kullanarak düzeltilmemiş ribonucleotides için yoklama ribonucleotides mevcut sayısı ve içine onlar dahil edilmiş strand ilgili önemli bilgiler sağlar. Ancak, bu alkali-hassasiyet de abasic bir site gibi diğer DNA lezyonlar neden olabilir unutmamak gerekir. Ribonucleotides DNA'sı tespit başka bir araç tarafından arıtılmış RNase H2 enzim, tedaviyle memeli hücreleri21' yaptığı gibi 's. Her ne kadar bizim yaklaşım iplikçikleri bizim mutational analiz deneylerde kullanılan URA3 muhabir gen, ahşap kaplama karşı doğmakta olan lider alkali duyarlı siteler için sondalama içerir, sırayla diğer yerlerde de TAV sondalar tasarım mümkündür ribonucleotide yoğunluğu genomik diğer sitelerdeki ilgili önemli bilgiler elde etmek için. Prosedürün Southern blot kısmı diğer genel DNA problama deneyler için de başvuru olarak kullanılabilir.
Ölçüm kullanarak bir dalgalanma test mutasyon oranları yaygın mikroorganizmaların çeşitli mutajenik etkinliklere analizi için kullanılan ve böylece DNA'ribonucleotides mutajenik sonuçlarını analiz için sınırlı değildir. Bu deneme için bağımsız kültürler artırıldığında ölçüm doğruluğunu büyük ölçüde geliştirebilirsiniz. Bağımsız koloniler YPDA bir ortama ilgi büyük bir yük çizgiler veya diploit Maya leke dörtlü diseksiyon tarafından elde edilen bağımsız spor kolonileri analizini elde edilebilir. İdeal olarak, birden çok bağımsız haploit maya suşları kullanımı (Örn., dörtlü diseksiyon üzerinden) zorlanma zorlanma varyasyon etkisini en aza indirmek için teşvik edilmektedir. Spontan mutasyon oranı yüksek olduğunda ya da zorlanma bir büyüme kusur varsa bu özellikle önemlidir. Spontan ölçmek için kullanılan ek bir yöntem bir mutasyon birikimi deneme22mutasyon oranı var. Bu analizde, mutasyon sıklığı ve mutasyon oranı için hesaplamak için kullanılan hücreler için geniş büyüme sonra belirlenir. Kaplin derin sıralama teknolojisi ile bir mutasyon birikimi denemenin mutasyon oranı ve özgüllük genom analiz etmek için güçlü bir araç olarak kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Tüm mevcut ve eski Kunkel laboratuvar Üyeler kendi çalışmaları için teşekkür ediyoruz ve tartışmaları ile ilgili protokolü için ve burada sunulan verileri yeniden. Bu eser proje Z01 ES065070 tarafından bölümü, Intramural araştırma--dan Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) Enstitüleri T.A.K. için destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YPD media | 20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave. | ||
| COM plates | 1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate. | ||
| CAN plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution. | ||
| 5-FOA plates | 1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution. | ||
| L-Canavanine sulfate | US Biological | C1050 | |
| 5-FOA | US Biological | F5050 | |
| 20 mL glass culture tube | Any brand | ||
| Culture rotator in 30 °C incubator | Shaker incubator can be used instead | ||
| 96 well round bottom plates | Sterile, any brand | ||
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Autoclave before use |
| 12-channel pipettes | Any brand | ||
| Ex Taq DNA Polymerase | TaKaRa | RR001 | |
| Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit | Epicenter | MPY80200 | |
| 3 M sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| 100% ethanol | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | Newer model available |
| dsDNA BR Assay kit | Invitrogen | Q32850 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Ficoll 400 | Dot Scientific Inc. | DSF10400 | |
| Bromocresol green | Eastman | 6356 | |
| Xylene cyanol FF | International Technologies Inc. | 72120 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | Teknova | T5080 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | |
| UV transilluminator | |||
| Amersham Nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN303B | |
| 3 MM CHR Chromotography paper | Whatman | 3030-392 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| G-25 spin column | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| 1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2) | Sigma-Aldrich | NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390) |
|
| SDS | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| Geiger counter |
References
- Joyce, C. M. Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair. Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).
- Li, Y., Breaker, R. R. Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group. Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).
- Nick McElhinny, S. A., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).
- Williams, J. S., Kunkel, T. A. Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences. DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).
- Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis. Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol. Mutat Research. 781, 7-13 (2015).
- Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved. PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors. Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).
- Williams, J. S., et al. Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA. Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).
- Williams, J. S., et al. Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).
- Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta. Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).
- Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}. Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).
- Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon. DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).
- Lujan, S. A., et al. Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity. PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).
- Reijns, M. A., et al. Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development. Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).
- Lujan, S. A., et al. Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition. Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).
